Bioteknologi Tanaman Obat

Faktor yang
Berpengaruh
Terhadap
Fusi Protoplas
Caroline Harisa Dini Widya Puspita
210802234
 Fusi Protoplas
Merupakan proses penggabungan dua
protoplasma atau sel menjadi satu,
menggabungkan materi genetik dari dua sel
atau organisme yang berbeda untuk
menghasilkan organisme hibrida
 Proses Fusi Protoplas
secara Umum
1. Isolasi Protoplas
2. Fusi Protoplas
2. Fusi Protoplas
Faktor-Faktor
Fusi protoplas: Oryza sativa dan Myriostachya wightiana
Eksplan: Daun muda
Fusi protoplas dengan fusagen (PEG, CaCl2, Manitol)
Faktor: Komposisi larutan enzim dan waktu inkubasi
dengan enzim, waktu inkubasi dengan fusagen
Enzim
Berpengaruh pada tahap pelisisan dinding sel pada tahap isolasi
protoplas
Berpengaruh terhadap jumlah & viabilitas hasil isolasi protoplas

Berpengaruh terhadap keberhasilan fusi protoplas

Jumlah Tidak memperoleh protoplas yang cukup untuk fusi

Viabilitas Protoplas yang berfusi adalah protoplas yang viabel
1. Isolasi Protoplas

Permukaan daun disterilisasi dengan etanol 70% dan sodium

hipoklorit 1,5%

Bilas dengan akuades steril

Epidermis atas dan bawah daun muda yang telah disterilisasi

dikupas secara perlahan dan dipotong menjadi bagian kecil

Potongan tersebut direndam dalam 10 mL 0,6 M manitol dan

diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang

Kemudian, potongan daun direndam dalam 10 mL larutan enzim

Sampel diinkubasi dalam kondisi gelap dengan shaker pada

kecepatan 150 rpm suhu 37C
Variasi Larutan Enzim:

A B C
3 % Cellulase 5 % Cellulase 10 % Cellulase
1 % Pectinase 2 % Pectinase 3 % Pectinase
1 % Macerozyme 2 % Macerozyme 3 % Macerozyme

Variasi Waktu Inkubasi dengan enzim: 1, 6, 12, 18, 24 jam

2.Determinasi jumlah dan viabilitas protoplas
dilakukan dengan pewarnaan menggunakan trypan blue dan
jumlahnya dihitung dengan hemositometer

3. Fusi protoplas

Fusagen (50% PEG 4000, 0,5 mM CaCl2, dan 0,5 M manitol) diatur
pHnya menjadi 7,5

Protoplas Oryza sativa + protoplas Myriostachya wightiana

+Fusagen

Inkubasi 90 menit, 28C. Fusi protoplas diamati setiap 15 menit

sekali
Pengaruh perbedaan komposisi enzim terhadap jumlah dan viabilitas protoplas

Pengaruh lama inkubasi terhadap jumlah dan viabilitas protoplas

Protoplas Oryza sativa. (a) Larutan Enzim A, (b) Larutan Enzim B, (c) Larutan Enzim C
Protoplas Myriostachya wightiana. (a) Larutan Enzim A, (b) Larutan Enzim B, (c) Larutan Enzim C
Pengaruh perbedaan waktu inkubasi protoplas dengan PEG terhadap hasil fusi
Fusi protoplas: Jasminum sambac dan Jasminum mesnyi
Eksplan: Daun, bunga, batang, dan kalus.
Fusi protoplas dengan fusagen (6 jenis variasi kombinasi PEG)
Faktor: Sumber eksplan, volume dan komponen larutan
enzim, waktu inkubasi dengan enzim, variasi komponen dan
waktu inkubasi dengan fusagen
1. Isolasi Protoplas
Daun
Bunga
Batang

Permukaan daun, bunga, dan batang disterilisasi dengan etanol

70% selama 1 menit

Eksplan disterilisasi dengan sodium hipoklorit 0.4-0.5% selama

30 menit

Eksplan diberi perlakuan dengan klorin 84 dan Tween 20 selama

20 menit

Eksplan dibilas dengan akuades steril 3-4 kali

 Eksplan dipotong menjadi bagian kecil dan diletakkan dalam
cawan petri

Larutan Buffer ditambahkan

Enzim ditambahkan

Inkubasi dalam shaker pada kecepatan 50 rpm pada suhu 26-30C

Kalus
Eksplan (tunas muda) dicuci dengan air dan dicuci dengan
dtergen selama 30 menit

Eksplan dibilas dengan air mengalir

Eksplan disterilisasi dengan 7% etanol 30 detik dan dibilas

dengan akuades steril 3 kali

Eksplan disterilisasi dengan 20% klorin 84 + 2 tetes Twen 20

selama 15-18 menit, kemudian
, bilas 3-5 kali

Eksplan dipotong, kemudian, dikultur dlam medium WPM

Kalus dipotong dan ditambah dengan larutan buffer, kemudian

larutan enzim

Inkubasi dalam shaker pada kecepatan 50 rpm pada suhu 26-30C

Variasi Enzim Isolasi Protoplas
1 2
1,5% Cellulase Onozuka R10 1,5% Cellulase Onozuka R10
0,4% Macerozyme R-10 0,4% Macerozyme R-10
1,5% Cellulase Onozuka RS 0,8%Pectinase
0,8%Pectinase

Komposisi buffer: 0,4 M mannitol, 0,2 M MES, 1M, CaCl2,

0,2 M KCl, 1M NaH2PO4

Variasi waktu inkubasi: 4,5,6,8, dan 10 jam

Variasi volume enzim: 2,5 mL, 5 mL dan 10 mL
2. Fusi Protoplas
Protoplas J. sambac dan J. mesnyi dicampur dengan
perbandingan 1:1

Campuran protoplas diambil 100uL, + fusagen

Sentrifugasi pada 750 rpm suhu 10C

Inkubasi pada 3 interval waktu (15, 20, 25 menit)

Variasi Fusagen Fusi Protoplas
1 2 3
30% PEG MW 4000 40% PEG MW 4000 50% PEG MW 4000
4% Sukrosa 0.1 CaCl2 10mM Manitol
10mM CaCl2.H2O 0.1 M Sorbitol 50mM CaCl2.H2O

4 5 6
30% PEG MW 6000 40% PEG MW 6000 50% PEG MW 6000
4% Sukrosa 0.1 CaCl2 10mM Manitol
10mM CaCl2.H2O 0.1 M Sorbitol 50mM CaCl2.H2O

Variasi Waktu Inkubasi: 10,20, dan 25 menit

Hasil Isolasi Protoplas
Hasil Fusi Protoplas
Fusi protoplas: Musa acuminata kultivar Gros Michel dan
SF265
Sumber protoplas: Kultur suspensi sel
Fusi protoplas denganteknik elektrik dan kimia (PEG)
Faktor: Metode fusi protoplas
Teknik elektrik
Protoplas dari kedua kultivar dicampur dengan perbandingan 1:1

Protoplas ditambah dengan larutan fusi (0,5M manitol dan

0,5mM CaCl2)

Elektroda diletakkan pada cawan petri yang berisi

protoplas+larutan fusi

Medan arus AC pada 1 MHz dan tegangan 230 V diterapkan

selama 30 detik untuk memicu protoplas saling berjajar dan
medan DC 1,5-2,3 kV diterapkan 5 mmenit untuk memicu fusi
,
protoplas

Medan A diturunkan pada 20 V untuk menjaga rantai protoplas

yang terbentuk
,

Larutan fusi diganti dengan medium kultur protoplas

Teknik kimia
Protoplas dari kedua kultivar dicampur dengan perbandingan 1:1

300 uL suspensi protoplas dimasukkan dalam cawan petri

Larutan PEG ditambahkan

Inkubasi selama 10 menit

Perbandingan Hasil Fusi
Bioteknologi Tanaman Obat
Kesimpulan
Terdapat berbagai faktor yang
berpengaruh terhadap fusi

Thank
protoplas. Pengaruhnya merujuk
pada jumlah serta viabilitasnya.
Faktor:

you!
Sumber eksplan protoplas
Komposisi dan volume
larutan enzim
Waktu inkubasi dengan
enzim
Komposisi fusagen
Waktu inkubasi dengan
fusagen
Metode fusi protoplas
Referensi
Assani, A., Chabane, D., Haicour, R., Bakry, F., Wenzel, G. dan Wehr,
B. F. 2005. Protoplast Fusion in Banana (Musa spp.): Comparison of
Chemical (PEG: Polyethylene Glycol) and Electrical Procedure. Plant
Cell Tiss Organ Cult 83, 145–151.
Kumar, M. K., Sandeep, B. V. dan Rao, P. S. 2018. Development of
salt tolerant callus cultures by somatic hybridization between
Oryza sativa and mangrove grass Myriostachya wightiana. Annals of
Agrarian Science 16 (1): 396-404.
Ahmed, M. A. A., Miao, M., Pratsinakis, E. D., Zhang, H., Wang, W.,
Yuan, Y., Lyu, M., Iftikhar, J., Yousef, A. F., Madesis, P. dan Wu, B.
Protoplast Isolation, Fusion, Culture and Transformation in the
Woody Plant Jasminum spp. Agriculture 11 (699): 1-20