KULTUR PROTOPLAS

PENDAHULUAN
Allah menciptakan Alam beserta isinya diperuntukkan
kepada Manusia, termasuk hewan dan tumbuhan.
Kewajiban manusia menjaga keseimbangan alam.
Manusia sebagai kalifah dimuka bumi selalu merekayasa
apa yang ada di alam ini untuk kepentingannya.
Khusus dibidang pertanian, mereka selalu mencari tan.
baru untuk kepentingannya, maka berkembang teknik:
- Hibridisasi Gametopik
- Mutasi Buatan Belajar dari apa yang
- Hibridisasi Somatik terjadi (disediakan)
- Rekayasa Genetika oleh alam
Isolasi Protoplas
A. Persiapan
1. Media Elusi (EM)
 Media Elution berguna untuk melepaskan sel-sel tanaman
dari jaringan menjadi sel-sel tunggal dan melarutkan
dinding sel (maserasi)
 Media terdiri dari campuran enzim sbb:
Enzim Konsentrasi (%)
Cellulose 2.0 – 2.5
Rhozyme 0.1 – 0.5
Dricellase 0.1 – 0.5
Pectinase 0.1 – 0.5

Sterilisasi enzimDengan menggunakan saringan mikro (milliphore filters)

2. Osmolytic Stabilizer (plasmolyzing agent)
 Berguna untuk mendorong terjadinya plasmolisa
 Protoplas yang diperoleh tidak rusak (masih utuh)
 Prosedur: Eksplan direndam dalam PA bbrp menit
Eksplan dipindahkan ke dalam EM
Media PA
Senyawa Konsentrasi
CaCl22H2O 5.0 mM
Na2PO42H2O 0.7 mM
MES 3.7 mM
pH 5.8
MES=2-(N-morpholine)-ethena-sulfonic acid

 Purifikasi larutan OS dengan sentrifuge 7500 rpm/5mt

 Sterilisasi dengan milliphore filters
3. Media Pencuci (WM)
 Agar membran plasma tidak rusak, suspensi protoplas
dicuci dengan larutan WM dngn cara sentrifugasi 3x
Media PA
Senyawa Konsentrasi
Mannitol 0.25 M
CaCl22H2O 0.1 M
Air Kelapa 100ml/l

 Sterilisasi dengan autoclave

B. Pelaksanaan Isolasi

1. Bahan
 Bahan yang digunakan daun yang telah sempurna
2. Sterilisasi
 Bahan yang digunakan adalah clrox 10% dicampur
tween 1 – 2 tetes tween, kemudian digoyang 10 menit.
setelah itu epidermis bawah dan atas dikikis dengan
skapel steril. Sterilisasi diulang lagi dengan
menggunakan clorox 5% selama 5 menit.

3. Inkubasi
 Irisan eksplan dicampur dengan Media Elusi (EM)
dan dishaker selama 12 jam, kecepatan 50 rpm
 Dilakukan pada ruangan gelap suhu 250C

4. Pemisahan Protoplas
 Suspensi protoplas yg terbentuk disaring dengan kain
Mary-cloth (memisahkan protoplas dg kotoran kasar)
 Hasil saringan disentrifugasi selama 2 menit, 50 rpm
5. Purifikasi (pemurnian)
 Sebelum di purifikasi, protoplas hasil saringan yang
telah disentrifugasi spt poin 4 dicuci dengan
mencampurkan endapan media WM
 Larutan sentrifugasi kembali sampai 3x(50 rpm-5mt)
 Endapan dari pencucian dicampur dengan media
PM, lalu disentrifugasi 50 rpm selama 5 mt
 Supernatan yang diperoleh merupakan protoplas
yang siap digunakan.

Permasalahan

 Protoplas harus hidup dan viabel ?

 Bagaimana menentukannya?
Penentuan protoplas yang viabel
 Menggunakan pewarna FDA (flourescence diacetic)

Bagaimana Caranya?
1. Buat larutan Stock FDA (1-5 mg dalam aceton),
disimpan suhu -50 gelap.
2. Satu tetes FDA dicampur dengan 10 ml larutan
pencuci (CPW13m)
3. Campurkan suspensi protoplas dengan larutan no.2
dengan volume yang sama
4. Periksa dengan mikroskop flourescence
protoplas yang viabel akan bercahaya
 Media CPW13m
Senyawa Dosis
KH2PO4 27.2 mg/l
KNO3 101 mg/l
CaCl2.2H20 1480 mg/l
KJ 246 mg/l
CuSO4.5H2O 0.125 mg/l
13%
Manitol
5.8
pH

 Persentase protoplas viabel :

Jumlah protoplas yang berflorensi x 100%
Total Protoplas
Fusi protoplas
 Keberhasilan fusi ditentukan oleh :
1. Jumlah (density) protoplas dalam suatu suspensi.
Kerapatan terbaik berkisar 5x 104 – 2x105.
2. Fusigent

Fusigent
 Untuk memacu fusi dapat digunakan fusigent :
A. Fusigent kimia
B. Fusigent Fisik
A. Fusigent Kimia

1. PEG
 PEG disamping dapat memacu adhesi antar protoplas,
juga dapat merusak protoplas (mengganggu ikatan
rangkap fosfolipid). PEG MW6000 dosis 41% sudah
toksik untuk kebanyakan tanaman.
 Oleh sebab itu perlu digunakan PEG yang sesuai
menurut BM dan jenis tanaman
 PEG yg tersedia di pasaran :
- PEG 1540 = BM 1300 – 1600
- PEG 4000 = BM 3000 – 3700
- PEG 6000 = BM 6000 - 7000
Empat Larutan yg harus disiapkan

1. Larutan Osmoliticum, untuk mencegah pecahnya

protoplas (Larutan 1)
2. Larutan PEG, untuk memacu fusi (larutan 2)
3. Larutan kultur (Larutan 3)
4. Larutan sumber ion Ca2+ (larutan4)
Komposisi Larutan 1
Senyawa Dosis
Sorbitol 1g
Glukosa 1g
Ca 9H2OPO4)2.2H2O 50 g
Air 100 ml
pH 5.8

Komposisi Larutan 2
Senyawa Dosis
PEG MW15409 50 g
CaCl2.2H2O 150 mg
KH2PO4 10 g
Glukosa 1g
Air 100 ml
pH 5.8
Komposisi Larutan 3
Senyawa Dosis/liter
Unsur makro
NH4NO3 250 mg
KNO3 2.5 g
CoCl2.2H2O 600 mg
MgSO4.7H2O 250 mg
NaH2PO4.2H2O 150 mg
(NH4)2 SO4 134 mg
K2CO3 75 mg
Unsur Mikro
Sequestene 330 fe 28 mg
KI 0.75 mg
H3BO3 3 mg
MnSO4.2H2O 10 mg
ZnSO4.7H2O 2 mg
Na2MoO4.2H2O 0.25 mg
CuSO4.5H2O 0.025 mg
CoCl2.6H2O 0.025 mg
Lanjutan: Komposisi Larutan 3
Senyawa Dosis/liter
Vitamin
Inositol 100 mg
Thiamin - HCl 10 mg
Nicotinamida 1 mg
Pyridoxin-HCl 1 mg
Asam Ascorbat 1 mg
Ca-Penthotonat 0.5 mg
Biotin 0.01 mg
Asam Organik
Na-Pyruvate 5 mg
Asam sitrat 10 mg
Gula
Glukosa 43 g
Fruktosa 125 mg
ZPT
2,4-D 1 mg
NAA 0.5 mg
Zeatin 0.5 mg
Lanjutan Komposisi Larutan 3
Senyawa Dosis/liter
Zat Organik Lain
L-Glutamin 350 mg
Air Kelapa 20 mg
Cholin Chlorida 0.5 mg
Asam Folat 0.2 mg
Riboflavin 0.1 mg
P-Amino benzoic asid 0.01 mg
Asam malat 10 mg
Asam fumarat 10 mg
Ribosa 125 mg
Xylosa 125 mg
 Komposisi Larutan 4
Senyawa Dosis
Glukosa 18.2 g
Glycine 1.47 g
CaCl2.2H2O 1.47 g
Air 200 ml

Prosedur
1. Masing-masing suspensi protoplas yang akan difusikan
dimasukkan ke dalam larutan 1 (kerapatan diatur
5x104 – 2x105
2. 1 ml masing-masing suspensi dicampur, disentrifuge
3. Campuran (larutan 1 dan kedua suspensi protoplas)
dibagi bagi ke dalam 0.2 ml pada petridish @ 6 tetes
4. Setelah 2-5 menit tambahkan 2 tetes larutan 2 (@ 0.2 ml
5. Campuran diinkubasi pada suhu 250C selama 10-20 mt
6. Tambahkan larutan 3, masing-masing 1 tetes
7. Setelah 15 mt tteteskan larutan 4 dan tambahkan
larutan3 hingga menggenangi alas peridish
8. Tuangkan isi petridish ke dalam tabung sentrifugasi dan
bilas petridish dengan lar 3
9. Larutan disentrifugasi selama 3 mt, 100 rpm
10. Endapan disuspensi kembali dengan larutan 3 n dituang
kan ke dalam petridish steril shg menggenangi alas
petridish dgn rata.
11. Lihat hasil dengan mikroskop dan dihitung hasil fusi
2. DMSO (Dimethylsulfoxida)
1. Protoplas yang sudah tersedia diperlakukan dengan
PEG
2. Suspensi diperlakukan lagi pada larutan alkali
3. Setelah itu diperlakukan dengan DMSO

3. DEXTRAN

1. Siapkan larutan pemacu fusi (FM1 dan FM2) dan

larutan penstabil (osmotic stabilizer)
Komposisi Larutan FM1
Senyawa Dosis
Air 100 ml
Dextran MW 500.000 15 g
NaCl 5g

Komposisi Larutan FM2

Senyawa Dosis
Air 100 ml
NaOH 0.1%
NaCl 8g

Komposisi Larutan OS
Senyawa Dosis
Manitol 5g
CaCl2.2H20 2g
Air 100 ml
2. Teteskan (2 tetes @ 0.2 ml) FM1 dalam petridish
5. Diatas tetesan FM1, tambahkan 1 tetes suspensi
protoplas (campuran 2 jenis protoplas), 2x105/ml
6. Tambahkan 2 tetes FM1 dan ratakan dengan
menggoyang memutar
7. Campuran diinkubasi selama 10-20 mt suhu 300C
8. Tambahkan satu tetes FM2, inkubasi 10-20 mt, 300C
9. Tambahkan larutan OS secukupnya (5 ml), inkubasi 1
jam suhu 50C
10. Pindahkan Larutan ke tabung sentrifuge dan
disentrifugasi selama 5 mt, 100 rpm
11. Supernatan adalah hasil fusi protoplas, lihat dgn
mikroskop
12. Protoplas yang telah berfusi dikultur pada media MS