Teori Totipotensi

Teori totipotensi ini dikemukakan oleh G. Heberlandt tahun 1898. Dia adalah seorang ahli fisiologi yang berasal dari Jerman. Pada tahun 1969, F.C. Steward menguji ulang teori tersebut dengan menggunakan objek empulur wortel. Dengan mengambil satu sel empulur wartel, F.C. Steward bisa menumbuhkannya menjadi satu individu wortel.
Teori dasar dari kultur in vitro ini adalah Totipotensi.Teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat berkebang biak.karena seluruh bagian tanaman terdiri atas jaringan - jaringan hidup. Totipotensi dalam biologisel menunjukkan kemampuan suatu sel untuk dapat

memperbanyak diri dalam keseluruhan (total) kemungkinan perkembangan yang dimungkinkan. Kata sifat totipoten lebih banyak dipakai. Sel punca, termasuk zigot, memiliki kemampuan ini. Pada tumbuhan, sel meristem yang berada pada titik tumbuh juga memiliki kemampuan ini. Kemampuan totipotensi dapat diubah dengan mengganti lingkungan hidup/tumbuh sel. Modifikasi osmotik, nutrisi, hormon, atau sumber energi yang dipaparkan pada sel dapat mengubah sifat ini menjadi pluripoten ("banyak potensi"), multipoten ("berbagai potensi"), atau unipoten ("tunggal potensi"). Sel yang pluripoten memiliki kemampuan berubah yang masih banyak, multipoten hanya beberapa, dan unipoten adalah bentuk sel yang telah terspesifikasi. Prasyarat Melakukan Totipotensi Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat untuk mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Ada dua penggolongan media tumbuh: media padat dan media cair. Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar. Nutrisi dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan.

PENGERTIAN TENTANG KULTUR JARINGAN

Menurut Suryowinoto (1991), kultur jaringan dalam baha asing disebut sebagai tissue culture. Kultur adalah budidaya dan jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. jadi, kultur jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat seperti induknya. Kultur jaringan akan lebih besar presentase keberhasilannya bila menggunakan jaringan meristem. Jaringan meristem adalah jaringan muda, yaitu jaringan yang terdiri dari sel-sel yang selalu membelah, dinding tipis, plasmanya penuh dan vakuolanya kecil-kecil. Kebanyakan orang menggunakan jaringan ini untuk tissue culture. Sebab, jaringan meristem keadaannya selalu membelah, sehingga diperkirakan mempunyai zat hormon yang mengatur pembelahan. Teknik kultur jaringan sebenarnya sangat sederhana, yaitu suatu sel atau irisan jaringan tanaman yang sering disebut eksplan secara aseptik diletakkan dan dipelihara dalam medium pada atau cair yang cocok dan dalam keadaan steril. dengan cara demikian sebaian sel pada permukaan irisan tersebut akan mengalami proliferasi dan membentuk kalus. Apabila kalus yang terbentuk dipindahkan kedlam medium diferensiasi yang cocok, maka akan terbentuk tanaman kecil yang lengkap dan disebut planlet. Dengan teknik kultur jaringan ini hanya dari satu irisan kecil suatu jaringan tanaman dapat dihasilkan kalus yang dapat menjadi planlet dlama jumlah yang besar. Pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman ini berdasarkan teori sel seperti yang dikemukakan oleh Schleiden, yaitu bahwa sel mempunyai kemampuan autonom, bahkan mempunyai kemampuan totipotensi. Totipotensi adalah kemampuan setiap sel, darimana saja sel tersebut diambil, apabila diletakkan dilingkungan yangsesuai akan tumbuh menjadi tanaman yang sempurna. Teknik kultur jaringan akan berhasil dengan baik apabila syarat-syarat yang diperlukan terpenuhi. Syarat-syarat tersebut meliputi pemilihan eksplan sebagai bahan dasar untuk pembentukkan kalus, penggunaan medium yang cocok, keadaan yang aseptik dan pengaturan udara yang baik terutama untuk kultur cair. Meskipun pada prinsipnya semua jenis sel dapat ditumbuhkan, tetapi sebaiknya dipilih bagian tanaman yang masih muda dan mudah tumbuh yaitu bagian meristem, seperti: daun muda, ujung akar, ujung batang, keping biji dan sebagainya. Bila menggunakan embrio bagian bji-biji yang lain sebagai eksplan, yang perlu diperhatikan adalah kemasakan embrio, waktu imbibisi, temperatur dan dormansi. MANFAAT KULTUR JARINGAN Kegunaan utama dari kultur jaringan adalah untuk mendapatkan tanaman baru dalam jumlah banyak dalam waktu yang relatif singkat, yang mempunyai sifat fisiologi dan morfologi sama

persis dengan induknya. Dari teknik kultur jaringan tanaman ini diharapkan juga memperoleh tanaman baru yang bersifat unggul. Secara lebih rinci dan jelas berikut ini akan dibahas secara khusus kegunaan dari kultur jaringan terhadap berbagai ilmu pengetahuan. Perbanyakan tanaman secara besar-besaran telah dibuktikan keberhasilannya pada perkebunan kelapa sawit dan tebu. Dengan car kultur jaringan dapat klon suatu komoditas tanaman dalam relatif cepat. Manfaat yang dapat diperoleh dari kloning ini cukup banyak, misalnya: di luar pulau Jawa akan didirikan suatu perkebunan yang membutuhkan bibit tanaman dalam jumlah ribuan, maka sudah dapat dibayangkan betapa mahalnya biayanya hanya untuk trasnportasi saja. Hala ini dapat diatasi denga usaha kloning melalui budaya jaringan, karena hanya perlu membawa beberapa puluh botol planlet yang berisi ribuan bibit. Dengan cara ini dapat menghemat waktu dan biaya yang cukup banyak dalam persiapan pemberangkatan ataupun transportasinya. Pada ekspor anggrek, misalnya, orang luar negeri menghendaki bunga anggrek yang seragam baik bentuk maupun warnanya. Dalam hal ini dapat dipenuhi juga dengan usaha kloning. Bibit-bibit tanaman dari usaha mericlono (tanaman hasil budidaya meristem) akan berharga lebih mahal, karena induknya dipilih dari tanaman yang mempunyai sifat paling bagus (unggul). Teori Dasar Kultur Jaringan 1. Sel dari suatu organisme multiseluler di mana pun letaknya, sebenarnya sama dengan sel zigot karena berasal dari satu sel tersebut (Setiap sel berasal dari satu sel). 2. Teori Totipotensi Sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman lengkap. Kultur jaringan tanaman telah dikenal banyak orang sebagai usaha mendapatkan varietas baru (unggul) dari suatu jenis tanaman dalam waktu yang relatif lebih singkat dari pada dengan cara pemuliaan tanaman yang harus dilakukan penanaman secara berulang-ulang sampai beberapa generasi. Untuk mendapatkan varietas baru melalui kultur jaringan dapat dilakukan dengan cara isolasi protoplas dari 2 macam varietas yang difusikan. Atau dengan cara isolasi khloroplas suatu jenis tanaman yang dimasukkan kedalam protoplas jenis tanaman yang lain, sehingga terjadi penggabungan sifat-sifat yang baik dari kedua jenis tanaman tersebut hingga terjadi hibrid somatik. Cara yang lain adalah dengan menyuntikkan protoplas dari suatu tanaman ketanaman lain. Contohnya transfer khloroplas dari tanaman tembakau berwarna hijau ke dalam protoplas tanaman tembakau yang albino, hasilnya sangat memuaskan karena tanaman tembakau menjadi hijau pula.

Contoh lain adalah keberhasilan mentrasnfer khloroplas dari tanaman jagung ke dalam protoplas tanaman tebu hasilnya memuaskan (Anik Herawati, 1991). Khloroplas yang ditransfer harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut: 1. 2. Sewaktu dilakukan isolasi, khloroplas harus sempurna. Setelah diisolasi harus mempuyai sifat yang sama dengan khloroplas yang tumbuh secara in vivo (budidaya biasa). 3. Setelah diisolasi masih mempunyai sifat atau aktivitas fotosintesa yang cukup tinggi. Contoh isolasi protoplas dalam budidaya jaringan yang sangat berguna adalah ditemukannya sun-chlorella (jenis ganggang). Ganggang ini secara enzimatis dijadikan protoplas (sel-selnya ditelanjangi dengan cara diinkubasikan dalam enzim medium sehingga dinding selnya larut), kemudian dikeringkan dibawah sinar matahari. Protoplas tersebut selanjutnya dipecah hingga didapatkan khloroplas dan akhirnya dibuat pil-pil untuk pengobatan.

Menciptakan varietas baru dapat pula dilakukan dengan menggunakan bantuan jenis bakteri seperti bakteri penyebab tumor yang disebut Agrobacterium tumifaciens. Bakteri ini disuntikkan pada tanaman sehat mempunyai buah ukuran besar, agar tanaman sehat tersebut menjadi sakit tumor. Bakteri yang berada dalam jaringan yang menonjol karena terkena tumor tersebut kemudian diambil dan disuntikkan kedalam tanaman lain yang ukuran buahnya kecil-kecil. Dengan cara ini terbukti bahwa tidak lam kemudian tanaman tersebut menghasilkan buah yang ukurannya besar. Hal ini membuktikan bahwa bakteri yang dipindahkan tersebut membawa sifat keturunan yang ada pada tanaman semula. Sedangkan untuk mendapatkan yang baru yang tahan terhadap stress garam, pestisida tertentu, logam berat, suhu rendah atau tinggi dan sebagainya dapat dilakukan dengan cara-cara khusus. Menciptakan tanaman baru yang toleran terhadap stress garam pernah dilakukan oleh Handa dkk. (Suryowinoto, 1985) yaitu terhadap tanaman tomat dan tembakau. Pada penelitian ini menggunakan penambahan PEG (Poly Ethilen- Glycol) atau NaCL, yang biasa dipergunakan untuk mendapatkan kultivar yang toleransi terhadap garam. Beberapa jenis tanaman ada yang teramcam punah (endangered species), misalnya berbagai jenis tanaman pisang, tanaman melati, kenanga, kayu jati, dan kayu putih. Usaha yang paling tepat untuk melestarikan tanaman yang terancam punah adalah dengan jalan kloning. Dengan usaha

kloning ini, populasi dari tanaman tersebut akan terselamatkan, bahkan dapat bertambah, sekaligus sifat-sifat yang dimiliki oleh tanaman tersebut tetap terjamin. Kultur jaringan juga mempunyai manfaat yang besar dibidang farmasi, karena dari usaha ini dapat dihasilkan metabolit skunder upaya untuk pembuatan obat-obatan, yaitu dengan memisahkan unsur-unsur yang terdapat di dalam kalus ataupun protokormus, misalnya alkoloid, steroid, dan terponoid. Dengan ditemukannya cara mendapatkan metabolit skunderdari kalus suatu eksplan yang di tumbuhkan dalam medium kultur jaringan, mak berarti dapat menghemat waktu dan tenaga. Dengan cara biasa, untuk mendapatkannya harus menunggu lama samapai tanaman cukup umur bahkan sampai berproduksi hingga bertahun-tahun. Sedangkan dengan teknik kultur jaringan hanya membuthkan waktu antara tiga minggu sampai satu bulan saja. Metabolit yang dihasilkan dari kalus ternyata juga memiliki kadar yang lebih tinggi daripada dengan cara biasa (langsung dari tanaman). Dengan cara pengambilan metabolit skunder dari kalus, biasanya selalu diperoleh kandungan lain yang lebih banyak jenisnya, karena seringkali timbul zat-zat alkaloid atau persenyawaanpersenyawaan lainnya yang sangat berguna untuk pengobatan. Persenyawaan yang bermanfaat yang diambil dari kalus dapat ditingkatkan kadarnya dengan cara memanipulasinya, antara lain: 1. 2. 3. Memakai medium lain yang sesuai. Mengubah salah satu kadar komponen dalam medium. Memberi zat tambahan tertentu ke dalam medium, misalnya penambahan zat pengatur tumbuh auksin ataupun sitokinin. Kultur jaringan juga memberikan masukkan atau informasi pengetahuan yang sangat bermanfaat dibidang fisiologi tanaman. Pada tanaman anggrek misalnya, telah berhasil diketahui bahwa jika ujung akarnya diiris melintang akan memperlihatkan warna tertentu. Warna tersebut nantinya akan sama dengan warna bunganya. Hal ini sangat berguna dalam bidang perdangan bunga hias, sebab walaupun tanamannya belum berbunga orang sudah dapat mengetahui warna bunga yang akan muncul. Melalui perbanyakan vegetatif dengan kultur jaringan ternyata juga berpengaruh terhadap devisa negara. Misalnya, denagn terlaksananya ekspor tanaman anggrek ke negara lain, maka akan menaikkan devisan negara dibidang pertanian. Teknik kultur jaringan sampai saat ini memang belum biasa dilaksanakan oleh para petani, baru beberapa kalangan pengusaha swasta saja yang sudah mencoba melaksanakannya, karena

pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman memerlukan keterampilan khusus dan harus diltar belakangi dengan ilmu pengetahuan dasar tentang fisiologi tumbuhan, anatomi tumbuhan, biologi, kimia dan pertanian. Dengan demikian jelas akan amat sulit untuk diterima oleh kalangan petani biasa. Di samping itu, pelaksanaan teknik kultur jaringan mutlak memerlukan laboratorium khusus, walaupun dapat di usahakan secara sederhana (dalam ruang yang terbatas), namun tetap memerlukan peralatan yang memadai. Kemungkinan lain petani akan merasa enggan bekerja secara aseptik. Karena semua pekerjaan harus dilaksanakan secara hatri-hati dan cermat serta memerlukan kesabaran yang tinggi. Biaya untuk mewujudkan perbanyakan tanaman cecara in vitro ini juga sangat mahal, kecuali kita meramu medium sendiri. Bila kia terpaksa harus membeli medium yang sudah jadi (dalam kemasan) jelas akan sangat mahal, sebab medium yang sudah jadi masih harus di impor dari luar negeri. Apalagi kita harus membeli saran untuk perlakuan isolasi dan fusi protoplas, tentu biayanya akan bertambah besar. Enzim-enzim yang digunakan dalam kultur jaringan juga masih dibeli dari luar negeri sepertti Jepang. Lepas semua dari kendala-kendala tersebut diatas, kita harus mengakui bahwa teknik kultur jaringan sangat bermanfaat bagi dunia ilmu pengetahuan, terutama untuk pengembangan bioteknologi.

Aplikasi Teknik Kultur Jaringan dalam Bidang Agronomi 1. Perbanyakan vegetatif secara cepat (Micropropagation). 2. Membersihkan bahan tanaman/bibit dari virus 3. Membantu program pemuliaan tanaman (Kultur Haploid, Embryo Rescue, Seleksi In Vitro, Variasi Somaklonal, Fusiprotoplas, Transformasi Gen /Rekayasa Genetika Tanaman dll). 4. Produksi metabolit sekunder. 1. 1. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Regenerasi Bentuk Regenerasi dalam Kultur In Vitro : pucuk aksilar, pucuk adventif, embrio somatik, pembentukan protocorm like bodies, dll

2.

Eksplan ,adalah bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk perbanyakan tanaman. Faktor eksplan yang penting adalah genotipe/varietas, umur

eksplan, letak pada cabang, dan seks (jantan/betina). Bagian tanaman yang dapat digunakan sebagi eksplan adalah pucuk muda, batang muda, daun muda, kotiledon, hipokotil, endosperm, ovari muda, anther, embrio, dll.

3.

Media Tumbuh

Di dalam media tumbuh mengandung komposisi garam anorganik, zat pengatur tumbuh, dan bentuk fisik media. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan, antara lain: Murashige dan Skoog (MS), Woody Plant Medium (WPM), Knop, Knudson-C, Anderson dll. Media yang sering digunakan secara luas adalah MS.

4.

Zat Pengatur Tumbuh Tanaman

Faktor yang perlu diperhatikan dalam penggunaan ZPT adalah konsentrasi, urutan penggunaan dan periode masa induksi dalam kultur tertentu. Jenis yang sering digunakan adalah golongan Auksin seperti Indole Aceti Acid(IAA), Napthalene Acetic Acid (NAA), 2,4-D, CPA dan Indole Acetic Acid (IBA). Golongan Sitokinin seperti Kinetin, Benziladenin (BA), 2I-P, Zeatin, Thidiazuron, dan PBA. Golongan Gibberelin seperti GA3. Golongan zat penghambat tumbuh seperti Ancymidol, Paclobutrazol, TIBA, dan CCC.

5.

Lingkungan Tumbuh

Lingkungan tumbuh yang dapat mempengruhi regenerasi tanaman meliputi temperatur, panjang penyinaran, intensitas penyinaran, kualitas sinar, dan ukuran wadah kultur.
Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah : 1) Pembuatan media 2) Inisiasi 3) Sterilisasi 4) Multiplikasi

5) Pengakaran 6) Aklimatisasi

Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf.

Biasanya, komposisi media yang digunakan adalah sebagai berikut :

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 1.

2.

Ammonium nitrate (NH4NO3) 1,650 mg/l Boric acid (H3BO3) 6.2 mg/l Calcium chloride (CaCl2 H2O) 440 mg/l Cobalt chloride (CoCl2 6H2O) 0.025 mg/l Magnesium sulfate (MgSO4 7H2O) 370 mg/l Cupric sulfate (CuSO4 5H2O) 0.025 mg/l Potassium phosphate (KH2PO4) 170 mg/l Ferrous sulfate (FeSO4 7H2O) 27.8 mg/l Potassium nitrate (KNO3) 1,900 mg/l Manganese sulfate (MnSO4 4H2O) 22.3 mg/l Potassium iodine (KI) 0.83 mg/l Sodium molybdate (Na2MoO4 2H2O) 0.25 mg/l Zinc sulfate (ZnSO4 7H2O) 8.6 mg/l Na2EDTA 2H2Oa 37.2 mg/lb Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas.
Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril.

3.

Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.

4.

Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).

5.

Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit

karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif. Keunggulan inilah yang menarik bagi produsen bibit untuk mulai mengembangkan usaha kultur jaringan ini. Saat ini sudah terdapat beberapa tanaman kehutanan yang dikembangbiakkan dengan teknik kultur jaringan, antara lain adalah: jati, sengon, akasia, dll. Bibit hasil kultur jaringan yang ditanam di beberapa areal menunjukkan pertumbuhan yang baik, bahkan jati hasil kultur jaringan yang sering disebut dengan jati emas dapat dipanen dalam jangka waktu yang relatif lebih pendek dibandingkan dengan tanaman jati yang berasal dari benih generatif, terlepas dari kualitas kayunya yang belum teruji di Indonesia. Hal ini sangat menguntungkan pengusaha karena akan memperoleh hasil yang lebih cepat.

6. 1.

Media Tanam Kultur Jaringan Unsur-unsur yang Dibutuhkan Tanaman

Sebelum menguraikan cara-cara membuat medium kultur jaringan, maka terlebih dahulu kita harus mengetahui unsur-unsur yang dibutuhkan untuk pertumbuhan tanaman. Unsur-unsur yang dibuthkan tanaman dikelompokkan menjadi: 1. Garam-garam Anorganik Setiap tanaman membutuhkan paling sedikit 16 unsur untuk pertumbuhannya yang normal. Tiga unsur di antaranya adalah C,H,O yang di ambil dari udara, sedangkan 13 unsur yang lain berupa pupuk yang dapat diberikan melalui akar atau melalui daun. Pada perbanyakan

tanaman secara kultur jaringan. Semua unsur tersebut dibutuhkan oleh tanaman untuk pertumbuhannya. Ada unsur yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah besar yang disebut unsur makro, ada pula yang dibutuhkan oleh tanaman dalam jumlah sedikit tetapi harus tersedia yang disebut unsur mikro. 2. Zat-zat Organik Zat-zat organik yang biasanya ditambahkan dalam medium kultur jaringan adalah sukrosa, mio inositol, asam amino, dan zat pengatur tumbuh. Sedangkan sebagai tambahan biasanya diberi zat organik lain seperti air kelapa, ekstrak ragi, pisang, tomat, toge dan lain-lain. 2. Kegunaan Setiap Unsur Bagi Tanaman

Setelah kita mengetahui unsur-unsur yang dibutuhkan oleh tanaman, maka sebelum kita menentukan unsur-unsur yang akan digunakan untuk meramu medium kultur jaringan perlu mengetahui terlebih dahulu kegunaan unsur-unsur tersebut bagi pertumbuhan tanaman atau jaringan tanaman. 1. Unsur Nitrogen (N) Kegunaan unsur Nitrogen bagi tanaman adalah untuk menyuburkan tanaman, sebab unsur N dapat membentuk protein, lemak dan berbagai persenyawaan organik yang lain. 2. Unsur Fospor (P) Dibutuhkan oleh tanaman untuk membentuk karbohidrat. Maka, unsur P ini dibutuhkan secara besar-besaran pada waktu pertumbuhan benih.

3. Unsur Kalium (K) Memperkuat untuk tubuh tanaman, karena unsur ini dapat digunakan untuk memperkuat serabut-serabut akar, sehingga daun, bunga dan buah tidak mudah gugur. 4. Unsur Sulpur (S) Unsur ini digunakan untuk proses pembentukan anakan sehingga pertumbuhan dan ketahanan tanaman terjamin. 5. Unsur Kalsium (Ca)

Digunakan untuk merangsang pembentukkan bulu-bulu akar, mengeraskan batang dan merangsang pembentukkan biji. 6. Unsur Magnesium (Mg) Digunakan tanaman sebagai bahan mentah untuk ppembentukkan sejumlah protein. 7. Unsur Besi (Fe) Unsur ini digunakan sebagai penyangga (chelati agint) yang sangat penting untuk menyagga kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman. 8. Unsur Sukrosa Unsur ini sering ditambahkan pada medium kultur jaringan sebagai sumber energi yang diperlukan untuk induksi kalus. 9. Unsur Glukosa atau Fruktosa Unsur ini dapat digunakan sebagai unsur pengganti sukrosa karena dapat merangsang beberapa jaringan. 10. Unsur Mio-inositol Penambahan unsur ini pada medium bertujuan untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan. 11. Unsur Vitamin Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam mediumklutur jaringan antara lain adalah Thiamin. Thiamin adalah vitamin esensial yang digunakan untuk medium kultur jaringan.

12. Unsur Asam Amino Unsur ini diunakan oleh tanaman untuk proses pertumbuhan dan diferensiasi sel. Kebutuhan unsur asam amino oleh tanaman berbeda. 13. Unsur Zat Pengatur Tumbuh. Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senywa organik bukan hara, yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologi tumbuhan. Zat pengatur tumbuh

dalam tanaman terdir dari lima kelompok yaitu, Auksin, Sitokinin, Giberelin, Etilen dan Inhibitor dengan ciri khas dan pengaruh yang berlainan terhadap proses fisiologis. Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan diferensiasi. Tanpa penambahan zat pengatur tumbuh dalam medium, pertumbuhan sangat terhambat bahkan tidak akan tumbuh sama sekali. 2. Bentuk Fisik Media Tanam

Media tanam harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan. Bahanbahan yang diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan unsur mikro, gula , vitamin, protein, dan hormon tumbuh. media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh eksplan. Media tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat. Media cair berarti campuran-campuran zat kimia dengan air suling, sedangkan media padat adalah media zat cair tesebut ditambah dengan zat pemadat agar.

3.

Faktor Lingkungan
1. Keasaman (pH) Keasaman pH adalah nilai derazat keasaman atau kebasaan dari larutan dalam air. Keasaman (pH) suatu larutan menyatakan kadar dari ion H dalam larutan. Nilai di dalam pH berkisar antara 0 (sangat asam) sampai 14 (sangat basa), sedangkan titk netral adalah pH pada 7.

Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal antara pH 5,0-6,0. Bila eksplan mulai tumbuh, pH dalam lingkungan kultur jaringan tanaman umumnya akan naik apabila nutrein habis terpakai. Pengukuran pH dapat dilakukan dengan menggunakan pH meter, atau bila menginginkan yang lebih praktis dan murah dapat digunakan kertas pH. Bila ternyata pH medium masih kurang normal, maka dapat ditambah KOH 1-2 tetes. Sedangkan apabila pH melampaui batas normal dinetralkan dengan penambahan HCL. 4. Kelembapan

Kelembapan relatif (RH) lingkungan biasanya mendekati 100%. RH sekeliling kultur mempengaruhi pola pengembangan. Jadi, pengaturan RH pada keadaan tertentu memerlukan suatu bentuk diferensiasi Khusus. 5. Cahaya Intensitas cahaya yang rendah ultra dapat mempertinggi mendorong embriogenesis pertumbuhan dan dan

organogenesis.

Cahaya

violet

dapat

pembentukan tunas dari kalus tembakau pada intesitas yang rendah. 6. Temperatur Temperatur yang dibutuhkan untuk dapat terjadi pertumbuhan yang optimum umumnya adalah berkisar di antara 200-300C. Sedangkan temperatur yang optimum untuk pertumbuhan kalus endosperm adalah sekitas 250C. 7. Pembuatan Media Tanam Sebelum membuat medium, maka terlebih dahulu kita harus menentukan medium apa yang akan kita buat. Jenis medium dengan komposisi unsur kimia yang berbeda dapat digunakan untuk media tumbuh dari jaringan tanaman yang berbeda pula. Misalnya media Vacin Went sangat baik untuk media tumbuh anggrek. Tetapi tidak cocok untuk media tumbuh lain. Untuk eksplan dair tanaman keras sring menggunakan medium WPM, sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran dan tanaman hias) sering menggunakan medium MS. Medium Kundson C cocok untuk menanam eksplan kelapa kopyor dan anggrek. Untuk membuat media kultur jaringan, biasanya menimbang setiap komponen bahan kimia yang terdapat pada resep medium dasar. Langkah ini kurang praktis karena memakan banyak waktu dan mengurangi ketepatan. Selain itu, timbangan yang digunakan untuk menimbang sejumlah kecil bahan kimia kadang-kadang tidak tersedia. Kendala ini dapat diatasi dengan membuat larutan stoc terlebih dahulu, kecuali untuk unsur makronya. Jadi perlu membuat larutan stoc mikro. 8. 1. 1. Metode Pelaksanaan Kultur Jaringan Metode Kultur Jaringan. Dilihat dari Macam Media Tanam

Teknik kultur jaringan dapat dilaksanakan dengan dua metode yaitu: a. Metode Padat (Solid Method) Metode pada dilakukan dengan tujuan mendapatkan kalus dan kemudian dengan medium diferensiasi yang berguna untuk menumbuhkan akar dan tunas sehingga kalus dapat tumbuh menjadi planlet. Media padat adalah media yang mengandung semua komponen kimia yang dibutuhkan oleh tanaman dan kemudian dipadatkan dengan menambahkan zat pemadat. Zat pemadat tersebut dapat berupa agar-agar batangan, agar-agar bubuk, atau agaragar kemasan kaleng yang yang memang khusus digunakan untuk media padat untuk kultur jaringan. Media yang terlalu padat akan mengakibatkan akar sukar tumbuh, sebab akar sulit untuk menembus ke dalam media. Sedangkan media yang terlalu lembek akan menyebabkan kegagalan dalam pekerjaan. Kegagalan dapat berupa tenggelamnya eksplan yang ditanam. Eksplan yang tenggelam tidak akan dapat tumbuh menjadi kalus, karena tempat area kalus yaitu pada irisan (jaringan yang luka) tertutup oleh medium. Metode padat dapat digunakan untuk metode kloning, untuk menumbuhkan protoplas stelah diisolasikan, untuk menumbuhkan planlet dari protokormus stelah dipindahkan dari suspensi sel, dan untuk menumbuhkan planlet dari prtoplas yang sudah difusikan (digabungkan). b. Metode Cair(Liquid Metho) Penggunaan metode cair ini kurang praktis dibandingkan dengan metode padat, karena untuk menumbuhkan kalus langsung dari ekspaln sangat sulit sehingga keberhasilannya sangat kecil dan hana tanaman-tanaman tertentu yang dapat berhasil. Oleh karena itu, penggunaan media cair lebih ditekankan untuk suspensi sel, yaitu untuk menumbuhkan plb (prtocorm like bodies). Dari protokormus ini nantinya dapat tumbuh menjadi planlet apabila dipindahkan kedalam media padat yang sesuai. Pembuatan media cair jauh lebih cepat daripada media padat, karena kita tidak perlu memanaskannya untuk melarutkan agar-agar. Media cair juga tidak memerlukan zat pemadat sehingga keadaannya tetap berupa larutan nutrein. 2. Dilihat dari Bahan atau Eksplan yang Dipakai

Bila dilihat dari macam bahan yang digunakan, maka metode kultur jaringan yang telah dikenal sekarang antara lain adalah: 1) Kultur meristem. 2) Kultur antera 3) Kultru endosperma 4) Kultur suspensi sel 5) Kultur protoplas 6) Kultur embrio 7) Kultur spora 8) Dan lain-lain 3. Dilihat dari Cara Pemeliharaan Eksplan yang telah ditanam, agar dapat tumbuh menjadi kalus dan kemudian menjadi planlet, membutuhkan pemeliharaan yang rutin dan tepat. Artinya, eksplan atau kalus yang sudah waktunya untuk dipindahkan ke dalam media tanam yang baru harus segera dilaksanakan, tidak boleh sampai terlambat. Pemindahan yang terlambat dapat menyebabkan pertumbuahn eksplan atau kalus dapat terhenti atau dapat mengalami brownig atau terkontaminasi oleh jamur atau bakteri. 4. Pelaksanaan Kultur Jaringan 1. Sterilisasi Alat Penabur Sebelum digunakan, enkas harus diterilisasi dengan menggunakan hand sprayer berisi spirtus atau campuran formalin 10% dan alkohol 70%, dengan perbandinga 1:1. setelah disemprot kemudian dibiarkan terlebih dahulu kurang lebih 10 menit, baru kemudian boleh digunakan. 2. Sterilisasi Alat dan Medium Alat-alat dissecting set dan glass ware yang akan digunakan untuk kultur jaringan, setelah dicuci dan dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas payung dan

disterilisasi di dalam autoklaf dengan suhu 121 oC, tekanan 15 lb, dan lama sterilsiasi 20-30 menit. Botol-botol eksplan yang sudah berisi medium setelah ditutup dengan alumunium foil, kemudian disterilisasi. Sterilisasi medium lebih sedikit waktunya dibandingkan dengan sterilisasi alat-alat, yakni 15 menit, tetapi suhu dan tekannya sama. 3. Sterilisasi Eksplan Sterilisasi eksplan dilaksanakan dengan dua cara yaitu: a. Sterilisasi Eksplan secara Mekanis Cara ini digunakan untuk eksplan yang keras atau berdaging, yaitu dengan membakar eksplan tersebut di atas lampu spirtus sebanyak tiga kali. b. Sterilisasi Eksplan secara Kimiawi Sterilisasi ini gunakan untuk eksplan yang lunak. Sterilisasi ini menggunakan bahan kimia. Bahan-bahan yang digunakan untuk sterilisasi: Sodium hipoklorit Mercuri chlorit Alkohol 70% 4. Menabur Eksplan Menabur eksplan dilakukan di dalam Laminar Air Flow Cabinet dengan kondisi aseptik. Sebelum kita bekerja di dalam laminar air flow cabinet, semua perhiasan tangan harus dilepas, dan tangan dibasuh terlebih dahulu dengan alkohol 70%. Eksplan yang siap ditaman dipotng dengan menggunakan scalpel di dlam cawan petri. Potongan eksplan dimasukan kedalam erlenmeyer yang berisi media tumbuh, hingga permukaan yang teriris bersentuhan dengan medium. Setelah semua pekerjaan menabur selesai, kemudian alat-alat yang sudah dipakai dibersihkan. 5. Melaksanakan Sub-Kultur

Dalam waktu satu sampai dua minggu, eksplan akan tumbuh menjadi kalus. Kalus adalah suatu masa sel yang terbentuk pada permukaan eksplan atau irisan eksplan. Kalus ini akan tumbuh pada media eksplan yang padat., sedangkan pada media cair akan tumbuh plb (protokormus) Sub-kultur adalah suatu usaha untuk mengganti media kultur jaringan dengan media yang baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk kalus atau protokormus dapat terpenuhi. 5. Masalah-masalah yang terjadi dalam kultur jaringan 1) Kontaminasi Kontaminasi adalah gangguan yang sangat umum terjadi dalam kegiatan kultur jaringan. Munculnya gangguan ini bila dipahami secara mendasar adalah merupakan sesuatu yang sangat wajar sebagai konsekuensi penggunaan yang diperkaya. Penomena kontaminasi sangat beragam, keragaman tersebut dapat dilihat dari jenis kontaminasinya (bakteri, jamur, virus, dll). Upaya mencegah terjadinya kontaminsai. 1. 2. 3. Biasakan membersihkan berbagai sarana yang diperlukan dalam kultur jaringan. Yakinkan bahwa proses sterilisasi media secara baik dan benar. Lakukan proses penanaman bahan pada keadaan anda nyaman dan cari waktu yang longgar. 2) Pencoklatan/browning Pencoklatan adalah suatu karakter munculnya warna coklat atau hitam yang sering membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Peristiwa pencoklatan sesunggguhnya merupakan peristiwa alamiah yang biasa yang sering terjadi. Pencoklatan umumnya merupakan suatu tanda-tanda kemunduran fisiologi eksplan dan tidak jarang berakhir pada kematian eksplan. 3) Vitrifikasi

Vitrifikasi adalah suatu istilah problem pada kultur yang ditandai dengan: Munculnya pertumbuhan dan pertumbuhan yang tidak normal, Tanaman yang dihasikan pendek-pendek atau kerdil. Perturumbuhan batang cenderung ke arah penambahan diameter. Tanaman utuhnya menjadi sangat turgescent. Pada daunnya tidak memiliki jaringan pallisade. 4) Variabilitas Genetik Bila kultur jaringan digunakan untuk upaya perbanyakan tanaman yang seragam dalam jumlah yang banyak, dan bukan sebagai upayapemuliaan tanaman maka variasi genetik adalah kendala. Variasi genetik dapat terjadi pada kultur in vitro karena: 1. Laju multiflikasi yang tinggi, variasi terjadi karena terjadinya sub kultur berulang yang tidak terkontrol 2. 3. Penggunaan teknik yang tidak sesuai. Variasi genetik yang paling umum terjadi pada kultur kalus dan kultur suspensi sel, hal tersebut terjadi karena munculnya sifat instabilitas kromosom mungkin akibat teknis kultur, media atau hormon. Cara mengatasi problem variasi genetik tentunya tidak sederhana, harus memperhatikan aspek yang dikulturkan. 5) Pertumbuhan dan Perkembangan Problem utama berkaitan dengan proses pertumbuhan adalah bila eksplan yang ditanam mengalami stagnasi, dari mulai tanam hingga kurun waktu tertentu tidak mati tetapi tidak tumbuh. Untuk menghindari hal itu dapat dilakukan dengan preventif menghindari bahan tanam yang tidak juvenil atau tidak meristematik. Karena awal pertumbuhan eksplan akan dimulai dari sel-sel yang muda yang aktif membelah, atau dari sel-sel tua yang muda kembali. Media juga dapat menjadi sebab terjadinya stagnasi pertumbuhan, karena dari kondisi medialah suatu sel dapat atau tidak terdorong melakukan proses pembelahan dan pembesaran dirinya.

Pada proses klutur jaringan yang bersifa inderict embriogenesis, tahapan pembentukan kalus harus dilanjutkan dengan mendorong induksi embriosomatik dari sel-sel kalus. Terjadinya embrio somatik dapat secara endogen atau eksogen. 6) Praperlakuan Masalah pada kegiatan in vitro bukan hanya dari penanaman eksplan saja, pertumbuahan dan perkembangannya dlama botol saja tetapi juga sangat bisa dipengaruhi oleh persyaratan kegiatan prapelakuan. Pada kasus ini masalah akan muncul bila kegiatan prapelakuaan tidak dilakukan. Prapelakuan dilakukan umumnya untuk tujuan-tujuan tertentu, secara umum adalah dalam rangka menghilangkan hambatan. Hambatan apat berupa hambatan kemikalis, fisik, biologis. Hambatan berupa bahan kimia penanganannya harus dimulai dari pengenalan senyawa aktif, potensi gangguan, proses reaksi dan alternatif pengelolaannya. 7) Lingkungan Mikro Masalah lingkungan inkubator juga tidak bisa diabaiakan karena ini juga sering menjadi masalah. Suhu ruangan inkubator sangat menentukan optimasi pertumbuhan eksplan, suhu yang terlalu rendah aatau tinggi dapat mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan pada eksplan. Kebutuhan antara satu tananaman dengan tanaman yang lain berbeda, namunddemikian solusinya sulit dilakukan mengingat umumnya ruangan inkubator suatu ruangan laboratorium kultur jaringan tidak bisa dibuat variasi antara satu ruangan dengan bagian ruangan yang lainnya. Sehingga optimasi pertumbuhan tidak bisa diharapkan sama antara kultur yang satu dengan kultur yang lain. Kultur adalah budidaya dan jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. jadi, kultur jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat seperti induknya. Manfaat dari teknik kultur jaringan tanaman ini diharapkan juga memperoleh tanaman baru yang bersifat unggul. Dalam kegiatan kultur jaringan perlu memerlukan bahan-bahan yang dibutuhkan dalam proses kegiatan kultur jaringan. Bahan-bahan yang digunakan dalam kegiatan kultur jaringan diantaranya: Unsur

hara makro dan mikro yaitu Zat Pengatur tumbuh, Aquades, Vitamin, Agar, Gula, Ekstrak-ekstrak organik (ekstrak air kelapa, ekstrak tomat, dll).

Pembuatan Larutan stok

Pembuatan larutan stok merupakan langkah awal pembuatan media yang dipilih.Pembuatan larutan stok menghemat pekerjaan menimbang bahan yang berulang-ulang setiap kali membuat media. Pembuatan larutan stok berdasarkan pengelompokkan terdiri dari stok makro, stok mikro, stok Fe, stok vitamin dan stok hormon. Stok hormon dapat disimpan antara 2-4 minggu sedangkan stok hara 4-8 minggu.Dengan adanya larutan stok, pembuatan media selanjutnya hanya dengan teknik pengenceran dan pencampuran saja. 4.2. Stok Hara makro Senyawa sumber unsur hara makro diperlukan dalam jumlah yang cukup besar. Oleh karena itu dibuat dalam stok larutan tunggal, selain itu jenis anion senyawa sumber unsur hara makro tidak sama. hal tersebut akan memungkinkan percepatan pengendapan larutan bila dibuat larutan stok tunggal. Hara makro tersebut meliputi, Nitrogen (N), Fosfor (P), Kalium (K), Kalsium (Ca), Sulfur (S), Magnesium (Mg), dan Besi (Fe). Kegunaan unsur hara makro tersebut dalam kultur jaringan menurut Qosim, 2006 dalam Sukarasa 2007 adalah sebagai berikut: 1. Nitrogen (N) diberikan dalam bentuk NH4NO3, NH2PO4, NH2SO4. Berfungsi untuk membentuk protein, lemak, dan berbagai senyawa organik lain, morfogenesis (pertumbuhan akar dan tunas), pertumbuhan dan pembentukan embrio, pembentukan embrio zigotik dan pertumbuhan vegetatif. 2. Fosfor (P), diberikan dalam bentuk KH2PO4 Berfungsi untuk metabolisme energi, sebagai stabilitor membran sel, pengaturan metabolisme tanaman, pengaturan produksi pati/amilum, pembentukan karbohidrat, sangat penting dalam transfer energi, protein, dan sintesis asam amino serta konstribusi terhadap struktur dan asam nukleat.

3. Kalium (K), diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2O Berfungsi untuk pemanjangan sel tanaman, memperkuat tubuh tanaman, memperlancar metabolisme dan penyerapan makanan, ion kalsium ditransfer secara cepat menyebrangi membran sel dan mengatur pH dan tekanan osmotik di antara sel. 4. Kalsium (Ca), diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2O Berfungsi untuk merangsang bulu-bulu akar, penggandaan atau perbanyakan sel dan akar, pembentukan tabung polen, dinding dan membran sel lebih kuat, tahan terhadap serangan patogen, mengeraskan batang, memproduksi cadangan makanan. 5. Sulfur (S) Unsur S merupakan unsur yang penting untuk pembentukan beberapa jenis protein, seperti asam amino dan vitamin B1. Unsur S juga berperan penting dalam pembentukan bitilbintil akar. 6. Magnesium (Mg), diberikan dalam bentuk MgSO4.7H2O. Berfungsi untuk meningkatkan kandungan fosfat, pembentukan protein. 7. Besi (Fe), diberikan dalam bentuk Fe2(SO4)3;FeSO4.7H2O Berfungsi sebagai penyangga (chelatin agent) yang sangat penting untuk menyangga kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman.Pada tanaman, Fe berfungsi untuk pernapasan dan pembentukan hijau daun (George & Sherringtone, 1984). 4.3. Stok Hara Mikro Unsur hara mikro sangat sedikit diperlukan dalam pembuatan media.Biasanya larutan hara mikro dibuat dengan kepekatan 200kali konsentrasi akhir media dan bahan yang diperlukan masih cukup kecil jumlahnya.Oleh karena itu larutan stok unsur hara mikro dapat dibuat sebagai stok campuran.Besarnya konsentrasi senyawa mikro yang digunakan sangat kecil yaitu berukuran mikromolar, antara lain: besi (Fe), mangan (Mn), boron (Bo), tembaga (Cu), seng (Zn), Iodine (I), molybdenum (Mo), cobalt (Co). Unsurunsur tersebut adalah merupakan komponen protein sel tanaman yang penting dalam proses metabolisme dan proses fisiologi.Unsur hara mikro adalah hara yang dibutuhkan

dalam jumlah yang sedikit. Unsur hara mikro ini merupakan komponen sel tanaman yang penting dalam proses metabolisme dan proses fisioligi lainnya (Gunawan, 1992). Unsur hara mikro tersebut diantaranya adalah : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Klor (Cl), diberikan dalam bentu KI. Mangan (Mn), diberikan dalam bentuk MnSO4.4H2O. Tembaga (Cu), diberikan dalam bentuk CuSO4.5H2O. Kobal (CO), diberikan dalam bentuk CoCl2.6H2O. Molibdenun (Mo), diberikan dalam bentuk NaMoO4.2H2O. Seng (Zn), diberikan dalam bentuk ZnSO4.4H2O. Boron (B), diberikan dalam bentuk H3BO3. Penggunaan unsur mikro awalnya dilakukan oleh Knudson pada tahun 1922, dengan menambahkan Fe dan Mn dalam media kultur untuk perkecambahan anggrek, yang ternyata hasilnya sangat baik. Barthelot, Gautheret, dan Nobecourt pada tahun 1934-1939, menyarankan penggunaan Cu, Co, Ni, Ti dan Bo dalam media kultur. Hildebrant dan kawankawannya pada tahun 1946, menyatakan kebutuhan Bo, Mn, Zn dan Fe yang optimum, untuk pertumbuhan kalus tanaman tembakau dan bunga matahari,sedangkan penggunaan Mo diperkenalkan oleh Buerk Holder dan Nickel. (George & Sherringtone, 1984). Fungsi dari unsur mikro antara lain: 1. Mangan (Mn) mengatur oksidasi auksin, sebagai aktifator enzim. Mn dalam level yang tinggi dapat mengsubstitusikan Mo dalam kultur akar tomat. Mn dapat menggantikan fungsi Mg dalam beberapa sistem enzym tertentu 2. Clorine (Cl) berperan dalam proses osmosis dan kesetimbangan ion. 3. Tembaga (Cu) berperan dalam cofactor enzim. 4. Zinc (Zn) berperan menahan oksidasi auksin, berguna dalam sintesa triptofan dan sebagai aktifator enzim. 5. Boron (Bo) berperan mempengaruhi penggunaan kalsium. Kekurangan Boron mengurangi laju pertumbuhan kultur sel tebu, bunga matahari, dan wortel. Sebaliknya konsentrasi lebih tinggi dari 2 mg/l, dapat berubah sisatnya menjadi

racun dalam media kultur. Dalam beberapa species, ternyata terdapat interaksi antara Bo dan auksin dalam pengaturan pengakaran pada percobaan setek. 6. Cobalt (Co) diperlukan oleh organisme dalam memfiksasi N2. 7. Seng (Zn) dibutuhkan dalam sintesa tryptophan (George & Sherringtone, 1984). 4.4. Stok vitamin Vitamin bukan merupakan perlakuan artinya semua media menggunakkan konsentrasi vitamin yang sama, maka larutan stok vitamin dapat dibuat stok campuran Larutan stok zat pengatur tumbuh Zat pengatur tumbuh umumnya hanya dibutuhkan dalam jumlah sedikit. Proses penimbangan zat pengatur tumbuh untuk larutan stok sulit digeneralisasikan, karena biasanya zat pengatur tumbuh merupakan perlakuan dalam media kultur jaringan(Bonner dan Devirian, 1939). Vitamin yang paling sering digunakan dalam media kultur jaringan tanaman, adalah thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (niacin) dan pyridoxine (vitamin B6). Thiamine merupakan vitamin yang esensial hampir pada semua kultur jaringan tanaman. Fungsi thiamine adalah untuk mempercepat pembelahan sel pada meristem akar juga berperan sebagai koenzim dalam reaksi yang menghasilkan energi dan karbohidrat serta memindahkan energy.Asam nikotinik penting dalam reaksi - reaksi enzimatik, disamping berperan sebagai prekusor dari beberapa alkaloid, pemberian vit C bertujuan untuk mencegah terjadinya pencoklatan pada permukaan irisan jaringan (Bonner dan Devirian, 1939). Vitamin lain yang sering ditambahkan dalam medium kultur jaringan adalah : Niasin, glisin, Myo-inositol, asam folat, sianokabalamin, riboflavin, biotin, kolin klorida, kalsium pantetonat, piridoksin pospat. Setiap jenis vitamin mempunyai fungsi yang berbeda-beda didalam tubuh tanaman, antara lain: 1. Inositol (a vit. B) bagian dari berbagai macam membrane (kloroplas). 2. Pyridoxine (vit. B6) berperan sebagai coenzim pada beberapa enzim. 3. Pantothenic acid (a vit. B) berperan sebagai coenzim dalam metabolisme lemak.

4. Riboflavin (vit. B12) berperan sebagai coenzim, reseptor sinar biru. 5. Biotin (vit. H) berperan sebagai coenzim dalam metabolisme lemak. (Robbins dan Schmidt, 1939). Pada pembuatan larutan stok vitamin juga ditambahkan glycine.Glycine merupakan asam amino yang ditambahkan sejak tahun 1939, Glycine dengan konsentrasi 2 mg/l merupakan komposisi tetap dalam banyak formulasi media (Robbins dan Schmidt, 1939). 4.5. Pembuatan 1 L MS0 Langkah awal menyiapkan alat-alat dan bahan-bahan yang akan digunakan, yaitu timbangan analitik, tabung erlenmeyer, gelas ukur, pengaduk, kompor gas, pH meter atau kertas pH, botol media, gula, agar 0.8 %, NAA 2 mg/L, dan BA 0.5 mg/L, makronutrien dan mikronutrien. Menimbang agar agar 8 gr dan gula 30 gr dan memasukkan keduanya ke beker gelas dengan tambahan sidikit air.Dan di panaskan diatas kompor sampai larut seluruhnya sambil diaduk- aduk.Pemanasan dihentikan ketika larutan terlihat bening dan mulai terlihat gelembung gelembung udara.Kemudian ditambahkan denngan makronutrien 100 ml, mikronutrien 10 ml, stik Fe 10 ml dan Stok vitamin 10 ml. gula dan agar dipanaskan terlebih dahulu karena MS mudah rusak dalam kondisi panas serta karena ukuran dari agar agar yang sangat kecil sehingga nanti akan menyebabkan tidak larut dan medium menajadi tidak padat. Setelah tercampur rata, media tersebut dituangkan ke dalam botol-botol media yang telah dipersiapkan sesuai kebutuhan. Kemudian menutup botol yang sudah terisi media.Diusahakan supaya botol benar-benar tertutup rapat.Memasukkan botol-botol tersebut ke dalam autoclaf dan disterilisasi dengan suhu 121C selama 20 menit.Media yang sudah disterilisasi disimpan di dalam ruang penyimpanan media selama 3 hari sebelum digunakan untuk memastikan bahwa media tersebut tidak terkontaminasi dan media padat dengan sempurna.Bahan pemadat digunakan adalah agar.

Keuntungan dari pemakain media agar adalah : 1. Agar membeku pada temperatur 45o C dan mencair pada temperature 100o C, sehingga dalam kisaran temperatur kultur, agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil. 2. 3. Tidak dicerna oleh enzim yang dihasilkan oleh jaringan tanaman. Tidak bereaksi dengan persenyawaan-persenyawaan penyusun media. (George & Sherrington, 1984). Agar merupakan campuran polisakharida yang diperoleh dari beberapa spesies Algae.Dalam analisa unsur diperoleh data, bahwa kandungan agar meliputi unsur Ca, Mg, K, dan Na dalam jumlah yang sedikit (Debergh, (1982 dalam Gunawan 1988).Kekentalan media pada umumnya meningkat secara linier oleh pertambahan konsentrasi agar.Kekentalan media juga dipengaruhi oleh Merek agar yang digunakan.merek agar yang berbeda, memberikan kekentalan yang sedikit berbeda walaupun beratnya sama.Kekerasan media meningkat secara linear pada pertambahan konsentrasi agar, kekerasan media juga dipengaruhi oleh jenis agar yang dipakai, pH media, dan penambahan arang aktif (Debergh, 1982 dalam Gunawan, 1992). Eksplan yang kecil mudah terlihat dalam media padat, selama kultur eksplan tetap berada pada orientasi yang sama, eksplan berada di atas permukaan media sehingga tidak diperlukan teknik aerasi tambahan pada kultur, orientasi pertumbuhan tunas dan akar tetap, dan kalus tidak pecah seperti jika ditempatkan pada media cair. Namun penambahan agar dalam beberapa kasus dapat menghambat pertumbuhan karena: agar mungkin mengandung senyawa penghambat yang dapat menghambat morfogenesis beberapa kultur atau memperlambat pertumbuhan kultur(Dodds dan Robert, 1982). Perkembangan pemilihan jenis karbohidrat dimulai tahun 1946 oleh Gautheret yang membandingkan pengaruh berbagai jenis gula pada kultur jaringan wortel (George & Sherringtone, 1984). Gautheret mendapatkan bahwa sukrosa adalah yang paling baik, lalu glukosa, maltosa, dan rafinosa.Fruktosa dan galaktosa kurang efektif, sedangkan manosa dan laktosa merupakan karbohidrat yang paling tidak efektif.Pada umumnya urutan yang demikian berlaku hampir semua tanaman. Induksi sitodiferensiasi ke arah pembentukan

elemen trachea dapat terjadi dengan pemilihan jenis karbohidrat dan konsentrasi yang tepat dalam media kultur (Dodds dan Robert, 1982). Gula digunakan sebagai sumber energi dalam media kultur, karena umumnya bagian tanaman atau eksplan yang dikulturkan tidak autotrof dan mempunyai laju fotosintesis yang rendah. Oleh sebab itu tanaman kultur jaringan membutuhkan karbohidart yang cukup sebagai sumber energi. Menurut Gautheret dalam Gunawan (1992), sukrosa adalah sumber karbohidrat penghasil energi yang terbaik melebihi glukosa, maltosa, rafinosa.Namun jika tidak terdapat sukrosa, sumber karbohidrat tersebut dapat digantikan dengan gula pasir. Gula pasir cukup memenuhi syarat untuk mendukung pertumbuhan kultur. Selain sebagai sumber energi, gula juga berfungsi sebagai tekanan osmotik media.Sukrosa di dalam media dihidrolisa menjadi monosakharida selama masa kultur. Hidrolisa terjadi karena aktifitas enzim invertase yang terdapat pada dinding sel. Hidrolisa sukrosa paling efektif dalam media dengan pH rendah.Konsentrasi optimum sukrosa tergantung dari jenis jaringan yang dikultur. Pada kultur kalus dan pucuk, konsentrasi sukrosa yang digunakan adalah antara 2-4 % yang merupakan konsentrasi optimum. Namun dalam kultur embrio, konsentrasi gula dapat mencapai 12 % Penambahan sukrosa disini berfungsi sebagai sumber gula dan energy (George & Sherrington, 1984). 4.6. Perbandingan medium MS dengan medium lain Apabila medium MS dibandingkan dengan medium yang lain maka perbedaannya disesuaikan dengan eksplan yang digunakan. Medium MS merupakan medium yang sesuai jika digunakan untuk hampir semua macam tanaman terutama tanaman herbaceus. Sedangkan pada medium yang lain hanya mampu menumbuhkan tanaman tertentu. Selain itu pada medium MS mempunyai konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+(Hendaryono, 1994). Media MS (murashing and skoog) mengandung unsur hara makro dan mikro yang tinggi yang mampu menjamin pertumbuhan jaringan tanaman(Gunawan 1987 dalam Matatula 2003). Menurut Mandang (1993) dalam Matatula 2003), pembuatan medium MS dapat disubsitusi dengan air kelapa yang berarti menambah komponen-komponen yang dimiliki maupun yang tidak dimiliki medium MS seperti asam amino, asam organik, gula dan fitohormon.

Beberapa macam medium yang pada umumnya diberi nama sesuai dengan nama penemunya antara lain : 1. Medium Dasar B5 Atau Gamborg : digunakan untuk kultur suspensi sel kedele, alfafa dan legume lain. 2. Medium Dasar White : digunakan untuk kultur akar. Medium ini merupakan medium dasar dengan konsentrasi garam-garam mineral yang rendah. 3. 4. Medium Vacin Went (VW) : digunakan khusus untuk medium anggrek. Medium Dasar Nitsch Dan Nitsch : digunakan untuk kultur serbuk sari (pollen) dan kultur sel. 5. 6. Medium Dasar Woody Plant Medium (WPM) : digunakan untuk tanaman berkayu. Medium Dasar Schenk Dan Hildebrandt : Digunakan untuk kultur jaringan tanaman monokotil. 7. Medium Dasar N6 : digunakan utnuk tanaman serealia (Hendaryono, 1994). Pada eksplan Jasminium sp. dapat menggunakan medium WPM karena medium tersebut digunakan untuk tanaman berkayu. Kesulitan yang sering timbul pada kultur jaringan tanaman berkayu adalah keluarnya phelic compound, sehingga kalus atau eksplan menjadi berwarna coklat yang akhirnya tidak dapat tumbuh. Hal tersebut disebut browning.

ALAT-ALAT LABORATORIUM KULTUR JARINGAN A. Laminar Air Flow Cabinet (LAFC) Alat ini letaknya diruang penabur, yaitu ruang yang selalu harus dalam keadaan steril. alat ini digunakan sebagai tahap perlakuan penanaman. B. Entkas Merupakan bentuk lama dari alat penabur (LAFC), maka fungsinya pun sama seperti (LAFC) C. Shaker (penggojok) Merupakan alat penggojok yang putarannya dapat diatur menurut kemauan kita. Penggojok ini dapat digunakan untuk keperluan menumbuhkan kalus pada eksplan anggrek atau untuk membentuk protokormusatau sering disebut plb (protocorm like bodies) dari kalus bermacam jaringan tanaman. D. Autoklaf Autoklaf adalah alat sterilisasi untuk alat dan medium kultur jarinang tanaman. E. Timbangan Analitik Jenis alat ini bermacam-macam, tetapi yang penting adalah timbanagn yaang dapat dipergunakan untuk menimbang sampai satuan yang sangat keil. Alat ini berfungsi sebagai alat untuk menimbang bahan-bahan kimia yang digunakan untuk kultur jaringan. F. Stirer Alat ini berfungsi untuk menggojok dengan pemanas. Dengan menggunakan listrik, alat ini berfungsi sebagai kompor disamping sebagai penggojok. G. Erlenmeyer Alat ini digunakan dalama kultur jaringan tanaman sebagai sarana mmenuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eeksplan. H. Gelas Ukur Gelas ukur digunakan untuk menakar air suling dan bahan kimia yang akan digunakan. I. Gelas Piala

Alat ini digunakan untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan kimia dan air suling dalam pembuatan medium. J. Petridish Alat ini merupakan semacam jenis gelas piala yang mutlak dibutuhkan dalam kultur jaringan. K. Pinset dan Scalpel Pinset digunakan untuk memegang atau mengambil irisan eksplan atau untuk menanam eksplan L. Lampu Spiritus Digunakan untuk sterilisasi dissecting kit (skalpel dan pinset) di dalam laminar air flow cabinet atau di dalam enkas pada kita mengerjakan penanaman atau sub-culture. M. Tabung Reaksi Alat ini digunakan pada saat mengerjakan isolasi protoplas dan isiolasi khloroplas. FASILITAS LABORATORIUM KULTUR JARINGAN Fasilitas laboratorium kultur jaringan di bagi dalam beberapa bagian yang fungsinya satu sama lainnya berbeda-beda dan persyaratannya pun berbeda-beda pula. Laboratorium kultur jaringan harus dirancang secara khusus. Karena ada bagian-bagian atau ruangan-ruanagn yang harus dalam suasana steril atau bebas mikroba. Ruang-ruang dalam kultur jaringan di kelompokkan menurut macam kegiatan yang ada di dalamnya,, yaitu sebagai berikut: A. Ruang Tidak Steril Ruang Tamu. Dalam laborsatorium kultur jaringan sebaiknya di lengkapi dengan ruang tamu, karena biasanya laboratorium kultur jaringan selalu di datangi tamu baik tamu yang ingin melihat sarana dan suasana laboratorium maupun tamu ingin membeli hasil biakan kultur jaringan. Ruang Administrasi. Segala surat-menyurat tentang pembelian alat-alatlboratorium, pembelian media kultur jringan, penjualan bibit-bibit hasil biakan kultur jaringan, dan transaksi-transaksi ataupun perjanjianperjanjian kerja sama tentang penelitian dilaksanakan di dalam ruangan administrasi.

Ruang Staf. Laboratorium kultur jaringan membutuhkan staf peneliti dalam jumlah banyak, tujuannya adalah agar dapat di adakan pembagian kerja sesuai dengan spesialisasinya masing-masing. Di dalam ruang staf ini dapat pula di lakasanakan diskusi antar staf pada waktu berkumpul bersama. Kamar Mandi dan WC. Ruang kultur jaringan harus dalam suasana bersih untuk menghindari kontaminasi oleh mikroba. Bila pekerja akan memasuki ruangan penabur atau ruang inkubator, tubuh dan pakaiannya harus bersih, tidak berkeringat dan tidak berdebu. Untuk inilah kamar mandi dan wc perlu diadakan. Ruang Ganti Pakaian. Untuk menghindari timbulnya kontaminasi oleh mikroba, maka para karyawan di dalam laboratorium kultur jaringan perlu memakai pakaian yang bersih, dalam arti baru di cuci. Oleh karena itu dalam ruangan kultur jaringan perlu di adakan ruang ganti pakaian. Ruang Tempat Penyimpanan Bahan Kimia dan Alat-alat dari Gelas. Komponen bahan kimia penyusun media kultur jaringan sangat banyak macamna. Oleh karena itu, penyimpanannya memerlukan pengaturn yang khusus supaya mudah mecarinya. Penyimpanan yang tidak teratur akan mempelambat dalam pekerjaan, misalnya dalam mencari salah sau komponen media saja membutuhkan waktu yang lama. Bahan kimia yang mahal harganya seperti hormon tumbuh dan enzim untuk isolasi protoplas harus disimpan dala ruangan yang sejuk. Alat-alat dari gelas seperti erlenmeyer, gelas ukurdan alat gelas lainnya perlu disimpan dalam almari tersendiri. Ruang Preparasi. Di dalam ruangan ini disediakan peralatan dan tempat untuk mencuci alat-alat laboratorium yang akan digunakan. Peralatan yang ada antara lain keranjang-keranjang plastik untuk tempat peralatan yang baru dicuci. Ruang Penimbangan dan Sterilisasi. Bermacam-macam media kultur jaringan dijual dalam bentuk kemasan dengan harga yang relatif mahal. Oleh karena itu, staf labolatorium lebih senang meramu sendiri medum tanam yang

dibutuhkannya.dengan demikian dibutuhkan lat untuk menimbang semua komponen bahan kimia tersebut. Misalnya menimbang bahan kimia makro dan mikro. Rumah Kaca (Green House) Rumah kaca adalah suatu bangunan yang atap dan sekeliling dinding bagian atasnya terbuat dari kaca. Tujuan penyediaan rumah kaca adalah untuk tempat meletakkan pot-pot bibit tanaman, baik bibit yang akan dijadikan bahan kultur jarinang maupun bibit hasil dari kultur jaringan yang sudah siap djual atau dipelihara sendiri. B. Ruang Tidak Mutlak Steril Ruang Planlet. Ruangan ini menggunakan alat pendingi (AC), maka temperatur ruangan dapat mencapai sekitar 25OC sehingga ideal bagi pertumbuhan planlet. Botol-botol yang berisi planlet jumlahnya dapat mencapai ratusan. Oleh sebab itu, dalam ruangan ini perlu disediakan rak-rak alumuniaum yang dasrnya berlobang-lobang untuk meletakkan botol-botol tersebut secara teratur dan rapi. Ruang Inkubator. Eksplan yang sudah ditanam dalam media kultur jringan perlu dipantau pertumbuhannya setiap hari. Untuk pemantauan ini perlu ruangan khusus yang keadaannya lebih steril dari ruang planlet, yaitu ruang inkubator. Ruang inkubator harus memiliki suhu kurang lebih 25OC dan harus dilengkapi dengan lampu-lampu neon, karena eksplan yang ditumbuhkan dalam ruangan inkubasi membutuhkan temperatru dan cahaya yang dapat diatur dan disesuaikan dengan jenis eksplannya. Ruang Shaker dsn Enkas. Eksplan yang baru ditanam dan diinkubasikan dalam ruang inkubator akan menghasilkan kalus. Bila kalus ini cukup umur, maka dapat diperlukan suspensi sel, yaitu menumbuhkan suatu eksplan atau kalus dengan menggunakan media cair (media yang tidak menggunakan zat pemadat atau agar), kemudian digojok di atas shaker. Hasil pertumbuhan kalus ini adalah berupa protokormus atau dalam istilah asing disebut plb (protocorm like bodies). Bentuk protocormus adalah bulat-bulat padat dan berwarna hijau. Bila keadaan protocormus sudah keadaan demikian maka sudah siap dipindahkan kedalam media padat untuk di tumbuhkan menjadi planlet.

Enksa juga sering di letakkan dalam satu ruang dengan shaker, kegunaan enkas ini sama dengan Laminar Air Flow Cabinet, yaitu untuk menabur eksplan. C. Ruang Mutlak Steril. Ruang Penabur. Ruang penabur biasanya di buat dengan ukuran yang tidak terlalu besar, yaitu 2x3 m2. tujuannya adalah agar pelaksanaan sterilisasi ruangannya tidak membutuhkan waktu yang lama dan tidak mengalami kesulitan. Dinding ruang penabur dilengkapi dengan porselin, sehingga sterilisasi mudah dilakukan. Sterilisasi ruangan dilakukan dengan cara menyemprotkan alkohol 96% dengan hand-sprayer. Sedangkan sterilisasi lantai dengan menggunakan kain pel yang dibasahi alkohol 96%. Sterilisasi ini mutlak harus dilakukan menjelang ruang penabur akan digunakan. Bila saat calon penabur akan memasuki ruangan, lampu ultra violet harus dimatkan terlebih dahulu kemudian menyalakan lampu neon biasa dan calon penabur diperbolehkan memasuki ruangan tersebut. Sebaiknya, pada saat akan keluar lampu neon di matikan dan setelah keluar menutup daun pintu kembali lampu ultra violet dinyalakan. Dengan demikian steril ruangan dapat dijamin.

Penyiapan Eksplan kultur jaringan MENYIAPKAN EKSPLAN

Dalam menyiapkan bahan tanam, tanaman induk sebagai sumber bahan (eksplan) mruakan faktor penentu dalam menghasilkan produk akhir (bibit) hail perbanyakan melalui kultur jaringan yang berkualitas. Sedangkan sterilitas bahan tanam, sehingga prosedur sterlisasi eksplan harus tepat anpa memaikan jaringan dari eksplan. 1. Menyiapkan bahan eksplan

Eksplan atau bahan tanam adalah bagian kecil bagian kecil jaringan atau organ yang diambil/dipisahkan dari tanaman nduk kemudian ikulturkan. Ketepatan dalam menyiapkan eksplan adalah salah satu faktor yang dapat mempengaruhi inisiasi eksplan. 1. Deskripsi varetas tanaman sumber bahan eksplan

Dalam upaya menghasilkan tanaman induk yang sesuai dengan kriteria diatas dapat dilakukan dengan cara mengkodisikan tanaman induk dalam lingkungan yang lebih terkendali, misalnya dengan cara mencangkok tanaman induk, kemudian ditanam dalam po dan dipelihara secara otimal didalam green house/net house. 2. Persyaratan bagian tanaman sebagai bahan eksplan

Bagian tanana yang dapat dijadikan sebagai eksplan adlah ujung akar, pucuk, daun, bunga, dan tepung sari. Faktor yang dimiliki ekplan itu sendiri yaitu ukuran, umur fisiologis, sumber genotip dan sterilitas ekplan yang akan menentukan berhasil tidaknya pegkulturan eksplan. Umur fisiologis eksplan berpengaru terhadap kemampuanya untuk beregenerasi jaringan tanaman yang masih muda yang meristematik (sel-selnya masil aktif membelah) lebih mudah beregenerasi dibandingkan dengan jaringan yang sudah tua, sehingga bagian tanaman yang meristematik paling banyak berhasil bila dijadikan eksplan yang termasuk jaringan meristem adlah pucuk apikal, pucuk lateral dan pucuk aksial. 3. Karakter bagian tanaman sebagian bahan eksplan Pemelihan bagian tanaman sebagaibahan eksplan menentukan keberhasilan eksplan untuk dikulturkan. Pada dasarnya setiap bagian tanaman yang dapat dijadikan sebagai bahan ekspla, tetapi dalam memilih bagian tanaman yang akan dikulturkan harus mempertimbankan faktor kemudahan beregenerasi dan tingkat kontaminasinya.

Bagian tanaman yang banyak mengandung persediaanmakanan serta bahan-bahan lain untuk pertumbuhan, seperti umbi adalah lebih mudah untuk beregenerasi dibanding denagn bagian tanaman yang kurang mengandung bahan makanan. Bagian yang berasal lebih tinggi dibandingkan dengan bagian-bagian tanaman yang ada diatas permukaan tanah seperti pucuk atau daun. 4.
Mensterilkan eksplan

Dari semua komunikasi, kontaminasi dari bahan tanam/eksplan merupakan yang paling sulit diatasi. Untuk itu dipelukan bahan sterilan yang tepat untukmenghasilkan kontaminan dari eksplan. Kontaminan hidup dapat berupa cendawan, bakteri, seranga dan telurnya, tungau serta spora. Bila kontaminan ini tidak dihiangkan, maka pada media yang mengandung gula, vitamin dan minera, dalam waktu singkat seluruh botol terpenuhi oleh kontaminan yang mineral, dalam waktu singkat seluruh botol terpenuhi oleh kontaminan yangakhirnya mengakibatkan eksplan menjadi mati. Sterilisai eksplan dengan bahan strelisasi adalah sebatas membersihkan debu, cendawan, bakteri dan kontaminan lain dari bagan permukaan eksplan atau disebut desinfestasi. 1. Macam-macam bahan streisasi dan fungsinya Macam-macam bahan untuk sterilisasi dan fungsinya adalah sebagai baerikut : N o. 1 . 2 . 3 . 4 Alkohol 70% dan 95% Desinfektan bakterisida fungisida deterjen Membershkan kotora/debu dari eksplan Memberihkan jamur/cendawan Membersihkan bakteri Nama bahan sterilisasi Fungsinya

. 5 . Sodium hipoklorik dengan nama Desinfektan

dagang clorox atau bayclin 6 Mercury chlorit dengan nama dagang Desinfektan

sublima 0,05 % 7 Tween -20 Agen pembasah

. 8 . 9 . 2. Memilih bahan strerilisasi Dalam melakukan sterilisasi eksplan, pemilihan metode sterilisasi harus selektif, termasuk dalam hal ini adalah memilih memilih bahan sterilisasi yang tepat. Setiap bahan tanam mempuntai tingkat kontaminan permukaan yang berbeda, tergantung dari: a. Jenis tanaman b. Bagian tanaman yang dipergunakan c. Morfologi permukaan( misalnya : berbulu atau tidak) d. Lingkungan tumbuh (green house atau lahan) e. Musim waktu mengambil (musim hijau/kemarau) f. Umur tanaman (seeding atau tanaman dewasa) g. Kondisi tanaman (sakit atau sehat) 3. Mensterikan eksplan dengan cara merendam bahan kimia Iodine/betadine Antiseptik Antibiotik Desinfektan

Pada dasarnya semua jenis eksplan dapat disterisasi dengan menggunakan bahan kimia. Hanya saja perlu diperhatikan kosentrasi larutan bahan kimia ynag digunakan serta lamanya perendaman. Keras, lunaknya eksplan berpengaruh terhadap penggunaan kosentrasi larutan dan lamanya perendaman. Eksplan yang lunak sebaiknya menggunakan kosentrasi bahan kimia yang rendah dan waktu yang tidak terlalu lama. Sebaiknya pada eksplan yang keras, dapat digunakan kosentrasi yang lebih tinggi dan waktu perendaman yang lama. Prosedur sterilasasi eksplan dengan memrendam dalam bahan kimia adalah eksplan dicuci dengan fungisida, eksplan dicuci dengan aquadest steril eksplan direndam dala larutan antiseptik, dan eksplan siap dinokulasi.

Cara Sterilisasi Tanaman (Eksplan) Kultur jaringan

Sebelumnya eksplan kultur jaringan (kuljar) harus dicuci dulu dengan detergen dan dibuang bagian yang tidak perlu. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan lebih dari satu bahan seperti alcohol, bahan pemutih pakaian dan HgCl2. Lamanya proses sterilisasi dan konsentrasi bahan tergantung jenis dan bagian tanaman yang digunakan. Prinsip dasar sterilisasi eksplan adalah mensterilkan eksplan dari berbagai mikroorganisme, tetapi eksplannya tidak ikut mati. Setiap tanaman memerlukan perlakuan khusus sehingga sebelum mengulturkan tanaman baru perlu melakukan percobaan sterilisasi. Untuk dapat melakukan percobaan sterilisasi kultur jaringan dengan baik, kita bisa membuat kisaran konsentrasi dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi dengan rentang yang cukup lebar. Jika dengan konsentrasi tertentu tidak terkontaminasi tetapi eksplannya mati, berarti konsentrasinya harus diturunkan. Begitu juga sebaliknya, jika masih banyak kontaminannya, konsentrasi bahan harus dinaikkan supaya tidak terkontaminasi lagi. Sama juga halnya dengan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi. Jika masih banyak kontaminasi, berarti proses sterilisasi harus lebih lama. Jika kita telah berhasil mendapatkan satu kultur jaringan saja yang bebas kontaminan, maka kita dapat memperbanyaknya dalam jumlah banyak. Untuk meningkatkan efisiensi pensterilisasian pada kultur jaringan dapat menggunakan Tween 20 dengan cara meneteskan 1-2 tetes ke dalam larutan sterilisasi. Tujuannya supaya tegangan permukaan bahan disinfektan menjadi lebih rendah sehingga bahan disinfektan

dapat menyentuh lekukan-lekukan kecil atau rongga-rongga kecil seperti celah-celah di antara bulu-bulu halus yang ada di eksplan sehingga eksplan benar-benar steril.

Semua peralatan dan bahan yang dipakai untuk sterilisasi eksplan kultur jaringan seperti Bunsen, cawan petri, botol kultur yang berisi media, botol bahan disinfektan, botol alkohol 70%, dan alat-alat disiapkan di dalam laminar air flow atau enkas. Setelah semua siap, proses sterilisasi bisa dimulai.

Eksplan kultur jaringan dimasukkan ke dalam larutan disinfektan pertama dengan konsentrasi dan waktu tertentu sambil dikocok-kocok, lalu dibilas dan dimasukkan kedalam larutan disinfektan kedua dan seterusnya hingga semua larutan disinfektan selesai dilakukan. Terakhir, eksplan dibilas dengan air steril sebanyak 3 kali, tujuannya supaya tidak terdapat sisa-sisa bahan disinfektan yang menempel di eksplan. Selain sterilisasi dengan kombinasi berbagi bahan disinfektan, bisa juga dilakukan sterilisasi bertingkat (konsentrasi bahan disinfektan semakin rendah) untuk suatu disinfektan yang dibarengi dengan pembukaan setiap daun muda sampai mata tunas telanjang. Untuk kultur anter, anter dapat dipotong dari bunga dan disterilisasi menggunakan klorox (pemutih pakaian) dan HgCl2 dan tidak memerlukan sterilisasi bertingkat.

Sebagai patokan, konsentrasi bahan dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi eksplan sebagai berikut.

Sterilisasi Ringan, Eksplan kuljar direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu dengan air steril tiga kali. Sterilisasi Sedang, Eksplan kuljar direndam dalam HgCl2 0,1-0,5 mg/l selama 7 menit, lalu dibilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu dibilas dengan air steril tiga kali. Sterilisasi Keras, Eksplan kuljar direndam dalam HgCl2 0,1-0,5 mg/l selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam alkohol 90% selama 15 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama 10 menit, lalu dibilas dengan air steril tiga kali. Teknik Kultur Jaringan Jati

Cakupan kegiatan ini meliputi beberapa tahapan meliputi : a. Seleksi material Secara teori sangat mungkin mulai melaksanakan penelitian dari bagian sel tanaman, akan tetapi yang harus dipilih adalah bagian tanaman yang masih aktif membelah seperti bagaian pucuk tanaman dari pohon induk.

b. Sterilisasi bahan tanaman

Kontrol kontaminasi dari mikroorganisme adalah sangat penting dalam proses pertumbuhan selanjutnya. Jaringan tanaman seperti meristern apikal dan kambium mungkin bebas dari mikro-organisme, tetapi jaringan lain sering terkontaminasi cendawan dan bakteri, te rutama jaringan yang berasal dari tanaman yang ditumbuhkan di lapangan. Sterilisasi permukaan dari eksplan dapat digunakan 2 % Bayclean. Penggunaan 0, 1 % Tween 80 sebagai surfactan sangat membantu penetrasi sodium hypochlorite masuk ke dalam jaringan eksplan. Selain itu eksplan dapat juga direndam dalam 70 % ethanol selama 30 -60 detik sebelum perlakuan bayclean. c. Induksi dan Multiplikasi Pemantapan kultur dan regenerasi tanaman dilakukan dengan sistem penapisan. Jenis tanaman dan media ditapis secara bersama-sama. Eksplan yang dipakai pucuk aksiler. Terdapat tiap tipe eksplan yang ditanam dalam medium MS. Pada. media yang cocok, suatu species mungkin akan menunjukkan pertumbuhan yang belum optimum. Zat pengatur tumbuh kemudian dimasukan sebagai faktor. Pada umumnya zat pengatur tumbuh yang digunakan dari golongan sitokinin, dengan konsentrasi yang digunakan berkisar 0,15 - 1,5 mg/l. Vi tamin dan sumber karbon adalah faktor tambahan yang kadang-kadang mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Tahap tersebut dapat dipakai untuk tujuan perbanyakan metalui produksi tunas aksiler, multiplikasi tunas adventif langsung atau tidak langsung atau perbanyakan melalui embrio somatik. d. Pengakaran Penggunaan medium W (white), kombinasi IBA dan IAA, sucrosa 2% dan si tokinin rendah se ring lebih baik menginduksi perakaran. Mengurangi konsentrasi medium MS menjadi x konsentrasi akan mengurangi terbentuknya kalus pada dasar tunas yang, diakarkan. e. Aklimatisasi Agar dapat bertahan di lapangan, maka dilakukan aklimatisasi jati hasil kultur jaringan. Terdapat beberapa tahapan dalam kegiatan aklimatisasi ini yaitu dengan penyungkupan dan peningkatan daya tahan terhadap cahaya matahari (perlakuan naungan). f. Mikro cutting

Kegiatan mikro cutting merupakan kelanjutan dari teknik kultur jaringan, yaitu setelah tahapan multiplikasi tanaman dilakukan penyetekan pada media padat (pasir). aklimatisasi planlet Aklimatisasi adalah proses untuk memindahkan tanaman dari kondisi heterotrof ke kondisi autotrof dan juga dari kondisi steril ke kondisi normal( tidak steril). Proses aklimatisasi dilakukan pada planlet yang kondisinya telah lengkap, yaitu telah membentuk akar, batang, dan daun. Aklimatisasi bertujuan untuk memindahkan tanaman dari kondisi ruang ke kondisi lapang. Tahap-tahap yang dilakukakan dalam prses aklimatisasi yaitu : 1. Hardening, yaitu planlet dalam botol dari kondisi runag steril di pindahkan ke

kondisi non steril dan terkena sedikit sinar matahari. Proses ini berkangsung pada 1-2 minggu. 2. Pembuatan media aklimatisasi, komposisi media yang akan di gunakan adalah

campuran cocopit dan pasir dengan perbandingan 1:1. Campuran media selanjutnya di sterilkan dengan di masak ( di rebus ) selama 1 jam, setelah itu media di dinginkan. 3. Pencician planlet. Planlet yang telah mengalami proses hardening kemudian di

keluarka dari botol. Planlet trsebut di cuci dengan air mengalir agar semua media yang masih menempel dapat di lepas, hal ini di lakukan untuk menekan tumbuhnya mikroorganisme pada planlet yang dapat mengakibatkan kegagalan proses aklimatisasi. 4. Perendaman dalam fungisida dan bakterisida, planlet yang telah bersih direndam

dalam campuran tersebut selama 15-30 menit. 5. Perendaman dalam larutan rooton, guna untuk merangsang pertumbuhan

perakaran yang pptimal maka pangkal planlet direndam dalam larutan rooton selama 15 menit. 6. Tahap selanjutnya adalah penanaman planlet pada media yang telah disediakan.

Planlet yang telah di tanam kemudian di tutup dengan menggunakan bahan tembus cahaya, kondisi ini di biarkan sampai planlet memunculkan daun baru, dan setelah daun baru muncul maka sungkup plastik di buka secara bertahap dan mulai dilakukan penyiraman pada planlet.