III.

METODE PRAKTIKUM

A. Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Kamis, tanggal 23 November

2017 pukul 13.00 WITA sampai selesai, bertempat di Laboratorium

Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam, Universitas Halu Oleo, Kendari.

B. Bahan Praktikum

Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah 20 sekuen dari

spesies Nitrosomonas, Nitrobacter, Nitrospira, Nitrosococcus dan

Pseudomonas. Sekuen ini digunakan sebagai objek yang akan dianalisis

hubungan kekerabatannya berdasarkan pendekatan molekuler.

C. Alat Praktikum

Alat yang digunakan pada praktikum ini tercantum pada Tabel 1.

Tabel 1. Alat dan kegunaan

No Nama Alat Kegunaan
1. Alat tulis Untuk menuliskan hasil pengamatan
2. Aplikasi Clustalx Untuk menganalisis dan alignment sekuen
bakteri
3. Aplikasi Treeview Untuk mengkontruksikan data sekuen ke dalam
bentuk pohon filogeni dan dendogram
4. Aplikasi Phydit Untuk menganalisis nilai similaritas antar
spesies bakteri uji
5. Aplikasi Notepad Untuk menyimpan data sekuen nukleotida dari
atau PFE LPSN
6. Aplikasi Paint Shop Untuk mengedit pohon filogeni
Pro
C. Prosedur Kerja

Prosedur kerja yang dilakukan pada praktikum ini adalah sebagai

berikut:

1. Koleksi Data Sekuen Nukleotida

Koleksi data sekuen nukleotida dilakukan dengan menentukan

Operational Taxonomical Units (OTU) yaitu 20 strain bakteri dari spesies

Nitrosomonas, Nitrobacter, Nitrospira, Nitrosococcus dan Pseudomonas

pada LPSN (List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature).

Setelah itu, data sekuen yang telah diperoleh disimpan di Notepad

 atau dalam bentuk fasta format dengan menggunakan aplikasi PFE.

2. Sequencing Aligment

Data sekuen yang telah disimpan selanjutnya di sejajarkan atau

(Sequencing Aligment) dengan menggunakan program Clustalx dengan

langkah-langkah sebagai berikut:

a. Membuka aplikasi Clustalx yang tersimpan di Local Disk C.

b. Setelah itu muncul tampilan sebagai berikut.

c. Pilih File, Load Sequences dan pilih file Notepad yang berisi sekuen

nukleotida spesies Nitrosomonas, Nitrobacter, Nitrospira,

Nitrosococcus dan Pseudomonas

klik Open sehingga muncul tampilan berikut.

d. Selanjutnya untuk memasukkan sekuen nukleotida spesies lainnya,

pilih Append Sequences

 pilih sekuen spesies lainnya dan klik Open.

e. Pilih Alignment dan pilih output format options,

lalu klik atau beri tanda centang seperti gambar berikut.

f. Selanjutnya pilih Do Complate Aligment

Sebelum memilih ALIGN terlebih dahulu mengganti nama seperti

pada gambar.

pilih ALIGN pada tampilan berikut dan tunggu hingga proses selesai.

g. Setelah proses penyejajaran sekuen selesai akan muncul tampilan

berikut.
 h. Selanjutnya pilih menu Trees dan pilih Bootsrap N-J Tree,

lalu pilih Ok pada tampilan berikut.

3. Konstruksi Phylogeny Tree

Sekuen DNA 16S rRNA yang telah disejajarkan dan disimpan

dalam 3 format yaitu phb, phy dan gde. Format penyimpanan tersebut

berguna untuk digunakan pada aplikasi selanjutnya untuk membuat pohon

filogeni dan penentuan nilai similaritas. Pohon filogeni divisualisasikan

dengan menggunakan aplikasi Treeview dengan langkah-langkah sebagai

berikut:

a. Membuka aplikasi Treeview yang tersimpan di Local Disk C.

b. Setelah itu muncul tampilan berikut

c. Pilih menu File -> Open, lalu pili All files pada bagian File of type.

Kemudian cari file sebelumnya yang tersimpan dalam format phb lalu

klik Open seperti gambar berikut.

d. Setelah itu muncul tampilan berikut.

e. Selanjutnya pilih menu Tree dan klik Rectangular cladogram

 sehingga tampilan berubah seperti gambar berikut.

f. Pilih kembali menu Tree dan klik Show Internal Edge Labels

Selanjutkan akan muncul nilai bootstrap.

 g. Selanjutnya pilih menu File -> Save as graphic... untuk menyimpan

dan untuk mengeditnya di Paint Shop Pro.

4. Nilai Similaritas

Nilai similaritas dan perbedaan jumlah nukleotida gen 16 S rRNA

antar spesies bakteri Nitrosomonas, Nitrobacter, Nitrospira, Nitrosococcus

dan Pseudomonas ditentukan dengan program Phydit dengan langkah-

langkah berikut.

a. Membuka aplikasi Phydit yang tersimpan di Local Disk C.

Sehingga muncul tampilan.

b. Selanjutnya pilih menu File -> Open, lalu pili All files pada bagian

File of type. Kemudian cari file sebelumnya yang tersimpan dalam

format gde lalu klik Open seperti gambar berikut.

Setelah itu muncul tampilan berikut.

c. Pilih menu Data-> Import-> GDE (NT Replace).

Kemudian cari file sebelumnya lagi yang tersimpan dalam format gde

lalu klik Open

 hingga muncul tampilan berikut dan klik OK.

d. Setelah itu muncul tampilan berikut.

e. Pilih menu Analysis, dan klik Sim Table: Generating Similaryty Table,

lalu klik OK untuk setiap tampilan berikut.

 f. Setelah itu akan muncul tampilan berikut.

g. Blok tampilan pada Notepad dan Copy-Paste pada Excel. Lalu klik

Save.

5. Pengeditan Pohon Filogenetik

Hasil konstruksi pohon filogeni yang diperoleh diedit dengan

menggunakan program Paint Shop Pro dengan langkah-langkah sebagai

berikut:

a. Membuka aplikasi Paint Shop Pro.

b. Pilih file → open dan buka file dendogram yang telah di save

sebelumnya.

Muncul kotak dialog dan isi width in pixels dengan angka 1000 dan

height in pixels dengan angka 548 lalu pilih OK.

c. Klik selection yang bertanda dan arahkan pada dendogram yang

bertuliskan nama spesies mikroba yang dianalisis. Blok semua nama

spesies dan tekan tombol delete.

d. Setelah itu, klik text yang bertanda dan arahkan pada bagian nama

spesies yang telah dihapus sebelumnya. Sehingga muncul kotak dialog

sebagai berikut.

e. Masukkan teks pada kolom enter text here sesuai dengan nama spesies

yang tercantum pada dendogram sebelumnya. Ukuran huruf dan gaya

tulisan disesuaikan. Lalu pilih OK. Demikian seterusnya sampai nama

spesies dan persentase similaritas diisi. Setelah itu, pilih file → Save as

→ ganti nama file dan Save as type dengan JPEG –JFIF Compliant,

lalu klik Save.