Cara Pengawetan dan Penyimpanan

Biakan Fungi
M. Ikhwan Setiawan
STTIF Bogor
Outline
• Prinsip Umum
• Teknik Pengawetan (Preservation)
• Keuntungan dan Kerugian
• Pemilihan Metode
Prinsip Umum
Tujuan utama
memelihara biakan
suatu fungus adalah
untuk menjaga galur
fungus tersebut di
dalam suatu media
tanpa terjadi nya
perubahan morfologi,
fisiologi, atau genetik
Prinsip Umum

• Organisme dapat
berasal dari berbagai
sumber
• Contoh :
Penicillium digitatum
 Prinsip Umum
• Teknik pengawetan sangat bervariasi, dapat
dengan mengurangi kecepatan metabolisme
atau bahkan dapat menunda metabolisme
mikroorganisme
• Pengawetan yang baik bila digunakan biakan
yang sehat dan kondisi pertumbuhan yang
optimum
• Microorganisme tumbuh dalam lingkungan dan
kondisi yang berbeda-beda
• Beberapa diantaranya memiliki spesifisitas
tertentu sebagai syarat pertumbuhannya
Prinsip Umum
• Umumnya
Mikroorganisme
tumbuh baik dalam
media yang dibuat
mendekati kondisi
lingkungan tempat
asalnya
• Contoh : tanah,
bagian tanaman
atau komponen air,
dll.
 Pertumbuhan Mikroorganisme
• Media pertumbuhan dapat bervariasi. Misalnya
Raper & Thom (1949) menggunakan Czapek's
Agar, Steep Agar and Malt Extract Agar untuk
pertumbuhan Penicillia dan Aspergilli
• Pitt (1980) menganjurkan penggunaan recommends
Czapek Yeast Autolysate (CYA) dan Malt Extract Agar
(MEA) untuk penicillia
• Standarisasi of formula media penting
dilakukan
• Media akan mempengaruhi morfologi dan warna
koloni, karena kandungan media akan mempengaruhi
pembentukan senyawa tertentu atau menginduksi sifat
tertentu dari mikroorganisme
Pertumbuhan
Pengaruh Media terhadap morfologi koloni
 Kontaminasi pada kultur fungi
• Biakan Fungi sering terkontaminasi oleh
Tyroglyphus or Tarsonemus
• Di alam banyak terdapat pada tanah, dan hampir
semua bahan organik
• Terbawa ke laboratorium dari bahan tanaman, produk
yang sudah kadaluarsa, pada sepatu, serangga atau
biakan mikroorganisme lain.

• Cepat berkembang biakdalam keadaan

lembab dan suhu ruang
• Biakan fungi menjadi rusak dan tidak dapat di simpan
 Pencegahan Kontaminasi
• Melakukan pekerjaan sesuai prosedur
• Menjaga kebersihan dan kesehatan diri
• Selalu memeriksa setiap barang yang masuk ke
laboratorium
• Menutup setiap biakan atau barang yang digunakan
sesuai prosedur
Metode pencegahan kontaminasi

Hygiene
• Bersihkan seluruh permukaan dan hindari
biakan dari udara luar dan debu
• Cuci dengan desinfektan yang
sesuai.
peralatan
Fumigation
• Digunakan selang waktu tertentu untuk ruang
laboratorium atau korikor. Pekerjaan ini harus
dilakukan oleh yang berwenang
Mechanical and chemical barriers
• Universal bottles, kapas lemak,
tube bersumbat
 Metode pencegahan kontaminasi
• Tempat penyimpanan yang aman
• Lemari pendingin 4-8°C
• Lemari penyimpanan “deep freeze” (< - 20°C)
• Menutup kultur dengan minyak mineral
• Simpan dengan silica gel
• Freeze-dry
• Simpan di ultra-low temperatures case
 Pengawetan dan Penyimpanan
• Continuous culture
Pada media padat atau cair
Refrigeration
Di bawah lapisan minyak mineral
Di dalam air
• Pengeringan
• Freeze drying
• Cryopreservation
 Pengawetan dan Penyimpanan
• Bagi biakan awal dan simpan 1 biakan
sebagai seed stock
• Simpan satu biakan sebagai
cadangan
• Setelah pengawetan, viability, purity, dan
identitas harus di cek ulang dan dibandingkan
dengan data aslinya atau referensi
• Morfologi, patogenitas, sifat-sifat fisik dan
biokimia harus diuji
• Semua pengamatan harus dicatat dan
disimpan untuk referensi di masa
yad.
 Metode Pengawetan mikroorganisme
Penumbuhan pada agar miring
• Metode yang paling mudah dan murah
• Disimpan di dalam lemari pendingin
dapat membantu mengurangi frekuensi
sub-kultur
 Metode pengawetan mikroorganisme

Kerugian metode sub-kultur pd agar

• Kemungkinan terjadi variasi genetik
akibat pemindahan berulang, hilangnya
sifat patogenitas atau karakteristik
fisiologi dan morfologi lainnya
• Kemungkinan kontaminasi besar
• Memerlukan pengawasan yang ketat
supaya biakan tidak tertukar atau
terkontaminasi
 Pengawetan dan Penyimpanan
Keuntungan metode sub-kultur pada agar :

• Koleksi biakan dapat disimpan dalam waktu

cukup lama dibawah pengawasan ahlinya.
• Metodenya cukup murah dan tidak
memerlukan teknisi khusus. Untuk jumlah
koleksi yang sedikit, metode ini cukup
menguntungkan
• Penumbuhan mudah karena tidak perlu
waktu adaptasi yang lama.
• Periode pemindahan : 2 – 4 minggu atau
2 – 4 bulan
 Di bawah minyak mineral

Biakan di atas agar miring di dalam 30 ml universal bottles lalu

dituangkan minyak mineral di atasnya. Hal ini dapat mencegah
dehidrasi dan memperlambat aktivitas metabolisme dan
pertumbuhan karena kurangnya tekanan oksigen
 Pengawetan dengan Minyak mineral
• Metode ini pertama kali digunakan oleh Buell & Weston
(1947)
• Biakan sehat yang cukup usianya ditutup dengan 10 mm
minyak mineral steril (liquid paraffin or medicinal paraffin
dengan specific gravity 0.830-0.890).
• Minyak disterilkan dengan autoklaf dua kali pada 121°C
selama 15 menit
• Penumbuhan kembali dari minyak dilakukan dengan cara
mengambil sejumlah koloni dengan jarum biakan dan
minyak dibuang sebanyak mungkin.

• Cara menginokulasiagar di posisi tengah-tengah

kadangkala memberikan hasil yang lebih baik sehingga
minyak dapat dikeluarkan dengan mudah melalui slope
Pengawetan dalam Minyak mineral

Kerugian penyimpanan dalam minyak mineral :

• Kontaminasi oleh spora mikroba dari udara
• Hambatan pertumbuhan pada saat retrieval
• Pertumbuhan terus terjadi di bawah kondisi yang
tidak nyaman dapat mengarah pada mutasi
Pengawetan dalam Minyak mineral

Keuntungan :
• Peralatan murah dan pengerjaan mudah
• Beberapa mikroorganisme hanya dapat
disimpan di dalam minyak mineral
• Namun penyimpanan di bawah minyak mineral
disarankan untuk laboratorium yang memiliki
keterbatasan sumbar daya dan fasilitas
Penyimpanan dalam air
Potongan agar atau suspensi spora dapat
disimpan dalam air
 Penyimpanan dalam air
Cara :
1.Potongan agar ukuran 6 mm diambil dari
ujung pertumbuhan koloni jamur
2.Potongan tsb ditempatkan di dalam air steril di
dalam botol McCartney dan tutup erat , lalu
disimpan pada suhu 20-25°C.
3.Peremajaan dilakukan dengan mengambil
potongan agar tsb, tempatkan terbalik pada
medium pertumbuhan yang sesuai
 Penyimpanan dalam air

• Jangka waktu penyimpanan dapat

mencapai 2-3 tahun , misalnya untuk
spesies of Phytophthora dan Pythium
tanpa adanya perubahan fisik
(Onions & Smith, 1984).
Penyimpanan dalam air
• Pertama kali dilakukan oleh Castellani
(1939, 1967) yang menyimpan fungi yang
patogen thp manusia
• Figueiredo (1967) menyimpan 22 patogen
tanaman tanpa kehilangan patogenitasnya.
• Figueiredo & Pimentel (1975) melaporkan
penyimpanan dalam air bisa mencapai
10 years
• Boeswinkel (1976) menyimpan 650
patogen
a.l. Oomycota, Ascomycota,
Basidiomycota
dan mitotic fungi selama 7 tahun.
• Ellis (1979) menyimpan
Entomophthorales, Pyrenomycetes,
Hymenomycetes, Gasteromycetes dan
Teknik pengeringan and freeze‐drying

• Penghilangan air akan mengurangi laju

metabolisme sel
• Dapat dilakukan dengan pengeringan udara
• Dapat pula dengan penambahan absorbant spt
tanah, silica gel, atau desiccant lain.
• Cara Freeze-dry dengan vacuum dari keadaan
beku dengan cara sublimasi es
What happens to a cell <-
when it freezes? -5OC
10OC

-2OC SLOW

COOL

RAPID
COOL

VERY RAPID
COOL

Response of cells to freezing. Slow cool: cells can maintaing osmostic equilibrium
by water efflux; thus cells shrink and only extracellular ice forms. Rapid cool: cells
cannot lose water rapidly enough to maintain osmotic equilibrium; thus cells
shrink slightly and contain a few large ice crystals. Very rapid cool: cells contain a
large number of small ice crystals.
Penyimpanan dalam Silica Gel

• Sporulating fungi dpt disimpan selama 7-18 tahun

• C.F. Roberts, University of Leicester menyimpan fungi
lebih dari 25 years menggunakan metode dari Perkins
(1962), semua galur terbukti stabil.
 Penyimpanan dalam Silica Gel
Cara :
1. Sepertiga penuh botol universal 30 ml isi dengan silica gel dan
sterilkan dengan dry heat (180°C selama 3 jam).
2. Tempatkan botol di dalam rak dengan air dan bekukan (nominal
- 20°C).
3. Siapkan suspensi spora di dalam 5% (w/v) skimmed milk yang
telah didinginkan.
4. Tambahkan kira-kira 1 ml biakan tersebut ke dalam silica gel dan
goyangkan agar tercampur homogen.
5. Simpan botol dengan tutup longgar selama 10-14 hari pada 25°C
sampai silica gel crystals mengering dan siap untuk dipisahkan.
6. Kencangkan tutupnya dan simpan botol pada 4°C dalam wadah
kedap udara dengan indicator silica gel untuk mengabsorbsi
lembab.
 Penyimpanan dalam Silica Gel
• Banyak fungi yang tahan lama dengan metode ini
(Perkins, 1962; Ogata, 1962; Onions, 1977;
Smith & Onions, 1983).
• Spora yang berdinding tipis cenderung tidak
dapat bertahan.
• Keberhasilannya tergantung biakan yang sehat,
dan hal ini dapat ditunjukkan dari perbedaan
biakan dari setiap isolat.
• Metode ini dpt digunakan bila fasilitas freeze-
drying tidak tersedia, walaupun ada bbrp fungi
yang tidak dapat bertahan lama dgn cara ini.
 Penyimpanan dalam Silica Gel

Penumbuhan kembali dgn cara menyebarkan beberapa

kristal ke dalam medium pertumbuhan yang sesuai
 Penyimpanan dalam Silica Gel

Kekurangan cara silica gel :

• Hanya terbatas pada sporulating fungi, dan tidak
sesuai untuk Pythium, dan
beberapa Oomycota, juga beberapa
Phytophthora
bermiselium yang memiliki spora fungi
kompleks.
• Kemungkin yang
terjadinya kontaminasi cukup
an
besar setelah beberapa kali peremajaan.
 Penyimpanan dalam Silica Gel
Keuntungan cara silica gel :
• Murah dan sederhana
• Menghasilkan biakan yang stabil untuk banyak
sporulating fungi termasuk Basidiomycota.
• Kontaminasi dari bakteri dapat dihindari karena
kondisi yang kering
• Peremajaan inokulum dapat dilakukan dengan
mengmbil beberapa butir dari satu botol, walaupun
disarankan tetap memisahkan biakan stock dari
biakan kerja.
 Penyimpanan dalam tanah

• Tanah harus diautoklaf dua kali (121 C for 15

min) sebelum diinokulasi dengan 1 ml suspensi
spora dalam air steril
• Inkubasi pada 20-25 C selama 5-10 days tergantung
pada laju pertumbuhan fungi
 Penyimpanan dalam tanah

• Fusarium (Gordon, 1952; Booth, 1971)

• Atkinson (1953) menyimpan Rhizopus, Alternaria,
Aspergillus, Circinella dan Penicillium.
• Patogenitas Septoria dari sereal 20 bulan
tetap tinggi (Shearer et al., 1974) dan juga
setelah
Pseudocercosporella selama 1 tahun (Reinecke &
Fokkema, 1979).
• Gordon's collection menunjukkan bahwa 76% isolat
Fusarium equiseti, 75% F. semitectum dan 50% F.
acuminatum tumbuh tidak terkendali (Booth, 1971).
• Penyimpanan dalam tanah sebaiknya digunakan
untuk Fusarium dibandingkan di dalam minyak
karena adanya perubahan (variasi) terjadi dalam
minyak.
 Penyimpanan dalam tanah

Keuntungan :
• Biakan dapat bertahan sampai
10 tahun.
• Peremajaan berulang dapat dilakukan
dari sampel yang sama, walaupun
sebaiknya stok harus ditempatkan
terpisah.
• Biaya murah dan alat sederhana
 Penyimpanan dalam tanah

Kerugian :
• Kemungkinan terjadi variasi genetik
• Beberapa fungi tidak dapat tahan di
desikasi
• Kemungkinan kontaminasi lebih
besar
 Oomycota
• Paling baik disimpan di bawah nitrogen cair dengan
kecepatan pendinginan 10°C min-1, walaupun
beberapa galur tidak dapat disimpan dengan cara
ini.
• Di bawah minyak mineral dapat disimpan sampai 6
bulan
• Tiga galur Phytophthora dapat tahan sampai 40
tahun (laporan dari CABI-UK)
• Kultur dapat disimpan dalam air namun perlu di
transfer setiap 2 tahun
 Zygomycota
• Nitrogen cair sangat disarankan untuk
penyimpanan Mucor, Rhizopus dan genus
lainnya
• Dapat pula dengan cara freeze-dried
• Tidak semua genus tahan proses dehidrasi,
terutama dengan silica gel, misalnya Coemansia,
Martensiomyces, Condiobolus, Entomophthora,
Piptocephalis and Syzygites. Dari genus2 ini,
hanya Piptocephalis dan Coemansia yang dapat di
freeze dried.
 Basidiomycota

• Umumnya tumbuh dalam bentuk miselium

• Fungi demikian hanya dapat disimpan dengan cara
transfer regular pada agar dengan atau tanpa
minyak, atau disimpan di nitrogen cair.
• Fungi tersebut menghasilkan dinding hifa yang
tebal jadi mudah di freeze-dried tetapi sukar
ditumbuhkan kembali
• Basidiospores yang diperoleh dari fungi yang
tumbuh di alam, dapat di freeze-dried
Fungi Deuteromycota
• Fungi yang ber konidia reltif mudah di
simpan
• Freeze-drying adalah teknik yang paling
tepat.
• Aspergillus, Penicillium and Paecilomyces
dapat disimpan mulai dari 6 bulan sampai
2 tahun pada agar miring pada -18°C.
 Ragi
• Ragi (single celled vegetative yeasts) dapat
disimpan dengan cara freeze- drying.
• Kebanyakan spesies dapat tahan disimpan
dalam silica gel namun sukar ditumbuhkan
kembali
• Liquid nitrogen adalah cara yang paling baik.
End