LAPORAN PRAKTIKUM DNA REKOMBINAN

Nama : Maulana Wildan Seputra

NIM : 196070122011002

Program Studi : S2 Biomedik Kelas Dual Degree

1. LATAR BELAKANG

Salah satu pendekatan yang banyak diterapkan untuk mengkopi potongan

DNA tertentu dan produknya dalam laboratorium adalah penggunaan suatu
bakteri yang umumnya adalah Escherichia coli. E.coli merupakan salah satu dari
banyak bakteri lain yang memiliki suatu materi genetic ekstra-kromosomal yakni
plasmid. Plasmid adalah molekul DNA kecil melingkar yang bereplikasi secara
terpisah dari kromosom bakteri. Gen ini berguna ketika bakteri tersebut berada
pada kondisi lingkungan tertentu (Urry et al., 2017).
Secara umum, teknik pengklonaan potongan-potongan DNA ini dimulai
dengan cara mengisolasi plasmid dari sel bakteri dan menyisipkan DNA dari
sumber lain ke dalam plasmid membentuk suatu DNA rekombinan. Plasmid yang
sudah dimodifikasi ini kemudian dikembalikan ke dalam sel bakteri, dengan
harapan bakteri tersebut akan bereproduksi membentuk suatu populasi (Urry et
al., 2017).
Untuk mereplikasikan suatu sekuens spesifik DNA, sekuens yang kita
inginkan (yang sudah diisolasi dari sumber lain) harus disisipkan pada plasmid
yang memiliki replication origin (ORI). Enzim dari bakteri tersebut akan
mengenali sekuens ORI dan akan mereplikasi keseluruhan sekuens DNA pada
plasmid tersebut tanpa terkecuali, teknik ini merupakan basis dari DNA cloning
(Lodish et al., 2000).

Gambar 1.1 Posisi Insersi DNA yang Dikehendaki Pada Plasmid

Untuk menginsersi DNA yang diinginkan, diperlukan suatu enzim

endonuclease yang dapat menghidrolisis DNA pada sekuens spesifik. Tujuan
penggunaan enzim ini adalah untuk membuka untaian DNA plasmid, sehingga
bisa disisipkan DNA asing tersebut. Contoh enzim restriksi ini antara lain adalah
EcoRI. Enzi mini memotong fragment DNA dengan mengenali sekuens GAATTC
(Cooper, 2000).
Hasil plasmid yang sudah direkombinasikan tersebut akan dikembalikan lagi
menuju sel induk. Kemudian, bakteri akan diinkubasi dengan kondisi tertentu
untuk memfasilitasi transformasi yang diinginkan serta untuk mendapatkan
produk tertentu sesuai dengan insersi DNA yang diinginkan. Secara ringkas,
proses untuk mendapatkan DNA rekombinasi adalah sebagai berikut (Lodish et
al., 2000) :

Gambar 1.2 Ringkasan Proses Rekombinasi DNA Menggunakan E.coli

2. TUJUAN

1. Mengetahui prinsip kerja teknik rekombinasi DNA.

2. Melakukan dan mengamati prosedur teknik rekombinasi DNA.

3. METODE

a. Alat dan Bahan

 Plasmid
 Enzim Restriksi (EcoRI dan PstI)
 DNA Protein X
 Koloni Escherichia coli
 Plate
 Media : IPTG dan X-Gal
 Waterbath
 Incubator
 Incubator shaker
b. Persiapan Enzim Restriksi
 Masukkan semua bahan :
1. Buffer 5 ul
2. Pure DNA 2 ul
3. PstI 0,5 ul ( 1 ul = 10 unit)
4. PCR Grade Water 42,5 ul
 Mix semua bahan dengan cara pipetting ( Jangan di vortex).
 Aktivasi pada suhu 37 C selama 60 menit.
c. Restriksi
 Kondisi plasmid sudah terbuka.
 Stop aktivasi enzim menggunakan 21 ul EDTA.
d. Ligasi
 Ligasi Ag38 pake enzim DNA ligase+buffer ( Enzim harus selalu
menggunakan buffer agar stabil).
 Masukkan :
1. Vector DNA full 100 ul
2. DNA sebanyak 17 ng/ 0,85 ul
3. Ligase buffer 1 ul
4. DNA ligase 1 ul
 5. Nuclease free water 7 ul
 Inkubasi pada suhu ruang selama 3 jam.
 Lakukan inaktivasi selama 10 menit menggunakan incubator.
 Produk Ligasi dapat diamati menggunakan elektroforesis sebelum
dilakukan transformasi.
e. Transformasi
 Prinsip : Pembentukan competent cell : E.coli dimasukkan ke
larutan MgCl2, sehingga memiliki muatan (+). Hal ini penting
karena DNA memiliki muatan (-). Proses yang akan dilakukan
adalah metode Heat Stroke dengan tujuan membuka pori- pori sel
ketika diberikan panas, lalu ditutup secara paksa menggunakan
suhu rendah.
 Bahan hasil ligase sebelumnya sebanyak 3 ul ditambahkan BL21
E.coli sebanyak 50 ul.
 Inkubasi selama 20 menit di es ( es serut), lakukan flicking untuk
memicu proses transformasi.
 Lakukan Heatshock dengan suhu 42 C selama 45 detik
menggunakan waterbath.
 Inkubasi kembali pada es selama 5 menit.
f. Kultur
 Bahan :
1. SOC Medium 950 ul
2. Sel bakteri E.coli hasil transformasi
 Sel bakteri yang sudah ditransformasi ditambahkan SOC Medium
dan diinkubasi selama 1,5 jam dengan tujuan recovery cell.
 Dilanjutkan dengan inkubasi pada incubator shaker dengan suhu
37 C selama 1,5 jam.
 Kemudian, sel ditumbuhkan menggunakan medium selektif.
Metode yang dapat digunakan adalah Antibiotic Selectable Marker
dan LacZ Blue White Colony. Step ini bertujuan untuk
mendapatkan koloni bakteri yang kita inginkan. Pada praktikum ini,
100 ul bakteri hasil transformasi diletakkan pada plate dengan
IPTG dan X-Gal.
4. HASIL

Gambar 4.1 Hasil pembacaan sampel plasmid

Gambar 4.2 Hasil kultur Escherichia coli dengan metode LacZ Blue/White
5. DISKUSI

Plasmid merupakan DNA sirkuler yang berada diluar kromosom utama.

Plasmid mengandung gen yang memberikan resistensi terhadap mikroba lain,
degradasi dari komponen organic tertentu dan gen yang mengkode toksin atau
enzim tertentu. Plasmid dikenali mudah untuk porses pengemasan suatu DNA
asing dengan tujuan cloning, produksi masal suatu gen atau protein tertentu yang
diinginkan (Bok & Keller, 2012).
Proses rekombinasi DNA tidak lepas dari penggunaan enzim restriksi. Setiap
enzim restriksi bersifat sangat spesifik dalam mengenali sekuens DNA tertentu.
Enzim tersebut memotong dua untai DNA dengan sangat spesifik dalam
restriction site. Enzim ini bekerja dengan cara mengenali basa adenine atau
sitosin bakteri, lalu menambahkan gugus metil (-CH3) pada basa tersebut
sehingga terjadi pemotongan untai DNA. Situs restriksi ini bersifat simetris, dan
umumnya mengenali empat sampai delapan nukleotida. Dengan kemampuan
memotong DNA secara berkali-kali, maka akan dihasilkan fragmen restriksi,
membentuk suatu ujung sticky end atau blunt end untuk kemudian disambung
kembali menggunakan enzim ligase (Urry et al., 2017).

Gambar 5.1 Fragmen Restriksi dan Proses Ligasi

 Setelah proses rekombinasi selesai, diperlukan transformasi plasmid
sehingga materi genetic tersebut masuk kedalam bakteri dan dapat dimultiplikasi
dan di ekspresikan. Salah satu proses yang dapat dilakukan—yang juga
dilakukan pada praktikum kali ini—adalah metode Heatstroke. Metode ini
menggunakan suhu sebagai mediator untuk memasukkan plasmid ke dalam
bakteri.
Perbedaan suhu yang secara tiba-tiba akan mengubah kondisi fluiditas
membaran sel. Peningkatan suhu dapat meningkatkan pelepasan lipid dari
membrane sel ke medium sehingga menurunkan fluiditas membrane sel. Kondisi
ini juga mendepolarisasi cellular inner membrane. Sebaliknya, penurunan suhu
meningkatkan fluiditas kembali ke kondisi normal karena adanya pelepasan
protein membrane. Dengan menggunakan metode ini, keberhasilan transformasi
dapat diakibatkan karena dengan pelepasan lipid selama pemberian panas,
maka pelepasan lipid dan pembentuan pori sel semakin meningkat. Kondisi ini
mempermudah DNA untuk melewati membrane sel. Disisi lain, dengan
menurunkan potensial membrane, maka DNA juga akan semakin lebih mudah
melewati membrane sel (Panja et al., 2008).
Sebelum dilakukan transformasi, DNA rekombinan dapat dicek dahulu. DNA
rekombinan dimultiplikasi terlebih dahulu menggunakan PCR untuk mendapatkan
jumlah DNA rekombinan yang cukup untuk bisa dibaca menggunakan analisis
lanjutan. Proses selanjutnya adalah southern blotting, dimana hasil PCR dibaca
dan DNA rekombinan diidentifikasi berdasarkan panjang basa nukleotida (Smalla
& Top, 2015).
Berdasarkan informasi dari laboran, plasmid yang kami gunakan dengan hasil
identifikasi yang dicontohkan berbeda, sehingga perlu dipahami bahwa data yang
disajikan disini memiliki perbedaan dengan data yang kami terima. Panjang
plasmid yang digunakan pada hasil yang kami dapatkan sekitar 10000 bp, yang
ditunjukkan pada sumur kedua. Selanjutnya, kami mendapatkan data bahwa
panjang DNA insersi yang digunakan pada interpretasi tersebut sekitar 2400 bp.
Sehingga kita mendapatkan sebuah plasmid dengan panjang 12,400 bp, sesuai
dengan hasil interpretasi data yang disajikan.
Pada praktikum kali ini kami menggunakan bakteri Eschericia coli sebagai
media untuk melakukan rekombinasi DNA. Enzim restriksi yang digunakan
adalah EcoRI dan PstI. Setelah dilakukan proses ligase dan trasnformasi, bakteri
tersebut dikultur menggunakan metode selektif LacZ Blue/White dengan
interpretasi koloni yang berwarna biru mengandung gen LacZ yang akan
menghasilkan enzim yang mampu menghidrolisis galaktosa pada medium, dan
menghasilkan warna biru. Sebaliknya, koloni yang berwarna putih tidak memiliki
gen tersebut akibat restriksi, sehingga tidak dapat menghidrolisis galaktosa dan
memunculkan warna biru.

Gambar 5.2 Data Sheet dari Plasmid Escherichia coli yang digunakan

Penggunaan LacZ sebagai metode deteksi viabilitas gen dari vector sudah
diketahui memiliki kemampuan deteksi yang cepat. Gen LacZ dari Eschericia coli
mengkode enzim beta galaktosidase. Ekspresi gen ini dapat dideteksi secara in
vivo dan in vitro pada koloni suatu sel. Hasil deteksi yang didapatkan dapat
berupa hasil kualitatif menggunakan reaksi sito-histokimia dan reaksi
immunologis atau secara kuantitatif menggunakan kolorimetri atau
chemiluminescent assay (Naderian et al., 2011).
6. REFERENSI

Bok, J. W., & Keller, N. P. (2012). Fast and easy method for construction of
plasmid vectors using modified quick-change mutagenesis. Methods in
molecular biology (Clifton, N.J.), 944, 163–174.
https://doi.org/10.1007/978-1-62703-122-6_11

Cooper GM. The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. Sunderland (MA):
Sinauer Associates; 2000. Recombinant DNA. Available from:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9950/

Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. Molecular Cell Biology. 4th edition. New
York: W. H. Freeman; 2000. Section 7.1, DNA Cloning with Plasmid
Vectors. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21498/

Naderian, H., Rezvani, Z., Atlasi, M. A., Nikzad, H., & Antoine, A. (2011).
Expression Cloning of Recombinant Escherichia coli lacZ Genes Encoding
Cytoplasmic and Nuclear β-galactosidase Variants. Iranian journal of basic
medical sciences, 14(4), 369–375.

Panja, S., Aich, P., Jana, B., & Basu, T. (2008). How does plasmid DNA
penetrate cell membranes in artificial transformation process of Escherichia
coli?, 25(5).

Smalla, K., Jechalke, S., & Top, E. M. (2015). Plasmid Detection,

Characterization, and Ecology. Microbiology spectrum, 3(1),
10.1128/microbiolspec.PLAS-0038-2014.
https://doi.org/10.1128/microbiolspec.PLAS-0038-2014

URRY, L. A., CAIN, M. L., WASSERMAN, S. A., MINORSKY, P. V., REECE, J.

B., & CAMPBELL, N. A. (2017). Campbell biology
DOKUMENTASI
 LAMPIRAN

1. Data Sheet Enzim Restriksi EcoRI

2. Data Sheet Enzim Restriksi PstI