FUSI PROTOPLAS

Dr. Dra. Exsyupransia Mursyanti, MSi

 Pendahuluan
 Dua (2) tanaman yg punya sifat yg
berbeda sel-sel protoplas didapat &
digabungkan (dilakukan fusi)propagasi
dgn kultur in-vitro tanaman baru dgn
sifat gabungan antara kedua tanaman
tersebut
 Contoh : Fusi protoplas & regenerasi hasil
fusi antara Solanum melongena dan Solanum
torvum
Somatic Hybrid Between Tomato and Potato
Steps involved in somatic hybridization
Schematic view
of symmetric
protoplast
fusion
producing
somatic hybrids
Schematic
view of
asymmetric
protoplast
fusion using
donor-
recipient
method
resulting i
nto creation
of
alloplasmic
somatic
hybrid or
cybrids
Protoplast Isolation, Fusion, and Plant Regeneration
Somatic Hybrid in Genus Putunia

First Row: Two

parental lines

2nd Row: F1 hybrid (left)

and somatic bybrid
(right)

3rd and 4th Rows:

Segregation of F2
progeny in somatic
hybrids
 FUSI PROTOPLAS (Species sama
atau berbeda)
 Spontan atau dipacu
 Induksi: zat kimia, virus, media listrik
 NaNO3 → prosentase hybrid yang diperoleh
sangat rendah
 Larutan dengan kadar tinggi Ca++ (50mmol/L
CaCl2.2H2O) dan pH tinggi (10) → berhasil pada
tembakau tetapi pH tinggi sebetulnya banyak
protoplas yang mengalami kerusakan
 PEG (BM 1000-6000) konsentrasi 25-30% →
prosentase fusi 30-35%
 Sequential stages in protoplast fusion:
(A). Two separate protoplasts
(B). Agglutination of two protoplasts
(C&D). Membrane fusion at localized site
(E and F). Development of spherical heterokaryon.
 Fusogen & Medan Listrik
Kelemahan fusogen:
1. Tidak memberikan hasil yang reprodusibel
2. Prosentase fusi rendah
Fusi dengan medan listrik → tjd 2 tahap:
1. Kontak antar membran → dielektroforesis
membran
2. Fusi membran yang bermuatan listrik pada
daerah kontak → diikuti tahap pemulihan
bentuk, fusi inti, dll
Protoplast chains during electrofusion
A very simple picture of a 2 protoplasts sticking
to one another
Protoplast fusion
 Tehnik/tahapan Fusi Protoplas
1. Persiapan eksplan
2. Penyiapan larutan enzim untuk maserasi
dan pelarutan dinding sel
3. Sterilisasi eksplan sebagai sumber
protoplas
4. Isolasi protoplas dan pencucian
5. Fusi protoplas dan kultur
 Persiapan eksplan & Larutan enzim

1. Persiapan eksplan → mesofil daun dari

seedling
2. Penyiapan larutan enzim untuk
maserasi dan melarutkan dinding sel →
harus mengandung pektinase dan
selulose/hemiselulose serta osmotic
stabilizer (manitol/sorbitol) dan Ca++
(stabilitas membran protoplas)
 Persiapan larutan enzim
Adapun komposisi larutan enzim adalah :
 1% selulose
 0,1% maserosim
 15% air kelapa
 0,5 M sukrosa
 10 mM CaCl2.H2O (sebagai tambahan)
 pH 5,8
 selanjutnya disterilisasi dengan miliporfilter →
simpan pada suhu 4 C (tidak boleh lebih dari
3 Hari)
 Tahap Sterilisasi & Isolasi Protoplas
3. Sterilisasi bahan sample dengan cara: mesofil daun dicuci
dgn tween 20 selama 1 menit → sodium hipoklorid 1-5%
selama 10 menit → bilas dgn air steril 3x
4. Isolasi protoplas dan pencucian
Epidermis dihilangkan → dipotong-potong →
dihilangkan ibu tulang daun → preplasmolizing agent 1
jam → shaker (40 rpm), gelap, suhu 25 C →
preplasmolizing diganti dng lar enzim → inkubasi 18 jam
dengan shaker, gelap, suhu 25 C → disaring dgn nilon
filter ukuran 200 m → disaring dengan nilon filter uk
80 m → suspensi masuk ke tabung sentrifuse →
sentrifuse 100g selama 3 menit → supernatan dibuang
dgn pipet scr hati-hati → ditambah lar pencuci →
protoplas akan mengapung dipermukaan → dipipet dan
diamati dibawah mikroskop
 Tahap Fusi Protoplas & Kultur
5. Fusi protoplas dan kultur
• Protoplas viable → dipipet ke tabung lain → suspensi
dgn lar pencuci (0,5 M sukrosa, 5-10 mM CaCl2.2H2O)
atau CPW → bilas lagi 1x → proses fusi dengan PEG
BM 6000 25-35%
• Komposisi larutan PEG : 0,3 M glukosa, 50mM
CaCl2.2H2O, 25-35% PEG 6000, pH 5,8
• 0,5 ml protoplas viable + 1 ml lar PEG → inkubasi 5-20
menit → apabila fusi telah banyak → larutan PEG
dipipet dari dasar tabung diganti dengan lar PEG +
CaCl2 dengan konsentrasi tinggi (1:2), inkubasi 10 menit
→ Lar PEG diganti larutan pencuci → suspensi kembali,
inkubasi 5 menit → sentrifus 3 menit → cuci dengan
larutan pencuci → kultur pada medium. Regenerasi
dinding dapat diamati dengan mikroskop UV
Macam-
macam
metode
kultur
An outline of somatic hybridization between Trovita orange
and Poncirtts trifoliata
 Asymmetric somatic hybrids were produced by
protoplast fusion between B. napus and B. nigra.
Hybrid plants were tested for resistance against
Leptosphaeria maculans (blackleg) and
Plasmodiophora brassicae (clubroot). The
chromosomal composition of hybrids was
investigated by genomic in situ hybridization
(GISH). We are aiming to produce material for
conventional breeding.
Fusion protoplast originating Plasmodiophora brassicae-
from B. napus and B. nigra infected plants:
protoplasts Left: Control plant with
symptoms
Right: Resistant hybrid plant
 Leptosphaeria maculans infected hybrid plants:
Left: Two resistant plants
The other plants show disease symptoms of different severity
 Link video
• https://www.youtube.com/watch?
v=znosURO2pcg
 Tugas Aplikasi Bioteknologi Tanaman Obat
• Silahkan upload tugas aplikasi Bioteknologi Tanaman Obat paling
lambat saat UTS makul BTO.
• Topik tidak boleh sama (Mohon dibuat list di grup wa kelas BTO).
Apabila sama maka nilai akan dibagi dengan jumlah total yang sama.
Apabila topik tidak sesuai dengan kajian BTO maka nilai tugas 0.
Apabila tidak mengumpulkan tugas atau mengumpulkan tugas terlambat
maka nilai untuk tugas ini 0
• Ketentuan yang berlaku untuk tugas:
a) Tugas bukan merupakan ringkasan dari 1 jurnal
b) Ditulis maksimal 10 halaman dalam bentuk pdf dengan spasi 1,5
c) Setiap sitasi harus ditulis referensinya (penulisan referensi sesuai dengan
ketentuan tulisan ilmiah)
d) Format penulisan bebas
e) Semakin banyak referensi/daftar pustaka yang digunakan maka nilai
akan semakin besar
Tugas Presentasi Aplikasi Kelompok 8 dan 9

• Silahkan upload tugas presentasi untuk:

1. Kelompok 8 dengan topik " Aplikasi elisitor untuk
produksi senyawa obat",
2. Kelompok 9 dengan topik "Aplikasi kultur protoplas
untuk produksi senyawa obat"
• Dalam bentuk ppt dan atau video.
• Jurnal yang dipakai juga harus di upload disitus kuliah