LAPORAN PRAKTIKUM BIOSAINS DAN BIOTEKNOLOGI

ELISA

Nama : Maulana Wildan Seputra

Nim : 196070122011002

Program Studi : S2 Biomedik Dual Degree

Tahun Ajar : 2020

 LATAR BELAKANG

Dalam tubuh manusia, immunoglobulin A diproduksi kurang lebih sebanyak 66

mg/kgBB perhari, paling banyak jika dibandingkan denga isotope yang lainnya.
Immunoglobulin A juga diketahui merupakan antibody yang paling potensial pada jaringan
mukosa. Walaupun sudah banyak penelitian yang menunjukkan fungsi immunoglobulin A dan
reseptor-nya, immunoglobulin A diketahui hanya memiliki fungsi utama sebagai antibody non-
inflamasi dan menjaga proses homeostasis mukosa. Namun, dengan adanya ekspresi berbeda
dan juga berbagai macam interaksi dengan reseptor, IgA dapat secara aktif maupun pasif
berperan dalam menginhibisi dan juga menginisiasi respon inflamasi ( Bakema dan Egmond,
2011).

Sel plasma dalam lamina propia lapisan mukosa memproduksi IgA polimer (pIgA)
yang merupakan bentuk monomer IgA yang bergabung menjadi satu pada Fc region oleh suatu
polipeptida bernama rantai J. pIgA kemudian mengikat polymeric immunoglobulin receptor
(pIgR) pada membrane basolateral dari sel epitel dan ditranspor menuju permukaan mukosa.
Komponen pIgR ini kemudian dipecah untuk melepaskan pIgA yang terikat glikoprotein
Secretory Component (SC). Bentuk dimer ini dinamakan sebagai secretory IgA (sIgA).
Berdasarkan fungsinya, sIgA memiliki peran dalam eliminasi pathogen, toksin, atau bakteri
yang hendak melewati lapisan epitel ( Leong dan Ding, 2014).

ELISA merupakan suatu metode deteksi menggunakan konsep reaksi antara antigen-
antibody, yang merepresentasikan adanya interaksi kimia diantara antibody dan antigen.
Antibody yang dimaksud adalah antibody yang dihasilkan oleh sel B. Respon kekebalan tubuh
yang spesifik ini memiliki peran penting dalam memberikan proteksi dari berbagai macam
pathogen dan juga toksin. Dengan memanfaatkan konsep reaksi ini, ELISA dapat digunakan
sebagai metode deteksi antigen yang sensitive sekaligus selektif kuantitatif/kualitatif. ELISA
juga dapat digunakan untuk deteksi protein, peptide, asam nukleat, hormone, dan lain
sebagainya (Sakamoto, 2018).

Berdasarkan metode yang dilakukan, ELISA dapat dibagi menjadi berbagai model
berdasarkan bagaimana antigen diimobilisasi dan dideteksi. Berikut table yang menunjukkan
perbedaan diantara berbagai metode beserta keuntungan dan kerugian (Shah & Maghsoudlou,
2016).
Tabel 1. Berbagai Macam Metode ELISA (Shah & Maghsoudlou, 2016)
 METODE PENELITIAN

2.1 Alat dan Bahan

1. Standard Solution
2. Sample (Mouse BAL)
3. Pre-coated ELISA Plate
4. Standard Diluent
5. Streptavidin-HRP
6. Stop Solution
7. Substrate Solution A
8. Substrate Solution B
9. Wash Buffer Concentrate
10. Biotinylated Mouse sIgA Antibody
11. Plate Sealer
12. Zipper Bag
13. Incubator
14. Absorbent Paper
15. Pipette dan pipette tips
16. Clean Tubes
17. Deionized Water
18. Microplate Reader

2.2 Reagent Preparation

1. Semua reagent hendaknya dikeluarkan dan disesuaikan suhunya menjadi suhu

ruang sebelum digunakan.
2. Standard stock dengan konsentrasi 64 ug/ml digunakan untuk membuat standar lain
dengan cara diencerkan menjadi beberapa konsentrasi. Encerkan menjadi 5
kelompok dengan konsentrasi masing-masing 32 ug/ml, 16 ug/ml, 8 ug/ml, 4 ug/ml,
dan 2 ug/ml. Sisa standard yang tidak digunakan disimpan pada suhu -20 C.
 Gambar 1. Petunjuk pengenceran stock solution menjadi beberapa konsentrasi
(Protokol Bioassay Technology Laboratory).

2.3 Assay Procedure:

1. Siapkan semua reagen, larutan standar yang sudah dibuat, dan sampel yang akan
digunakan. Semua bahan harus sudah mencapai suhu ruang sebelum digunakan.
2. Tentukan jumlah strip yang akan digunakan. Strip yang tidak digunakan disimpan
pada suhu 2-8 C.
3. Tambahkan 50 ul standard pada standard well. Tidak perlu ditambahkan antibody
dikarenakan larutan standar sudah berisi biotinylated antibody.
4. Tambahkan 40 ul sample ke sample wells, kemudian tambahkan 10 ul anti sIg-A
antibody ke sample wells. Tambahkan 50 ul streptavidin-HRP pada semua well.
Lakukan pipetting agar tercampur rata. Tutup dengan sealer. Inkubasi pada suhu 37
C selama 60 menit.
5. Lepas sealer, dan cuci plate sebanyak lima kali dengan wash buffer. Basahi well
sedikitnya 0.35 ml wash buffer selama 30 detik hingga 1 menit tiap pencucian.
Keringkan dengan bahan yang menyerap cairan seperti tissue atau yang lain.
6. Tambahkan 50 ul larutan substrat A ke setiap well dan tambahkan 50 ul larutan
substrat B. Tutup dengan sealer dan inkubasi pada suhu 37 C selama 10 menit pada
ruangan gelap.
7. Tambahkan 50 ul Stop Solution pada seluruh well. Larutan yang berwarna biru akan
tampak berubah menjadi kuning.
8. Tentukan nilai optical density tiap well secara langsung menggunakan microplate
reader yang sudah diatur pada panjang gelombang 450 nm. Lakukan dalam 10 menit
setelah pemberian Stop solution.
 HASIL

Gambar 1. Hasil Pembacaan Konsentrasi dan Optical Density Standar

Selanjutnya, data diolah dengan cara merata-ratakan Absorbansi dari hasil pembacaan,
serta dimasukkan ke formula logaritma sehingga didapatkan data sebagai berikut:

Kode Sampel Conc A1 A2 Arata-rata Log Conc Log Arata-rata

A1 BLANKO
A2A3 32 1,233 1,209 1,221 1,505 0,087
A4A5 16 0,756 0,785 0,771 1,204 -0,113
A6A7 8 0,637 0,564 0,601 0,903 -0,221
A9A9 4 0,414 0,392 0,403 0,602 -0,395
A10A11 2 0,263 0,296 0,280 0,301 -0,554
Tabel 1. Konsentrasi dan Absorbansi dari sampel

Keterangan:
 Conc: Konsentrasi
 A1: Absorbansi 1
 A2: Absorbansi 2
 Arata-rata: Absorbansi rata-rata
 Dari data yang sudah disajikan pada Tabel 1, data diolah menjadi bentuk grafik dan
disajikan pada grafik dibawah. Model grafik yang digunakan ada tiga macam, yakni model
linier, model semi-log, dan model log-log

1,400
y = 0,0299x + 0,2847
1,200
R² = 0,9805
1,000
Arata-rata

0,800

0,600

0,400

0,200

0,000
0 5 10 15 20 25 30 35
Konsentrasi

Gambar 2. Model 1: Linier

1,400

1,200
y = 0,7476x - 0,0202
R² = 0,9359
1,000
Arata-rata

0,800

0,600

0,400

0,200

0,000
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600
Log Konsentrasi

Gambar 3. Model 2: Semi-Log

 0,200

0,100 y = 0,5189x - 0,7079

R² = 0,9942
0,000
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600
Log Arata-rata
-0,100

-0,200

-0,300

-0,400

-0,500

-0,600
Log Konsentrasi

Gambar 4. Model 3: Log-Log

Setelah didapatkan hasil grafik dengan berbagai model, maka akan didapatkan data R2
sebagai berikut. R2 ini digunakan sebagai acuan untuk menentukan model grafik mana yang
tepat untuk menentukan hasil pembacaan sampel.

Model Persamaan R2

Linier Y=0,0299X + 0,2847 0,9805

Semi-log Y=0,7476X-0,0202 0,9359

Log-Log Y=0,5189X-0,7079 0,9942

Tabel 2. Perbandingan data R2 masing-masing model grafik

Dari table diatas, maka Model standar yang digunakan adalah Model Log-log. Hal ini
dikarenakan karena R2 yang paling mendekati 1. Hal ini penting dilakukan untuk
mendapatkan persamaan yang digunakan untuk mencari konsentrasi sampel. Berikut turunan
formula yang didapatkan dari Tabel 2 yang digunakan untuk mendapatkan konsentrasi
sampel :

𝑌 = 0,5189𝑋 − 0,7079
𝑌 + 0,7079
𝑋 =
0,5189
𝐿𝑜𝑔 𝐴 + 0,7079
𝐿𝑜𝑔 𝐶𝑜𝑛𝑐 =
0,5189
𝐿𝑜𝑔 𝐴 + 0,7079
𝐿𝑜𝑔 𝐶𝑜𝑛𝑐 =
0,5189
𝐿𝑜𝑔 𝐴+0,7079
𝐶𝑜𝑛𝑐 = 10 0,5189
 Dari formula yang didapatkan, maka konsentrasi sampel dapat ditentukan. Berikut
hasil pembacaan Absorbansi dan Konsentrasi dari sampel :

Kode Sampel A1 A2 Arata-rata Log Arata-rata Conc

B1B2 0,344 0,18 0,262 -0,5817 1,75

B3B4 0,213 0,161 0,187 -0,7282 0,91
B5B6 0,219 0,225 0,222 -0,6536 1,27
B7B8 0,201 0,215 0,208 -0,6819 1,12
B9B10 0,244 0,274 0,259 -0,5867 1,71
B11B12 0,255 0,26 0,258 -0,5892 1,69
Tabel 5. Hasil Pembacaan Absorbansi dan Konsentrasi Sampel.

Keterangan:
 Conc: Konsentrasi
 A1: Absorbansi 1
 A2: Absorbansi 2
 Arata-rata: Absorbansi rata-rata
 PEMBAHASAN DAN KESIMPULAN

Pada penelitian ini terdapat 12 sampel yang diujikan dengan metode ELISA. Sampel
diletakkan pada microplate reader untuk diketahui optical density-nya. Setelah dilakukan
pemeriksaan absorbansi sIgA dalam sampel, maka didapatkan nilai absorbansi sIgA dengan
kode sampel dimulai dari kode sampel B1 sampai B12. Untuk absorbansi rata – rata tertinggi,
diantara 12 sampel tersebut didapatkan pada sampel B9-B10 dengan rerata absorbansi 0.259,
sedangkan rerata terendah didapatkan pada sampel B3-B4 dengan absorbansi sebesar 0.187.
Dari hasil yang telah didapatkan, nilai absorbansi dimasukan kedalam formula yang sudah
didapatkan menggunakan sampel, sehingga didapatkan kadar sIgA sampel. Kadar tertinggi
didapatkan pada sampel B1-B2 dengan nilai 1.75 ug/ml. Sedangkan untuk kadar terendah
didapatkan pada sampel B3-B4 0.91 ug/ml.

Metode ELISA yang digunakan pada praktikum ini adalah Sandwich ELISA. Hal ini
dikarenakan metode Sandwich ELISA menggunakan dua antibody primer yang mengikat
antigen. Sandwich ELISA merupakan metode ELISA yang sensitive karena mampu
mendeteksi konsentrasi antigen yang kecil pada sampel. Antibodi yang digunakan pada
Sandwich ELISA dapat berupa monoclonal antibody maupun polyclonal antibody yang
disesuaikan dengan sampel. Tujuan penggunaan polyclonal antibody adalah dengan
meningkatkan sensitifitas bacaan, sedangkan penggunaan monoclonal antibody lebih ditujukan
untuk meningkatkan spesifitas pembacaan (Lequin, 2005).

Pada praktikum kali ini, kurva regresi menggunakan tiga macam model, yaitu linear,
semi-log, dan log-log. Tujuan utama menggunakan model linear adalah untuk mendapatkan
formula yang digunakan sebagai dasar perhitungan konsentrasi sampel. Namun, kurva ini
belum tentu bisa digunakan untuk perhitungan. Penggunaan data logaritma pada kurva
berfungsi untuk mengetahui kesesuaian model yang digunakan berdasarkan hasil kalkulasi dan
juga R2 dimana apabila nilai R2 mendekati nilai 1, berarti kurva regresi yang digunakan sudah
tepat dan akurat untuk menentukan konsentrasi sampel (Wakabayashi, 2008).
 REFERENSI

Bakema, J. E., & van Egmond, M. (2011). Immunoglobulin A: A next generation of

therapeutic antibodies?. mAbs, 3(4), 352–361. https://doi.org/10.4161/mabs.3.4.16092

Leong, K. W., & Ding, J. L. (2014). The unexplored roles of human serum IgA. DNA
and cell biology, 33(12), 823–829. https://doi.org/10.1089/dna.2014.2639

Lequin, R.M., 2005. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent

assay (ELISA). Clinical chemistry, 51(12), pp.2415-2418.

Protokol Bioassay Technology Laboratory Mouse Secretory Immunoglobulin A ELISA

Kit

Sakamoto, S., Putalun, W., Vimolmangkang, S., Phoolcharoen, W., Shoyama, Y.,
Tanaka, H. and Morimoto, S., 2018. Enzyme-linked immunosorbent assay for the
quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of natural
medicines, 72(1), pp.32-42.

Shah, K. and Maghsoudlou, P., 2016. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA):

the basics. British Journal of Hospital Medicine, 77(7), pp.C98-C101.

Wakabayashi, K. (2008) ‘How to calculate ELISA assay values by EXCEL’, pp. 1–8.
Available at: http://www.labanimal.co.kr/product/TechInform/ELISAbyEXCELE.pdf.
DOKUMENTASI