PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK KULIT BUAH DELIMA

(Punica granatum L.) TERHADAP RESPON TAKTIL FASE EMBRIO

DAN KEMAMPUAN MOTORIK PADA FASE LARVA ZEBRAFISH
(Danio rerio) YANG DIPAPAR KAFEIN SECARA IN VITRO
Disusun Oleh :
Maulana Wildan Seputra
165070100111043

Penguji 1 : Wibi Riawan S.Si., M.Biomed

Penguji 2 : dr Yushi Karina M.Sc
Penguji 3 : Aswaty Nur, S.Si., M.Kes
Bab 1
Pendahuluan
Latar Belakang
• Angka kematian bayi (AKB) masih terbilang tinggi, 25.5
kematian setiap 1000 kelahiran.
• Di Indonesia sendiri pada tahun 2010 angka kelahiran
cacat mencapai 59.3 per 1000 kelahiran hidup. Apabila
kelahiran di Indonesia tercatat 5 juta bayi lahir per tahun,
maka akan ada kurang lebih 295.000 bayi dengan
kelainan bawaan (Kementrian Kesehatan, 2017).
Latar Belakang
• Kafein adalah komponen yang perlu diperhatikan jumlah
konsumsi-nya pada ibu hamil.
• Kafein memiliki efek berupa vasokonstriktif, termasuk
pembuluh darah uteroplasenta, menyebabkan kondisi
hipoksia dan terbentuknya radikal bebas pada janin.
• Dampak yang dihasilkan cukup beragam, Kafein
memiliki efek teratogenik.
.
Latar Belakang
• Mengapa kulit buah delima (Punica granatum)?
• Pohon delima adalah salah satu komoditas binaan
Kementrian Pertanian Republik Indonesia.
• Memiliki kandungan bioflavonoid yang melimpah,
yang berfungsi sebagi antioksidan.
• Kemampuan antioksidan ekstrak kulit buah delima
diketahui 2x lebih kuat ketimbang vitamin C.
Latar Belakang
• Mengapa Ikan Zebra (Danio rerio)?
• Kesamaan genetik cukup tinggi dengan mamalia.
• Kesamaan jalur metabolisme.
• Dapat digunakan untuk mengamati toksikologi suatu
zat terhadap aspek neurobehavioral ikan.
Rumusan Masalah
1. Apakah terdapat pengaruh pemberian ekstrak kulit buah
delima terhadap respon taktil pada embrio zebrafish usia 48
hpf akibat paparan kafein?
2. Apakah terdapat pengaruh pemberian ekstrak kulit buah
delima terhadap kemampuan motorik pada larva zebrafish
usia 120 hpf akibat paparan kafein?
Tujuan Penelitian
• Tujuan Umum :
• Untuk menganalisis pengaruh pemberian ekstrak kulit delima
terhadap kemampuan motorik pada larva zebrafish yang dipapar
dengan kafein
Tujuan Penelitian
• Tujuan Khusus :
• Menganalisis pengaruh ekstrak kulit buah delima terhadap respon
taktil dan kemampuan motorik embrio zebrafish usia 48 hpf yang
dipapar dengan kafein.
• Menganalisis kadar ekstrak kulit buah delima terhadap respon
taktil dan kemampuan motorik larva zebrafish usia 120 hpf yang
dipapar dengan kafein.
Manfaat Akademik
• Penelitian ini dapat memberikan pengalaman baru bagi mahasiswa
dalam merencanakan penelitian, belajar dan mengenal dan
menangani hewan coba zebrafish, termasuk juga mengenal bahan
alam dan proses ekstrasinya. Selain itu, mahasiswa belajar untuk
bekerja sama dalam satu tim serta menulis secara ilmiah.
• Penelitian ini diharapkan dapat menambah pengetahuan ilmiah
mengenai potensi ekstrak kulit delima sebagai antioksidan alami
terhadap pengaruh paparan kafein pada perkembangan awal
zebrafish, khususnya respon taktil dan kemampuan motorik hewan
uji tersebut.
• Metode dan hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi rujukan
dasar bagi penelitian selanjutnya baik yang menggunakan ekstrak
kulit buah delima atau bahan alam lainnya yang berkaitan dengan
perkembangan embrio dan zat-zat teratogen baik pada zebrafish
maupun hewan coba lainnya
Manfaat Praktis
• Masyarakat dapat memperoleh informasi mengenai potensi
penggunaan ekstrak kulit buah delima dalam mendukung
perkembangan embrio hewan coba, khususnya respon taktil dan
kemampuan motorik embrio zebrafish.
• Masyarakat diharapkan dapat memperoleh informasi ilmiah
mengenai pengaruh kafein terhadap perkembangan embrio hewan
coba khususnya respon taktil dan kemampuan motorik embrio
zebrafish.
Bab 2
Tinjauan Pustaka
Kafein
• Kafein (1,3,7-trimethylxanthine) merupakan senyawa alkaloid
golongan xanthine (basa purin). Kafein merupakan salah satu
komponen dari tanaman non-alokoholik yang dapat diolah
menjadi minuman ataupun makanan.
• Kafein dapat dijumpai dalam berbagai sumber makanan
seperti kopi, the, dan coklat. Serta dapat ditemukan di berbagai
jenis obat seperti analgesic.
Kafein
• Kafein memiliki kecepatan absorbsi yang baik pada saluran
pencernaan dan mencapai kadar tertinggi dalam darah dalam 30
hingga 45 menit. Waktu paruh kafein sangat bervariasi antar
individu.
• Kafein dimetabolisme di hati oleh sistem enzim sitokrom P450
oksidase menjadi tiga metabolik dimethylxanthines, yang
masing-masing memiliki efek sendiri pada tubuh :
paraxanthines, teofilin, dan theobromine.
• Kafein memiliki sifat antagonis terhadap reseptor adenosine,
dapat menghambat jalur transduksi sinyal sel melalui inhibisi
kinerja enzim fosfodiesterase, menghambat modulasi reseptor
GABA di otak, serta berperan dalam pelepasan kalsium
intraselular memalui reseptor ryadonine di reticulum
endoplasma.
Kafein
• Kafein yang bersifat antagonis reseptor adenosine, dapat
memicu peningkatan denyut jantung dan juga tekanan darah.
Penekanan terhadap reseptor adenosine juga dapat
menyebabkan peningkatan sekresi hormone lain seperti:
adrenalin, dopamin dan serotonin. Peningkatan hormon-
hormon tersebut dapat meningkatkan tekanan darah dan juga
menyebabkan vasokontriksi pembuluh darah.
Kafein
• Paraxanthine merupakan hasil metabolism kafein dengan
jumlah paling besar merupakan sumber penting terjadinya
pembentukan radikal bebas yang menginduksi kerusakan
komponen seluler yang bersifat irreversible dan menyebabkan
kematian sel.
Stress Oksidatif
• Stres oksidatif merupakan ketidakseimbangan antara radikal
bebas (pro oksidan) dengan antioksidan yang dipicu oleh dua
kondisi umum, yaitu kurangnya antioksidan dan atau produksi
radikal bebas yang berlebih.
• Penurunan stres oksidatif dapat dicapai melalui tiga tahap,
yaitu dengan menurunkan pajanan ke polutan lingkungan yang
mengandung oksidan, meningkatkan jumlah antioksidan
endogen dan eksogen, dan menurunkan stres oksidatif dengan
menstabilkan produksi dan efisiensi energi mitokondria.
Stres oksidatif
• Disebabkan oleh ROS (Reactive Oxigen Species) molekul yang
bersifat reaktif dan radikal bebas.
• Radikal bebas merupakan suatu molekul zat kimia yang
bersifat reaktif karena memiliki electron bebas pada orbital
terluarnya sehingga mudah berikatan dan bereaksi dengan
molekul disekitarnya
• ROS berperan dalam jalur pensinyalan sel terutama dalam
apoptosis sel melalui mitokondria.
Antioksidan
• Substansi yang memperlambat, mencegah, atau menghentikan
proses perusakan secara oksidatif terhadap molekul target
• Fungsi utama :
• Primer : Menghambat reaksi inisiasi serta memutus reaksi
berantai oksidasi.
• Sekunder : Menangkap radikal bebas dan menghambat reaksi
berantai oksidasi.
• Tersier : Memperbaiki kerusakan sel dan jaringan.
Vitamin C
• Vitamin C atau senyawa asam L-ascorbic atau yang biasa
dikenal dengana asam askorbat. Peran Vitamin C sebagai
reduktan didapatkan dengan mendonorkan elektron bebas ke
suatu substrat sehingga Vitamin C sendiri menjadi radikal
ascorbyl, radikal bebas yang relatif stabil.
• Vitamin C diabsorbsi dalam tubuh melalui transport aktif
maupun difusi sederhana. Umumnya, vitamin C diabsorbsi
melalui transporter Sodium-Dependent Active Transport
subtipe Sodium Ascorbate Co-transporter (SVCTs) dan
transporter Hexose atau yang lebih dikenal dengan Glucose
Transporters (GLUTs).
• Vitamin C diekskresikan melalui urin.
Vitamin C
• Vitamin C dalam bentuk askorbat memiliki beberapa fungsi
sebagai substrat enzim maupun kofaktor dan donor elektron
dalam tubuh, hal ini sangat berperan dalam sintesis kolagen,
carnitin, neurotransmitter, sintesis dan katabolisme tirosin serta
metabolism mikrosom.
• Vitamin C memiliki efek elektron donor yang terlarut dalam
air. Vitamin C dalam bentuk ASC (L-ascorbic acid) atau DHA
(L-Dehydroascorbic acid) memiliki berfungsi mendonor
elektron untuk LOOH (lipid hydroperoxide) yang merupakan
hasil metabolisme oksidasi dari ROS
Taksonomi Punica granatum
diikutip dari : https://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=27278#null
• Buah delima banyak mengandung zat yang memiliki aktivitas
antioksidan, seperti punicalagin, ellagic acid, gallagic acid,
dan punicalin.
• Kemampuan anti oksidan kulit buah delima dua kali lipat
lebih tinggi dibandingkan dengan daging buahnya.
Taksonomi Danio rerio
dikutip dari : https://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=163699#null
• Mengapa Ikan Zebra (Danio rerio)?
• Kesamaan genetik cukup tinggi dengan mamalia.
• Kesamaan jalur metabolisme.
• Dapat digunakan untuk mengamati toksikologi
suatu zat terhadap aspek neurobehavioral ikan,
 Tahap Perkembangan Zebrafish
Tahap Waktu Keterangan

Periode zigot 0 – ¾ jam Telur yang baru difertilisasi berkembang menjadi

zigot, sitoplasma menuju kutub untuk membentuk

(1 sel)
blastodisk

Periode pembelahan ¾ - 2 jam Sel membelah menjadi 2,4,8,16, 32 sampai 64 set

(2 – 64 sel)

Periode blastula 2 ¼ - 5 ¼ jam Embrio memasuki transisi midblastula,

pembentukan yolk syncytial layer (YSL) dari epiboly.

Diawali dengan terbetuknya kubah dan perubahan

blastodisk menjadi blastoderm

Periode gastrula 5 ¼ - 10 jam Epiboly sudah terbentuk secara sempurna, tail bud,

aksis embrionik, dan primary germ layer telah

terbentuk

Periode segmentasi 10 – 24 jam Organogenesis awal dimulai. Diawali dengan neuron

dan ginjal, telinga mulai nampak, ekor anterior

memanjang, terjadi kontraksi miotom spontan.

Periode pharyngula 24 – 48 jam Aksis tubuh mulai lurus ditandai dengan kepala yang

memendek dan mulai lurus. Dimulainya pembentukan

sirip. Jantung mulai berdenyut, serta mulai muncul

sensitivitas terhadap rangsang taktil

Perkembangan melambat
Periode penetasan 48 – 72 jam Morfogenesis telah sempurna dan terjadi

penetasan secara spontan menjadi larva. Mulai

aktif berenang dan mulai timbul refleks

menghindar pada rangsang taktil.

Periode Larva Berenang Bebas 120 hpf Pada usia ini larva ikan zebra dapat berenang

bebas untuk mengeksplorasi lingkungannya

serta mencari makanan.

Respon Taktil
• Respon taktil pada zebrafish menandakan bahwa pada fase
tersebut, larva sudah mulai mengalami perkembangan motorik.
Respon ini muncul pertama kali ketimbang berbagai jenis
gerakan motorik lainnya, muncul dimulai saat 17 jam pasca
fertilisasi.
• Ketika telur menetas pada kurang lebih 48 jam pasca fertilisasi,
kemampuan motorik larva zebrafish masih belum dapat terlihat
dengan baik, tetapi dapat dipicu dengan memberikan respon
taktil berupa sentuhan
Kemampuan Motorik
• Perkembangan motoric pada zebrafish dapat diamati sebagai berikut :
• Pada 24 hpf pertama, embrio zebrafish masih sangat terbatas gerakan
motoric-nya. Hanya berupa gerakan coiling dari ekor embrio, dengan
frekuensi mencapai 1 Hz.
• Pada 48 hpf, terjadi fase pergerakan ekor secara kontinyu, hingga
mencapai frekuensi 100 Hz.
• Pada 72 hpf, ikan akan masuk ke periode intermiten. Ikan akan bergerak
dan diam secara bergantian secara periodic.
• Pada 96 hpf, gerakan ikan sudah dapat diamati menjadi dua gerakan
utama, yakni slow swim dan burst swim.
• Pada 120 hpf, perkembangan spinal cord zebrafish sudah mengalami
perubahan yang signifikan daripada hari pertama. Hal ini dapat dijadikan
acuan sebagai tingkat kompleksitas motoric ikan yang semakin baik
walaupun seiring perkembangannya, spinal cord akan berkembang lebih
lanjut.
Bab 3
Kerangka Konsep dan Hipotesis Penelitian
Kerangka Konsep
Hipotesis
• Pemberian ekstrak kulit buah delima (Punica granatum L.)
dapat meningkatkan respon taktil  larva zebrafish (Danio
rerio) yang dipapar kafein.
• Pemberian ekstrak kulit buah delima (Punica granatum L.)
dapat meningkatkan kemampuan motorik pada larva zebrafish
(Danio rerio) yang dipapar kafein.
Bab 4
Metode Penelitian
Desain Penelitian
• Penelitian ini menggunakan desain eksperimen murni (true
experimental design) secara in vitro menggunakan rancangan
Randomized Post Test Only Controlled Group Design.
Tempat dan Waktu Penelitian
• Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Budidaya Ikan
Divisi Reproduksi Ikan FPIK-UB, Laboratorium Faal FKUB
dan Laboratorium Farmakologi FKUB, Malang, pada Bulan
Oktober-Desember 2018.
Populasi dan Sampel Penelitian
• Populasi penelitian ini adalah embrio zebrafish yang
didapatkan dari Laboratorium Budidaya Ikan Divisi
Reproduksi Ikan FPIK Universitas Brawijaya. Sampel yang
digunakan diletakkan dalam 2 buah well plate yang masing
masing memiliki dari 6 well. Masing masing well
merepresentasikan satu kelompok perlakuan dan diisi dengan
20 embrio zebrafish (Danio rerio). Penelitian ini terdiri dari
sembilan kelompok perlakuan yang dilakukan sebanyak tiga
kali pengulangan.
Kelompok Perlakuan
• Kontrol: sampel tidak diberikan paparan kafein maupun ekstrak kulit buah delima, hanya dipapar dengan medium
embrio zebrafish.
• Kelompok negatif 1 (KF): sampel diberikan kafein konsentrasi 100 ppm
• Kelompok negatif 2 (EKD): sampel diberikan delima dengan konsentrasi 0,7 ppm
• Kelompok kontrol positif (KFVC): sampel diberikan kafein konsentrasi 100 mg/L dan Vitamin C konsentrasi 30
ppm
• Kelompok Perlakuan 1 (KFKD1): sampel diberikan kafein konsentrasi 100 mg/L dan diberikan ekstrak kulit buah
delima (Punica granatum L.) konsentrasi 1 yaitu 0,14 ppm
• Kelompok Perlakuan 2 (KFKD2): sampel diberikan kafein konsentrasi 100 mg/L dan diberikan ekstrak kulit buah
delima (Punica granatum L.) konsentrasi 2 yaitu 0,28 ppm
• Kelompok Perlakuan 3 (KFKD3): sampel diberikan kafein konsentrasi 100 mg/L dan diberikan ekstrak buah delima
(Punica granatum L.) konsentrasi 3 yaitu 0,42 ppm
• Kelompok Perlakuan 4 (KFKD4): sampel diberikan kafein konsentrasi 100 mg/L dan diberikan ekstrak buah delima
(Punica granatum L.) konsentrasi 4 yaitu 0,56 ppm
• Kelompok Perlakuan 5 (KFKD5): sampel diberikan kafein konsentrasi 100 mg/L dan diberikan ekstrak buah delima
(Punica grantum L.) konsentrasi 5 yaitu 0,7 ppm
Variabel Penelitian
Variabel Bebas
• Variabel bebas yang digunakan adalah ekstrak kulit buah delima
(Punica granatum L.) dengan konsentrasi yang berbeda yaitu
konsentrasi 1 (0,14 mg/L), konsentrasi 2 (0,28 mg/L), konsentrasi
3 (0,42 mg/L), konsentrasi 4 (0,56 mg/L) dan konsentrasi 5 (0,7
mg/L) yang sebelumnya sudah dipapar dengan pemberian kafein
dengan konsentrasi tetap yaitu 100 mg/L untuk semua sumur
kecuali kontrol, vitamin C dengan dosis tetap yaitu 30 mg/L
untuk kontrol positif.

Variabel Terikat
• Variabel terikat dalam penelitian ini adalah respon taktil dan
kemampuan motorik yang dipengaruhi oleh paparan kafein dan
ekstrak kulit buah delima.
Definisi Operasional
Alur Penelitian
Bab 5
Hasil Penelitian dan Analisis Data
Hasil Penelitian
• Pengukuran signifikansi statistik antar kelompok dianalisis menggunakan program
SPSS dengan tingkat signifikansi (p<0,05) dan taraf kepercayaan 95%. Data diuji
komparasi menggunakan uji Kruskal-Wallis, lalu di uji post hoc menggunakan uji
Mann Whitney.
Hasil Penelitian
• Pada penelitian ini dilakukan tiga kali pengulangan pada masing- masing variabel,
yaitu kemampuan berenang dan kemampuan fungsi motorik pada embrio zebrafish
(Danio rerio) yang ditunjukan melalui data berikut :

Respon Taktil Positif (%) Aktivitas Motorik (Kali/Menit)

Variabel
Dependen P1 P2 P3 Rerata P1 P2 P3 Rerata

Kontrol 88,89 100,00 100,00 96,30 6,33 10,59 5,73 7,55

KF 75,00 93,75 92,86 87,20 0 2,94 0 0,98
EKD 100,00 90,00 100,00 96,67 0,4 4,55 6,61 3,85
KFVC 100,00 100,00 100,00 100,00 0,29 0,31 0 0,20
KFKD1 100,00 93,33 92,86 95,40 0,67 0,5 0 0,39
KFKD2 100,00 100,00 90,91 96,97 0,11 0 0 0,04
KFKD3 100,00 100,00 75,00 91,67 0,22 1,86 0 0,69
KFKD4 100,00 93,33 93,33 95,55 0,17 1,19 0,06 0,47
KFKD5 100,00 94,12 80,00 91,37 1 0,85 0,29 0,71
Hasil Total Pengamatan Pemberian Ekstrak Kulit Buah Delima
Terhadap Respon Taktil Embrio Zebrafish yang Dipapar Kafein
Respon taktil larva zebrafish usia 48 hpf
Perbandingan respon taktil larva zebrafish usia 48 hpf
pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan
Hasil Total Pengamatan Pemberian Ekstrak Kulit Buah Delima Terhadap
Kemampuan Motorik Embrio Zebrafish yang Dipapar Kafein
Kemampuan motorik larva zebrafish usia 120
hpf pada total pengamatan
Perbandingan kemampuan motorik larva zebrafish usia 120 hpf
pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan
Bab 6
Pembahasan
Efek Pemberian Ekstrak Kulit Buah Delima
Terhadap Respon Taktil Embrio Zebrafish
• Untuk membandingkan efek kafein terhadap respon taktil
embrio zebrafish, kelompok kontrol negatif dibandingkan
dengan kelompok kontrol yang tidak diberi perlakuan. Dari
data dapat dilihat bahwa terjadi penurunan fungsi respon taktil
pada kelompok kafein walaupun tidak secara signifikan.
• Untuk mengetahui apakah ekstrak kulit buah delima mampu
memberikan fungsi antioksidan terhadap paparan kafein,
kelompok perlakuan dengan berbagai dosis ekstrak kulit
delima dibandingkan dengan kelompok kafein. Data
menunjukkan bahwa tidak ditemukan perbedaan yang
signifikan antar kelompok perlakuan walaupun tampak terjadi
peningkatan fungsi respon taktil dari larva zebrafish jika
dibandingkan dengan kelompok yang hanya diberi kafein saja.
Efek Pemberian Ekstrak Kulit Buah Delima Terhadap
Kemampuan Motorik Larva Zebrafish
• Untuk mengetahui efek kafein terhadap kemampuan motorik
larva zebrafish, perlu dibandingkan antara kelompok kontrol
dengan kelompok kafein. Hasil menunjukkan bahwa terjadi
penurunan kemampuan motorik pada kelompok kafein secara
bermakna.
• Pada kelompok perlakuan pemberian kafein dan ekstrak
delima, dapat ditemukan peningkatan kemampuan motorik
embrio zebrafish.
Keterbatasan Penelitian
• Dosis Kafein dan ekstrak kulit buah delima yang dapat dimetabolisme
larva zebrafish tidak dapat diketahui secara kuantitatif.
• Perekaman untuk mendapatkan data terbatas menggunakan kamera
hape standar dengan perhitungan secara manual, tanpa dilengkapi
dengan software atau komponen lain.
• Penelitian ini tidak menggunakan isolate murni zat antioksidan
tertentu.
• Penelitian ini merupakan penelitian awal untuk mengetahui pengaruh
antioksidan ekstrak kulit buah delima terhadap respon taktil dan
kemampuan motoric embrio zebrafish yang dipapar kafein sehingga
peneliti tidak mengetahui mekanisme secara pasti.
• Peneliti tidak dapat melakukan eksklusi telur yang terinfeksi jamur dan
bakteri.
• Dibutuhkan penelitian lanjutan.
Bab 7
Penutup
Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, maka diperoleh
kesimpulan sebagai berikut:
• Pemberian ekstrak kulit buah delima (Punica granatum L.)
dengan dosis 0.14 ppm, 0.28 ppm, 0.42 ppm, 0.56 ppm dan 0.7
ppm tidak mempengaruhi secara signifikan respon taktil
embrio zebrafish (Danio rerio) berusia 48 hpf yang dipapar
dengan kafein.
• Pemberian ekstrak kulit buah delima (Punica granatum L.)
dengan dosis 0.14 ppm, 0.28 ppm, 0.42 ppm, 0.56 ppm dan 0.7
ppm tidak mempengaruhi secara signifikan kemampuan
motorik secara bermakna pada larva zebrafish (Danio rerio)
berusia 120 hpf yang dipapar dengan kafein.
Saran
• Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan
dosis kafein yang lebih besar untuk mengetahui efek kafein
pada larva zebrafish.
• Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui
mekanisme antioksidan ekstrak kulit buah delima dalam skala
molekular dan selular, termasuk pengamatan pertumbuhan
neurologis embrio zebrafish dan ekspresi gen yang terkait.
• Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut menggunakan isolat
murni antioksidan dari ekstrak kulit buah delima.
Lampiran
Terimakasih