FUSI PROTOPLAS, Variasi Somaklonal, &

Produksi Haploid

F. FUSI PROTOPLAS
Protoplasma :
• Sel tanpa dinding sel
• Dapat digunakan sebagai eksplan
• Digunakan untuk rekayasa genetika
– Paling sering untuk ekspresi transien
– transformasi konifer
• Digunakan untuk membuat hibrid interspesifik
•Masing-masing protoplas dapat disatukan/
difusikan, disebut dengan fusi protoplas
 FUSI PROTOPLAST
• Fusi protoplas adalah salah satu metode persilangan atau 
hibridisasi tanaman dengan memanfaatkan rekayasa
genetika konvensional.
• Teknik fusi protoplas dapat digunakan untuk mencampur sifat
genetik dari spesies tanaman yang sama ataupun dari spesies
yang berbeda.
• Selain itu, teknik ini menguntungkan untuk diterapkan
dalam persilangan tanaman steril ataupun tanaman
dengan siklus hidup yang panjang.
• Untuk menginduksi atau mendukung terjadinya fusi protoplas
dapat dilakukan dengan pemakaian senyawa kimia
seperti polietilen glikol (PEG) ataupun penggunaan arus
listrik untuk membantu fusi (elektrofusi).
• Ketika dua protoplas bersatu, dapat terjadi pemisahan atau
penggabungan dua inti sel (nukleus) sehingga menghasilkan
tanaman dengan sifat baru hasil pencampuran kedua tetua.
• Apabila salah satu inti sel hilang selama terjadinya fusi maka
akan dihasilkan sel baru yang disebut sitoplasmik hibrid (cybrid).
Fusi Protoplas:..............Mengapa menggunakan ini?

• Jika secara persilangan tidak bisa dilakukan

• Mengatasi tanaman yang incompatibilitas
• Dimungkinkan untuk persilangan secara luas
• Digunakan untuk pengenalan ciri penyakit dan
kualitas
• Potensi yg sangat besar untuk masa depan jika
ingin memecahkan permsalahan yang sulit di masa
kini
• Protoplas juga target untuk rekayasa genetika .
Persyaratan fusi :
Carlson et al. (1972), Power et al. (1975)
– persyaratan tumbuh diferensial hibrida untuk
menghilangkan protoplas 2 (dua) donor spesies

Ahli lain
– menggunakan obat-obatan untuk menyeleksi protoplas
hibrida atau menghilangkan protoplas tetua

Metode seleksi :
Menggunakan penanda genetik yang dapat dideteksi
secara visual (defisiensi klorofil)
Hibridisasi somatik
 TEKNIK HIBRIDISASI SOMATIK

1. Isolasi protoplas

2. Fusion protoplasts dari spesies/varieties yg berbeda

3. Identifikasi Dan Seleksi sel hibrid somatik

4. Sell ditumbuhkan

5. Regenerasi menjadi tanaman hibrid

PERBEDAAN PERSILANGAN TAN KONVENSIONAL, FUSI
PROTOPLAS DAN TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
Perbedaan Hibrida somatik dan hibrida seksual :

Hibrida Somatik Hibrida Seksual

1.Mempunyai organel dr Berisi organel yang
kedua sel tetua yang berasal dari tetua betina
bersatu dalam satu sel
2.Hasil fusi terdapat Genom ½ berasal dr tetua
genom inti dari kedua sel betina dan ½ dari tetua
tetua jantan
3. Menghasilkan tan ploidi Ploidi sama dengan
2 X lipat tetuanya
Tahapan Fusi Protoplas
1. Mencari prosedur yang tepat untuk isolasi protoplas
2. Mencari prosedur yang tepat untuk mendapatkan
hasil fusi yang mempunyai persentase tinggi dalam
menghasilkan heterokarion binokleat
3. Seleksi heterokarion setelah fusi
4. Kultur heterokarion dengan persentase pembelahan
sel dan regenerasi yang tinggi
5. Analisis karakter hibrid/sibrid dan konstitusi genetik
dari tanaman yang dihasilkan
Metode Fusi Protoplas :

1. Pemilihan protoplas tetua

2. Induksi fusi secara kimia
3. Fusi secara elektrik
4. Praktek elektrofusi
5. Mikrofusi
1. Protoplas Tetua
• Asal : jaringan hipokotil/daun dari tunas
kultur in vitro atau kultur suspensi
• Protoplas mesopil dan hipokotil mempunyai
kapasitas regenerasi lebih baik
• Enzim untuk isolasi protoplas kombinasi
dari pektinase (untuk pemisahan sel) dan
selulase (penghancuran dinding sel)
• Pemilihan enzim dan lamanya
penghancuran dinding sel mempengaruhi
viabilitas protoplas dan fusogenik
2. Induksi Fusi secara Kimiawi
• Membran protoplas bermuatan negatif dan
protoplas menjadi saling tolak menolak 
berdekatan  mengubah pH medium dg
polikation atau efek dehidrasi
• PEG – menyebabkan aglutinasi (penggumpalan),
tergantung suhu medium, BM PEG, konsentrasi
dan lama perlakuan PEG
• Galur sel mempengaruhi optimasi fusi. Protoplas
dg vakuola kecil lebih mudah fusi dibandingkan
dg bervakuola besar
Seleksi dan kultur heterokarion
1. Penanda yang dapat dilihat
Misal :
fluorochrome – klorofil berwarna merah (mesofil)
fluorescein diaceate – kloroplas hijau kekuningan
(kloroplas)
2. Sortasi sel menggunakan flowcytometer (pemilih
sel yang diaktifkan dengan fluoresen)
3. Penanda biokimia menggunakan nitrat sebagai
sumber nitrogen  planlet yang tumbuh sebagai
hibrid
4. Kultur heterokarion  sangat tergantung materi
yang difusikan
• Terjadi ketidakstabilan genetik dan atau kromosom
• Menghasilkan tanaman bebas patogen

Contoh Fusi Protoplas: Hibrida Intergenerik

Wortel X Aegopdium
Wortel X Barlei
Wortel X Petunia
Wortel X Tembakau
Jagung X Oat
Jagung X Sorghum
Petunia X Fava Bean
Petunia X Parthenocissus
Kedelai X Alfalfa
Kedelai X Barlei
Kedelai X Jagung
Kedelai X Meadow Saffron
Kedelai X Pea
Kedelai X Tembakau
Kedelai X Rape
Tomat X Kentang
Contoh Fusi Protoplas : Hibrida interspesifik
Dacus carota X D. capillifplius
Datura innoxia X D. discolor
Datura innoxia X D. stramonium
Nicotiana glauca X N. langsdorffii
Nicotiana sylvertris X N. knightiana
Nicotiana tabacum X N. debneyi
Nicotiana tabacum X N. sylvestris
Petunia hybrida X P. parodii
 G. Variasi Somaklonal
• Defisiensi Klorofil
• Perubahan Morfologi
• Mutasi Gen Tunggal
• Poliploid
• Modifikasi hasil dan kualitas hasil
• Ketahanan hama dan penyakit

Kultur somaklonal memberikan pengertian tentang fisiologi,

biokimia, genetika, pertumbuhan, perkembangan spesies
tanaman pada tingkat molekuler
Mekanisme terjadinya mutasi gen tunggal pada
variasi somaklonal :
1. Aktivasi elemen transposable
2. Aktivasi dan inaktivasi gen dengan perubahan metilasi DNA
3. Amplifikasi gen dan deplesi gen
4. Mitotic crossing over

Perubahan pada siklus sel :

1. Sintesis DNA sampai G2
2. G2 sampai profase
3. Profase sampai prometafase
4. Metafase
Variasi somaklonal :
keragaman genetik dari tanaman yang dihasilkan melalui
kultur jaringan
a. Sel somatik (sel daun/akar) variasi somaklonal,
tanaman = SOMAKLON
b. Sel gamet variasi gametoklonal (GAMETOKLON)
c. Kalus (KALIKLON)
d. Protoplas (PROTOKLON)

Prospek & Potensi Rekayasa Somaklonal :

1. Skrinning Keragaman
2. Pemeliharaan Plasma Nutfah
3. Propagasi
TEKNIK PROPAGASI SOMATIS
KULTUR KALUS
 Yaitu membiakkan sekelompok sel yang berasal dari jaringan
tanaman yang tumbuh dalam medium hara
 Medium : garam anorganik, sumber karbon (sukrosa), auksin,
sitokinin, ZPT (2,4D)
 Karakter yang muncul bukan dari genetik asal (epigenetik)
 Faktor-2 yang dapat diseleksi dalam kultur
sering tidak dapat dikaitkan dengan karakter
yang diinginkan pada tanaman utuh.
 Sebaliknya, karakter-2 yang diinginkan
untuk diseleksi oleh breeder tidak dapat
diseleksi dalam kultur.
 Hasil tanaman merupakan salah satu faktor
yang sulit untuk diseleksi secara somaklonal
• Hasil tanaman merupakan karakter multigenik
dan merupakan fungsi Genotip * Lingkungan.
Dari 65 galur kentang yang diuji tidak ada sifat-2
yang diseleksi secara langsung berkaitan dengan
peningkatan hasil umbi

• Kultivar potensial baru yang dikembangkan

melalui kultur somaklonal adalah klon tebu tahan
penyakit. Setelah uji lapang, pucuk tanaman
lemah. Klon tersebut, tidak dapat dilepas untuk
tujuan komersial, kecuali sebagai tetua plasma
nutfah dalam program pemuliaan
2. KULTUR SUSPENSI SEL
• Merupakan kultur yang terdiri ari sel-sel tunggal
atau segregat sel kecil dalam medium cair
• Wadah kultur dirotasikan atau digoyang untuk
membentuk dan mempertahankan penyebaran sel
dan memungkinkan terjadinya pertukaran gas
antara sel-sel dengan komponen gas lingkungan
• Tahapan :
a. Sistem kultur kalus
b. Pemindahan ke medium cair
c. Diinkubasikan pada media penggoyang
Dari 100 ml biakan mengandung 107 sel untuk
seleksi, memberikan harapan dan frustasi
kepada breeder karena secara sitologis :
a.Sumber mutan baru yang
berharga(monosomik/trisomik)
b.Tidak stabil, kehilangan sebagian/seluruh
kromosom sehingga mempersulit
perbanyakan genotip
3. KULTUR ANTHER DAN SERBUK SARI
 Digunakan untuk menghasilkan tanaman
monoploid/ haploid
 Mutasi bersifat resesif, sehingga tidak terdeteksi
dalam keadaan diploid/poliploid
 Tujuan : menghasilkan tanaman diploid
homosigot total melalui penggandaan
komplemen kromosom monoploid
 Frekuensi haploid di luar sistem kultur cukup
tinggi
Anther/Microspore Culture
 Tidak boleh berasumsi bahwa semua
sel/planlet yang dihasilkan dari kultur anther
adalah haploid/ monoploid, perlu konfirmasi
jumlah kromosom

 Keberhasilan membuat somaklonal haploid

tergantung pada kultivar tanaman (cabe, gandum).
Kondisi optimum untuk keberhasilan monoploid :
a. Tahap perkembangan mikrospora
b. Komposisi media
c. Praperlakuan anther
d. Sumber, kondisi, umur tanaman saat anther
diambil
 Galur homosigot dapat diperoleh
dengn penggandaan jumlah kromosom
haploid, cara konvensional dengan
selfing (S5-S6).
 Terjadi ketidakstabilan genetik,
dikulturkan lebih lama menimbulkan
instabilitas yang besar.
4. KULTUR EMBRIO
Paling awal dikembangkan untuk memperoleh
hibrida intergenerik/intersepesifik
Embrio dari biji yang sedang berkembang
dibiakkan dalam medium cair/padat dalam
lingkungan terkendali
Kegunaan : menolong embrio hasil
persilangan seksual antara spesies/genera yang
berkerabat jauh yang inkompatibel karena
mengalami keguguran
 Faktor kritis yang Kombinasi Sifat
menyebabkan
Ketahanan
kegagalan siklus
perkembangan N.tabacum X N. repanda TMV
embrionik berupa S. tuberosum X S. brevidens PLRV
kehilangan endosperm S. melongena X S. pimpinellifolium Fusarium
atau jumlah nutrisi S. melongena X S. sisymberifolium Nematoda
embrio tidak memadai.
L. esculentum x L. pennelli Drought
 Manfaat :
menghasilkan tanaman B. napus X B. nigra Phoma
haploid dan triploid, B. napus X Sinapsis alba Alternaria
membuat anggur tanpa B. napus X Eruca sativa Drought
biji, mengatasi L. sativa X L. perennis Bremia
dormansi biji

 Contoh hibrida somatik

dengan sifat agronomis
yang menarik :
PERBEDAAN PERSILANGAN TAN KONVENSIONAL, FUSI
PROTOPLAS DAN TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
 BIOTEKNOLOG
KONVENSIONAL
I MODERN

KELEBIHAN KEKURANGAN KELEBIHAN KEKURANGAN

Relatif murah Perbaikan sifat Perbaikan sifat Relatif mahal

genetik tidak genetik terarah
terarah

Teknologi relatif Tidak dapat Dapat mengatasi Teknologi canggih

sederhana mengatasi inkompatibilitas
inkompatibilitas

Dampak jangka Hasil tidak dapat Menghasilkan Ampak jangka

panjang dapat diprakirakan jasad baru dengan panjang belum
diprediksi (sistem sebelumnya sifat baru yang diketahui
mapan) tidak ada pada
jasad alami

Memerlukan waktu Memperpendek

relatif lama pengembangan
jasad baru
Sering tidak dapat Meningkatkan
mengatasi kendala kualitas dan
alam (hama) kendala alam
 LATIHAN
• Jelaskan pengertian hibridisasi somatik, fusi
protoplas, variasi somaklonal, kultur heterokarion!
• Jelaskan tahapan fusi protoplas dan contoh
aplikasinya!
• Sebutkan beberapa cara dalam seleksi
heterokarion!
• Sebutkan beberapa variasi somaklonal yang terjadi
pada hibridisasi somatik!
• Mengapa dalam kultur anther diperlukan
konfirmasi jumlah kromosom?
• Jelaskan perbedaan hasil hibridisasi secara seksual,
hibridisasi somatik, dan tanaman sibrid! Lengkapi
dengan gambar!