10/16/2013

Materi Kuliah
Bioteknologi Pertanian

TEKNIK FUSI SEL:

Isolasi Protoplasma
Fusi protoplasma

Protoplasma
Sel tanpa dinding sel
Dapat digunakan sebagai eksplan
Digunakan untuk rekayasa genetika
Paling sering untuk ekspresi transien
transformasi konifer

Digunakan untuk membuat hibrid interspesifik

Fusi Protoplas:
Mengapa menggunakan ini?
Jika secara persilangan tidak bisa dilakukan
Mengatasi tanaman yang incompatibilitas
Dimungkinkan untuk persilangan secara luas
Digunakan untuk pengenalan ciri penyakit dan
kualitas
Potensi yg sangat besar untuk masa depan jika ingin
memecahkan permsalahan yang sulit di masa kini
Protoplas juga target untuk rekayasa genetika .

10/16/2013

Terminologi dalam teknik fusi sel

Hibridisasi genetik: fusi protoplasma sel yg
berbeda jenisnya
Heterokarion: gabungan 2 atau lebih inti sel
protoplasma
Cybrid: gabungan sitoplasma 2 sel atau lebih

Perbedaan Hibrida somatik dan hibrida seksual :

Hibrida Somatik

Hibrida Seksual

1.Mempunyai organel dr
kedua sel tetua yang
bersatu dalam satu sel

Berisi organel yang

berasal dari tetua betina

2.Hasil fusi terdapat

genom inti dari kedua sel
tetua

Genom berasal dr tetua

betina dan dari tetua
jantan

3. Menghasilkan tan ploidi

2 X lipat

Ploidi sama dengan

tetuanya

Hibridisasi somatik

10/16/2013

Produksi Hibrida Melalui Fusi

Protoplas
Empat tahap untuk produksi hibrida:
Isolasi Protoplas
FusiProtoplas
Seleksi Hibrida
Regenerasi tanaman

1.

2.

3.
4.
5.

Tahapan Fusi Protoplas

Mencari prosedur yang tepat untuk isolasi
protoplas
Mencari prosedur yang tepat untuk
mendapatkan hasil fusi yang mempunyai
persentase tinggi dalam menghasilkan
heterokarion binukleat
Seleksi heterokarion setelah fusi
Kultur heterokarion dengan persentase
pembelahan sel dan regenerasi yang tinggi
Analisis karakter hibrid/sibrid dan konstitusi
genetik dari tanaman yang dihasilkan

Persyaratan fusi :
Carlson et al. (1972), Power et al. (1975) persyaratan
tumbuh diferensial hibrida untuk menghilangkan
protoplas 2 (dua) dua donor spesies
Ahli lain menggunakan senyawa kimia untuk
menyeleksi protoplas hibrida atau menghilangkan
protoplas tetua
Metode seleksi :
Menggunakan penanda genetik yang dapat dideteksi
secara visual (defisiensi klorofil)

10/16/2013

Metode Fusi Protoplas :

1. Pemilihan protoplas tetua
2. Induksi fusi secara kimia
3. Fusi secara elektrik
4. Praktek elektrofusi
5. Mikrofusi

Isolasi Protoplas secara enzimatik

Daun: lapisan epidermis dibuang
Letakkan daun dalam larutan(diberi osmotikum)
Isotonik sampai larutan yang hipertonik ringan
Biasanya mengandung mannitol atau sorbitol 500600 mM/L

Tambahkan enzim
Selulase, hemiselulase, pektinase
Terjadi degradasi dinding sel
Pencucian dan pemurnian dg sentrifugasi
Inkubasi untuk memisahkan protoplasma viabel

1. Protoplas Tetua
Asal : jaringan hipokotil/daun dari tunas kultur in vitro atau
kultur suspensi sel umur 3-5 hari
Protoplas mesopil dan hipokotil mempunyai kapasitas
regenerasi lebih baik
Enzim untuk isolasi protoplas kombinasi dari pektinase
(untuk pemisahan sel) dan selulase (penghancuran
dinding sel)
Pemilihan enzim dan lamanya penghancuran dinding sel
mempengaruhi viabilitas protoplas dan fusogenik

Pelaksanaan isolasi dan kultur protoplasma

20 ml suspensi sel, dipisahkan media dg selnya
Tambahkan 10 ml larutan enzim, campur, masukkan ke petridish
Inkubasikan 28o C 6 jam, saring dg saringan 50-100 m
Pindahkan filtrat ke dalam tabung centrifuge, cuci dg
menambahkan 5ml washing medium melalui filter
Centrifuge larutan pada 155xg selama 5 menit
Buang supernatan, ulangi sentrifugasi, tambah 10 ml float
medium, centrifuge lagi pada 155xg selama 5 menit
Ambil larutan terkeruh, tambah 5 ml media kultur, centrifuge lagi
Supernatant dibuang, tambah media kultur 5 ml, hitung kerapatan
protoplasma dg haemacytometer (1x100000)/ml
Teteskan protoplasma ke petridish yg diberi kertas saring lembab
Inkubasi di cahaya rendah, tambahkan 100 ul media kultur setelah
7-10 hari

10/16/2013

Media kultur protoplasma

Umumnya menggunakan media MS atau B5
dan modifikasinya
Diberi larutan osmotikum: manitol atau
sorbitol 500-600 mM/L
Penambahan 1 mM/L CaCl2 meningkatkan
pembelahan sel
ZPT: auksin & sitokinin utk inisiasi
Auksin yg digunakan: 2,4 D atau NAA
Sitokinin yg digunakan: BAP, Kinetin, 2i-P

2. Induksi Fusi secara Kimiawi

Membran protoplas bermuatan negatif dan
protoplas menjadi saling tolak menolak
berdekatan mengubah pH medium dg
polikation atau efek dehidrasi
PEG menyebabkan aglutinasi
(penggumpalan), tergantung suhu medium,
BM PEG, konsentrasi dan lama perlakuan PEG
Galur sel mempengaruhi optimasi fusi.
Protoplas dg vakuola kecil lebih mudah fusi
dibandingkan dg bervakuola besar

Hasil isolasi protoplasma

Protoplas
ma dalam
larutan

Daun plantlet kentang sbg

sumber protoplasma

FUSI PROTOPLAS:
Tidak terjadi secara spontan
Selain bisa diinduksi dengan menambah
promotor fusi berupa senyawa kimia PEG, juga
bisa diinduksi secara elektrik atau diberi virus
Tiga kemungkinan produk hasil fusi:
Sel A=Sel A
Sel B=Sel B
Sel A=Sel B

Inti biasanya tidak berfusi (sel heterokarion)

10/16/2013

Sel A

Tambahkan Enzim

Sel B

Tambah Promotor Fusi

PROTOPLASMA
DILIHAT DI BAWAH
MIKROSKOP

HASIL FUSI
PROTOPLASMA

10/16/2013

Seleksi dan kultur heterokarion

1. Penanda yang dapat dilihat
Misal :
fluorochrome klorofil berwarna merah (mesofil)
fluorescein diaceate kloroplas hijau kekuningan
(kloroplas)
2. Sortasi sel menggunakan flowcytometer (pemilih
sel yang diaktifkan dengan fluoresen)
3. Penanda biokimia menggunakan nitrat sebagai
sumber nitrogen planlet yang tumbuh sebagai
hibrid
4. Kultur heterokarion sangat tergantung materi
yang difusikan

Regenerasi Protoplasma
menjadi plantlet
Osmotikum digunakan untuk proteksi osmotik dalam media
kultur
Dalam seminggu-10 hari, protoplasma viable telah
meregenerasikan dinding selnya dan membelah diri
Tekanan osmose media

perlahan-lahan diubah dg cara

meneteskan media tanpa manitol atau sorbitol

Tekanan osmose media apbl tdk diubah, maka tekanan

osmose media yg tinggi akan menghambat pembelahan sel

Terjadi ketidakstabilan genetik dan atau kromosom

Menghasilkan tanaman bebas patogen
KULTUR
PROTOPLASMA
UNTUK MERAKIT
TANAMAN
HIBRIDA

Regenerasi
protoplasma menjadi
plantlet bersifat
hibrida

Contoh Fusi Protoplas: Hibrida Intergenerik

Wortel X Aegopdium

Kedelai X Alfalfa

Wortel X Barlei

Kedelai X Barlei

Wortel X Petunia

Kedelai X Jagung

Wortel X Tembakau

Kedelai X Meadow Saffron

Jagung X Oat

Kedelai X Pea

Jagung X Sorghum

Kedelai X Tembakau

Petunia X Fava Bean

Kedelai X Rape

Petunia X Parthenocissus

Tomat X Kentang

10/16/2013

Contoh Fusi Protoplas : Hibrida interspesifik

Dacus carota

X D. capillifplius

Datura innoxia

X D. discolor

Datura innoxia

X D. stramonium

Nicotiana glauca

X N. langsdorffii

Nicotiana sylvertris X N. knightiana

Nicotiana tabacum X N. debneyi
Nicotiana tabacum X N. sylvestris
Petunia hybrida

LATIHAN
Jelaskan pengertian hibridisasi somatik, fusi protoplas, variasi
somaklonal, kultur heterokarion!
Jelaskan tahapan fusi protoplas dan contoh aplikasinya!
Sebutkan beberapa cara dalam seleksi heterokarion!
Sebutkan beberapa variasi somaklonal yang terjadi pada
hibridisasi somatik!
Mengapa dalam kultur anther diperlukan konfirmasi jumlah
kromosom?
Jelaskan perbedaan hasil hibridisasi secara seksual, hibridisasi
somatik, dan tanaman sibrid! Lengkapi dengan gambar!

X P. parodii