IV.

BEBERAPA MACAM TEKNIK

KULTUR JARINGAN
A. Kultur Antera
• Antera atau tepungsari secara alamiah berfungsi
menyerbuki maupun membuahi.
• Apakah tepungsari mempunyai totipotensi?
• Apakah tepungsari bila ditanam di atas media yang
sesuai dapat tumbuh menjadi tanaman yang
sempurna?
• Bagaimana cara mengubah naluri alami tepungsari
sehingga dapat tumbuh menjadi kalus dan
kemudian menjadi planlet (anak tanaman)?
1. Kegunaan Kultur Antera
a. Mampu menghasilkan tanaman haploid atau
tanaman yang hanya mempunyai satu genom
saja, dalam istilah yang baru dinamakan
monohaploid.
Keuntungan tanaman monohaploid adalah :
• Dapat digunakan untuk pemuliaan tanaman
selanjutnya.
• Dapat mengetahui sifat tanaman mono-
haploid dengan jumlah genom yang terkecil.
• Dari tanaman monohaploid diperkirakan
dapat menghilangkan sifat resesif.
b. Dari monohaploid dapat dihasilkan derivate yang
dihaploid (diploid) dengan cara :
• Merangkapkan krom. dg perlakuan colchisin.
• Mengadakan silangan tan. monohaploid.
c. Membuat tanaman homozigot.
d. Dikombinasikan dengan penggunaan mutagen kimiawi
atau mutagen fisik dapat menghasilkan mutan-mutan
dan menghasilkan tanaman sebagai berikut :
• Tanaman yang mempunyai ketahanan terhadap
penyakit, tahan rebah, dan lain-lain;
• Tanaman yang lebih unggul dan hasilnya lebih tinggi;
• Tanaman lebih cepat berbuah;
 • Toleran thd kadar garam di tanah yang berkadar garam tinggi,
toleran thd kekeringan, dan toleran thd tekanan lainnya;
• Meningkatkan kualitas nutrisi;
• Menghilangkan metabolit-metabolit yang merupakan racun bagi
binatang & manusia
2. Prosedur Pelaksanaan
• Sterilisasinya dilaksanakan dengan cara kimiawi ataupun cara fisik
(pemanasan).
• Cara kimiawi menggunakan Clorox. Kepala sari atau antera yang
masih terdapat di dalam kuncup bunga dimasukkan kedalam
Erlenmeyer yang telah diisi 10% Clorox dan satu tetes tween-20.
Setelah itu kuncup bunga digojog selama 10 menit di dalam larutan,
selanjutnya kuncup dibuka dengan memakai pisau steril, antera
dipotong dan dimasukkan ke dalam 5% Clorox + satu tetes tween-20
serta digojog selama lima menit. Sebelum ditanam di atas media,
eksplan dicuci terlebih dulu dengan menggunakan air steril.
• Sterilisasi dengan pemanasan dapat
dilaksanakan pada bahan yang berdaging;
caranya bahan bunga yang masih kuncup
dicelupkan ke dalam spiritus dan kemudian di
bakar. Cara ini diulang sampai tiga kali. Antera
kemudian diambil dan ditanam di atas media.
• Media yang paling banyak digunakan adalah NG
terutama untuk antera padi, tetapi dapat juga
menggunakan media MS atau VW untuk
membudidayakan kepala sari anggrek
Dendrobium.
• Yang perlu diperhatikan adalah zat-zat tambahan yang
harus dibubuhkan pada media baku untuk induksi kalus
dan untuk deferensiasi berbeda.
• Zat-zat tambahan yang diperlukan untuk induksi kalus
adalah 2,4 D, atau MCPA (2,methyl – 4- chorophenoxy
acetic acid) untuk pembentukan kalus padi. Kadar sukrosa
juga perlu ditingkatkan berkisar 6% - 20%, juga ion NH4
yang berasal dari ammonium-sulfat sebesar 3,5 m M/l
serta KH2PO4 800m/liter media sangat diperlukan khusus
untuk antera padi.
• Zat-zat tambahan untuk deferensiasi adalah kombinasi
hormone dari golongan auksin dan sitokinin, sebaiknya 2,4
D sama sekali tidak dipakai ; sedangkan kadar sukrosanya
dikurangi sampai hanya 3 % saja atau malahan dihilangkan
sama sekali.
3. Faktor-faktor yang Menentukan Hasil Akhir Kultur
Antera
• Kondisi pertumbuhan tanaman donor: Misalnya :
temperature, fotoperiodisasi, dan intensitas cahaya.
• Umur tanaman donor; Disarankan bahwa tunas yang
digunakan berasal dari awal pembungaan.
• Tingkat perkembangan pollen: Tingkat optimum
perkembangan pollen pada waktu diambil dari tunas
untuk setiap jenis tanaman berbeda. Paling baik
digunakan pollen pada tingkat pembelahan mitosis
pertama di mana untuk menentukan stadium ini
digunakan metode straining, yaitu acetocarmin 4%
dalam 50% asam glacial asetad
• Metode sterilisasi : Tanaman satu dengan lainnya
membutuhkan sterilan yang berbeda-beda Misalnya
sublimat, etanol, atau sodium hipoklorit.
• Pre-treatment: Beberapa jenis tanaman memerlukan
perlakuan pendahuluan berupa temperatur rendah 8 0C
selama empat hari (bunga padi), merendah dalam air yang
ada butir-butir arangnya ataupun mengurangi tekanan
atmosfir menjadi 12 mg/hg.
• Metode diseleksi
• Kultur media
• Kondisi ruang inkubasi: Suhu, cahaya densitas antera dan
orientasi eksplan perlu diperhatikan. Biasanya temperatur
yang dibutuhkan adalah 250 – 280C, tetapi ada yang
memerlukan temperatur lebih tinggi, misalnya 35 0C atau
lebih.
4. Permasalahan yang Sering Muncul
• Tanaman hasil budidaya masih banyak yang
steril.
• Masih perlu dicari pencegahan yang efektif
terhadap terjadinya tanaman bulai.
• Sampai sekarang masih belum berhasil
membudidayakan kepala sari tanaman
polongan.
B. Kultur Embrio
 Yang dimaksud dengan kultur embrio adalah
memisahkan embrio yang belum dewasa dan
menumbuhkannya secara kultur jaringan untuk
mendapatkan tanaman yang viable.
1. Tujuan Kultur Embrio
• Memperpendek Siklus Breeding: Tanaman yang
semula membutuhkan waktu yang lama untuk
berkecambah, dengan kultur embrio akan
menjadi lebih cepat berkecambah.
• Menguji kecepatan viabilitas biji: Perkecambahan
embrio dapat lebih nyata dan dapat lebih
memberikan interpretasi yang jelas dari pada
kalau menggunakan test pewarnaan.
• Memperbanyak tanaman langka : Tanaman langka, seperti
kelapa kopyor, sangat sulit untuk dibudidayakan secara
normal. Sebab, kelapa kopyor mempunyai embrio yang lunak
sehingga di bawah kondisi normal tidak mungkin untuk
berkecambah. Tetapi dengan teknik kultur embrio dapat
diperoleh tanaman kelapa kopyor.
• Memperoleh hybrid yang langka : Program pemuliaan
dengan mengadakan persilangan seringkali mengalami
kegagalan yg disebab-kan oleh proliferasi yang terhalang,
atau fertilisasi dapat terjadi secara normal tetapi embrio
mati pada awal tingkat perkembangannya.
• Kematian ini mungkin disebabkan oleh sedikitnya endosperm
atau endosperm tidak berkembang secara normal akhirnya
mengalami keguguran karena tidak cukup tersedia makanan,
atau mungkin endosperm mengalami kelainan. Untuk
mengatasi hal tersebut perlu dilakukan penanaman embrio
pada kultur media
2. Faktor-faktor yang Mempengaruhi Keberhasilan Kultur
Embrio
• Komposisi media : Media untuk pertumbuhan embrio
harus mengandung unsur makro, unsur mikro, dan
gula. Faktor penting lainnya yang tidak boleh diabaikan
adalah adanya ion ammonium dan potassium.
• Oksigen.
• Cahaya : Kadang-kadang untuk perkembangan embrio
membutuhkan tempat gelap kira-kira selama 7 – 14
hari, baru setelah itu dipindah ke tempat terang untuk
pembentukan khloropil.
• Temperatur : Temperatur optimum yang dibutuhkan
umumnya tergantung dari jenis tumbuhan yang
digunakan. Secara normal temperatur paling tinggi
adalah 220 – 280C.
c. Kultur Protoplas
1. Pengertian protoplas
• Protoplas adalah sel hidup yang telah dihilangkan dinding
selnya, yang disebut sebagai sel telanjang.
• Dinding sel yang pertama (dinding primitive atau lamella
tengah) adalah dinding yang terdiri dari zat pektin dan
protopekektin; pembentukan kedua zat ini melalui proses
pembelahan sel.
• Dinding yang pertama ini mengalami penebalan sampai tiga
kali, yaitu penebalan primer, penebalan sekunder dan
penebalan tertier.
• Penebalan primer terdiri dari zat sellulosa, sedangkan dua
penebalan lainnya terdiri dari zat lignin dan sellulosa.
• Untuk keperluan kultur protoplas, maka dinding primitif dan
penebalan primer yang mengandung zat-zat pectin,
protopektin dan sellulosa perlu dihilangkan.
• Protoplas terdiri dari benda-benda hidup dan benda-benda
mati.
• Protoplas dapat dibagi menjadi dua bagian, yaitu sitoplasma
dan vakuola.
• Di dalam sitoplasma terdapat plasma dasar, organela dan
sistem membrane. Plasma dasar mempunyai substansi dasar
yang terdiri dari zat protein, lemak, asam nuklein dan lain-
lain substansi yang dapat larut di dalam air.
• Yang paling penting dalam hubungannya dengan budidaya
protoplas adalah organela, sebab di dalam roganela ini
terdapat nucleus, plastid, mitokondria dan organela lainnya.
Plastida itu sendiri sebenarnya merupakan nama kelompok
butir-butir di dalam plasma yang mempunyai ukuran lebih
kecil daripada nucleus, tetapi lebih besar dari ukuran
mitokondria. Macam-macam plastid yang dikenal dengan
khloroplas, khromoplas dan leukoplas.
2. Isolasi Protoplas
• Adalah usaha untuk menghasilkan protoplas
sebanyak-banyaknya dari suatu jaringan.
• Protoplas ini dapat diperoleh dengan jalan
maserasi, yaitu pemisahan protoplas dari
dinding selnya dengan cara melarutkan
pectin dan derivatnya dengan zat-zat yang
dapat mengoksidasi.
• Untuk melarutkan zat pektin dapat memakai
pektinase, pektiolase atau macerozym,
sedangkan untuk melarutkan zat sellulosa
dapat menggunakan sellulase.
• Permasalahan yang dihadapi dalam isolasi protoplas (Soeryowinoto,
1989) adalah :
Enzim atau kombinasi enzim apa yang terbaik untuk dipakai?
Seberapa lama jaringan harus direndam dalam larutan enzim?
Babagaimana cara mensterilisasi enzim?
Pelarutan dinding sel yang terbaik dilakukan dalam gelap atau di
bawah cahaya lampu ?
Bagaimana caranya agar protoplas yang diperoleh itu utuh, tidak
pecah dan masih berfungsi?
Zat apakah yang terbaik untuk digunakan agar tidak pecah (anti
blasting)?
Berapakah konsentrasi yang terbaik agar tidak pecah ?
• Alat-alat dan bahan-bahan yang diperlukan untuk keperluan isolasi
protoplas, antara lain : plasmolyzing agent, media enzim, media
pencuci, media purifikasi, media CPM dan zat-zat kimia lainnya.
Semua bahan tersebut diseterilisasi dengan milipore filter, dan
komposisi bahan kimianya dapat dilihat dalam bab tentang media.
3. Prosedur Isolasi Protoplas
• ditampilkan gambar prosedur isolasi
protoplas (Gambar 24) beserta
keterangannya.
4. Prosedur Fusi Protoplas
• Secara alamiah fusi dapat terjadi antara sel telur dengan
sel sperma, dan antara sel sperma dengan inti kandung
lembaga.
• Sedangkan dengan teknik kultur jaringan dapat dilakukan
fusi buatan yaitu dengan cara kimiawi atau dengan cara
medan listrik.
• Dari perlakuan fusi protoplas ini dapat menghasilkan
hibrid yang somatic (hybrid parasexual), karena hibrid
yang diperoleh tidak mengalami siklus pembelahan
seperti halnya kalau kita memperoleh zygot secara
seksual.
• Di samping itu, kita juga dapat memperoleh hibrid
sitoplasmik atau sering disebut cybrid. Cybrid ini dapat
digunakan untuk transplantasi dan transformasi genetic.
• Cybrid ini diperoleh bila yang mengadakan fusi hanyalah
sitoplasmanya saja. Hal ini dapat terjadi apabila suatu
nucleus yang membelah setiap empat jam sekali
dikawinkan dengan nucleus yang membelah setiap 40 hari
sekali. Hal ini akan berakibat salah satu nucleus menjadi
mati, sehingga yang berbaur hanya sitoplasmanya saja.
Hasil selnya adalah sel satu nucleus dengan rangkaian
sitoplasma dari dua sifat. Sifat-sifat ini dapat dijumpai pada
kromosom (gen), plastid (plastidom) dan plasma
(plasmom).
• Sedangkan fusi yang sempurna adalah fusi yang terjadi baik
pada sitoplasma maupun inti selnya, yang disebut hybrid.
• Ada dua macam bentuk terjadinya fusi protoplas, yaitu
yang pertama adalah self fution (self group fution atau
group hybrid),
• Self fution yaitu bila terjadi perkawinan sendiri.
Misalnya, protopas-protoplas dari Vanda sp. Yang
bersifat tersebar saling bergabung, atau terjadinya
fusi pada protoplas-protoplas Phalaenopsis yang
protoplasnya bersifat polar atau mengumpul.
• Fusi yang kedua ialah master fution atau fusi
tundun, yang disebut cluster protoplast fution.
Fusi ini dicirikan dengan terjadinya penggabungan
protoplas yang jumlahnya 10 atau lebih banyak
lagi.
• Faktor yang dapat mempengaruhi keberhasilan
terjadinya fusi protoplas, antara lain adalah
sebagai berikut ;
Larutan enzim yang digunakan :
Bila larutan enzim yang digunakan tidak mengandung
osmoliticum stabilizer, maka dapat mengakibatkan
protoplas rusak sebelum dapat difusikan. Oleh karena itu,
perlu menggunakan sellulase dan macerozym ataupun
pektiolase.
Kondisi jaringan yang digunakan:
Jaringan yang dipergunakan untuk sumber protoplas
sebaiknya berasal dari jaringan muda (meristem), yang
berasal dari tanaman rumah kaca. Jaringan dapat juga
diambil dlapangan, tetapi keberhasilannya tentu jauh
lebih kecil daripada bila diambil dari tanaman rumah
kaca. Bila menggunakan biji steril yang ditumbuhkan
secara kultur jaringan, maka sebaiknya diambil sebelum
mencapai umur 3 minggu. Jaringan apa pun dapat
digunakan, asalkan masih sangat muda.
Waktu inkubasi dan agitasi :
Inkubasi terhadap bahan yang digunakan dilakukan setelah
diberi media enzim. Cara inkubasi harus menggunakan shaker
(mesin penggojog), namun penggojokan tidak boleh melebihi
batas waktu, sebab bila melebihi batas waktu semua protoplas
dapat hancur. Selain masalah waktu, yang perlu diperhatikan
juga adalah agatasi, sebab agatasi yang terlalu tinggi juga dapat
menghancurkan protoplas. Agitsi yang terbaik adalah antara 50
– 100 rpm.
Cara pencucian :
Perlakuan dalam fusi protoplas membutuhkan kecermatan dan
ketelitian, misalnya dalam pencucian. Cara mengambil maupun
memberi larutan harus melalui dinding tabung dengan
menggunakan pipet steril, sehingga protoplas tidak pecah
karena tekanan larutan yang terlalu keras. Selain itu, pada saat
menuang protoplas ke tabung centrifuge perlu sambil digoyang-
goyangkan dengan kedua telapak tangan.
Faktor-faktor lingkungan:
Untuk keperluan budidaya protoplas membutuhkan :
temperature 250C,
cahaya lampu neon yang cukup serta
suasana yang serba bersih atau bahkan steril
Pengujian viabilitas protoplas:
Untuk mengetahui protoplas yang mempunyai daya hidup
baik dan yang buruk, kita dapat menggunakan zat warna,
yaitu :
zat warna biasa, misalnya neutral red, metheel blue dan
evan blue. Zat warna ini biasanya digunakan 0,01% - 0,05%.
Zat warna yang fluorescens, misalnya FDA (flour diacetate)
CW (calcoflour white), FI (propidium Ioidie) dan Rhodan
contoh
 penggunaannya adalah sebagai berikut :
Apabila kita memberikan zat warna evan blue
pada protoplas, maka protoplas yang viable
(utuh) akan menyerap warna biru tersebut,
sedangkan yang tidak viable tidak dapat
menyerap warna. kemudian setelah selesai
dicuci dan dicentrifuge supaya warnanya
hilang.
Kerapatan/densitas dari protoplas :
Kerapatan protoplas di dalam suspensi yang
terbaik adalah antara 5 x 104 sampai 2 x 105
per-ml. Cara pengukuran dapat dilakukan
dengan menggunakan hemocytometer.