3084 10849 1 PB
3084 10849 1 PB
JURNAL
BIOTEKNOLOGI & BIOSAINS INDONESIA
ABSTRACT
Taro tuber (Colocasia esculenta L.) has a high starch content of 77.9% so that it can be used
as a substrate from which to isolate amylolytic bacteria. The purpose of this study was to
isolate amylolytic bacteria from taro tubers, and subsequently to identify as well as to
characterize morphologically, biochemically and molecularly using the 16S rRNA technique.
Isolation of amylolytic bacteria was carried out by growing bacterial colonies on starch agar
media and then selecting those colonies that had clear zones. Bacteria that produced clear
zones were then characterized and identified through Gram staining, spore staining,
biochemical test, and 16S rRNA molecular test. Results showed that there were seven positive
isolates of amylolytic bacteria namely ECE-1, ECE-2, ECE-3, ECE-4, ECE-5, ECE-6, and
ECE-7 isolates. Five isolates were identified using 16S rRNA technique. Identification results
showed that the seven isolates obtained were putatively identified as Pseudomonas
knackmussii, Bacillus siamensis, Bacillus siamensis, Bacillus subtilis, and Bacillus altitudinis.
Keywords: 16S rRNA analysis, amylase enzyme, amylolytic bacteria, amylum, taro tuber
ABSTRAK
Umbi talas (Colocasia esculenta L.) mempunyai kandungan pati tinggi yakni sebesar 77,9%
sehingga dapat digunakan sebagai bahan untuk mengisolasi bakteri amilolitik. Tujuan
penelitian ini adalah mengisolasi bakteri amilolitik dari umbi talas, dan kemudian
mengidentifikasi serta mengkarakterisasi secara morfologi, biokimia dan molekuler
menggunakan teknik 16S rRNA. Isolasi bakteri amilolitik dilakukan dengan cara
menumbuhkan koloni bakteri pada media starch agar dan selanjutnya memilih koloni yang
mempunyai zona bening. Bakteri yang menghasilkan zona bening kemudian dikarakterisasi
dan diidentifikasi menggunakan metode pewarnaan Gram, pewarnaan spora, uji biokimia, dan
uji molekuler 16S rRNA. Hasil menunjukkan terdapat tujuh isolat positif bakteri amilolitik yakni
isolat ECE-1, ECE-2, ECE-3, ECE-4, ECE-5, ECE-6, dan ECE-7. Lima isolat diidentifikasi
dengan teknik 16S rRNA. Hasil menunjukkan bahwa ketujuh isolat tersebut masing-masing
secara berurutan diduga teridentifikasi sebagai Pseudomonas knackmussii, Bacillus
siamensis, Bacillus siamensis, Bacillus subtilis, dan Bacillus altitudinis.
Kata Kunci: analisis 16S rRNA, amilum, bakteri amilolitik, enzim amilase, umbi talas
247
Identifikasi dan Karakterisasi Bakteri Amilolitik.... Wulandari et al.
248
J Bioteknol Biosains Indones – Vol 6 No 2 Thn 2019
249
Identifikasi dan Karakterisasi Bakteri Amilolitik.... Wulandari et al.
Tabel 1. Karakterisasi secara makroskopis pada isolat bakteri amilolitik dari umbi C. esculenta L.
Pengamatan
Isolat bakteri
Form Elevasi Margins
ECE-1 irregular flat undulate
ECE-2 circular flat entire
ECE-3 circular flat entire
ECE-4 circular flat entire
ECE-5 irregular flat undulate
ECE-6 irregular flat undulate
ECE-7 circular flat entire
Tabel 2. Hasil pengukuran zona bening dan pewarnaan Gram bakteri endofit umbi C. esculenta L yang mempunyai
aktivitas amilolitik
250
J Bioteknol Biosains Indones – Vol 6 No 2 Thn 2019
251
Identifikasi dan Karakterisasi Bakteri Amilolitik.... Wulandari et al.
EHC-1 EHC-1
EHC-2 EHC-2
EHC-3 EHC-3
EHC-4 EHC-4
EHC-5 EHC-5
EHC-6 EHC-6
EHC-7 EHC-7
Gambar 3. Hasil pewarnaan Gram pada isolat bakteri Gambar 4. Hasil pewarnaan pada spora isolat bakteri
endofit dari umbi C. esculenta L. endofit dari umbi C. esculenta L.
(perbesaran 100×) (perbesaran 100×)
252
J Bioteknol Biosains Indones – Vol 6 No 2 Thn 2019
pada dinding selnya terdapat lapisan Tabel 3. Hasil uji biokimia isolat bakteri endofit umbi C.
lipoprotein yang akan larut ketika dicuci esculenta L. menggunakan media KIA, LIA,
dengan etanol (Gram C) (Pelczar dan Chan SIM dan citrate
2005). Hasil pewarnaan Gram menunjukkan
isolat ECE-1 dan ECE-6 bersifat Gram Media
Isolat
negatif, sedangkan isolat ECE-2, ECE-3, KIA SIM LIA citrate
ECE-4, ECE-5 dan ECE-7 bersifat Gram ECE-1 𝐾⁄ 𝑆(−) –++ 𝐾⁄ 𝑆(−) +
𝐾 𝐾
positif (Tabel 2). 𝐾⁄ 𝑆(−) 𝐾⁄ 𝑆(−)
ECE-2 𝐴 +++ 𝐴 +
Tujuan dari pewarnaan spora adalah
untuk mengidentifikasi bakteri yang mampu ECE-3 𝐾⁄ 𝑆(−) ––– 𝐾⁄ 𝑆(−) –
𝐾 𝐾
menghasilkan spora. Hasil pewarnaan spora 𝐾⁄ 𝑆(−) 𝐾⁄ 𝑆(−) –
ECE-4 𝐾 ––– 𝐾
menunjukkan bahwa dari ketujuh isolat
ECE-5 𝐾⁄ 𝑆(−) ––– 𝐾⁄ 𝑆(−) –
bakteri yang diperoleh, enam di antaranya 𝐾 𝐾
mempunyai spora dan satu isolat tidak ECE-6 𝐾⁄ 𝑆(−) ––– 𝐾⁄ 𝑆(−) –
𝐾 𝐾
berspora. Isolat bakteri yang mempunyai –
ECE-7 𝐾⁄ 𝑆(−) ––– 𝐾⁄ 𝑆(−)
spora adalah isolat yakni ECE-2, ECE-3, 𝐾 𝐾
ECE-4, ECE-5, ECE-6 dan ECE-7 sedangkan
isolat ECE-1 tidak menghasilkan spora. karena pada media KIA bagian dasar dan
Spora adalah bentuk dari bakteri untuk lereng media tetap berwarna merah. Keenam
mempertahankan diri dari kondisi yang isolat tersebut juga tidak mampu
kurang mendukung untuk kehidupan dari menghasilkan sulfida.
bakteri tersebut. Hasil inokulasi pada media SIM
Spora akan lebih tahan dalam kondisi menunjukkan bahwa isolat ECE-1 tidak
yang ekstrim misalnya dalam kondisi kering, menghasilkan sulfida yang ditandai dengan
panas dan adanya senyawa kimia yang tidak terbentuknya warna hitam, mampu
bersifat racun terhadap bakteri tersebut. Cat membentuk cincin indol yang ditandai dengan
yang digunakan untuk mewarnai spora terbentuknya warna merah pada permukaan
adalah malachite green. Spora yang berhasil media setelah ditambah dengan reagen
diwarnai akan mengikat kuat cat warna ehrlich a dan ehrlich b dan motilitas positif
tersebut sehingga ketika ditutup kembali yang ditandai dengan pertumbuhan bakteri
dengan cat warna lain (Safranin) spora akan menyebar ke seluruh media. Isolat ECE-2
tetap mempertahankan warna awalnya. Hasil mampu membentuk indol sulfida dan motilitas
pewarnaan spora menunjukkan spora akan positif. Isolat ECE-3, ECE-4, ECE-5, ECE-6
berwarna hijau sedangkan sel vegetatif akan dan ECE-7 semuanya tidak mampu
berwarna merah (Gambar 4). membentuk sulfida, indol dan motilitas
negatif.
Identifikasi dengan uji biokimia Pada media LIA enam isolat yakni ECE-
Tahap identifikasi selanjutnya adalah 1, ECE-3, ECE-4, ECE-5, ECE-6 dan ECE-7
melakukan uji biokimia dengan mempunyai enzim dekarboksilasi yang
menggunakan media KIA, SIM, LIA, dan mampu menguraikan lisin sehingga media
Citrat. Identifikasi bakteri melalui pendekatan tetap berwarna ungu. Sedangkan pada isolat
biokimia dilakukan dengan melihat perilaku ECE-2 tidak mempunyai enzim
bakteri terhadap fermentasi gula maupun dekarboksilasi ditandai dengan media yang
melihat aktivitas enzim yang dimilikinya berubah menjadi kuning. Semua isolat juga
(Leonita et al. 2015). tidak menghasilkan sulfida karena tidak
Hasil identifikasi dapat dilihat pada terbentuknya warna hitam pada media.
Tabel 3. Hasil inokulasi pada media KIA Mikroba yang mampu menghasilkan lisin
diperoleh hasil isolat ECE-2 diketahui mampu dekarboksilasi media akan tetap berwarna
memfermentasikan glukosa, ditandai dengan ungu karena kondisi basa, sedangkan
bagian dasar media berwarna kuning dan mikroba yang mampu mendeaminasi lisin
tidak menghasilkan sulfida karena tidak menghasilkan warna kuning karena kondisi
terbentuk warna hitam pada media. Isolat berubah menjadi asam (Brooks et al. 2013).
ECE-1, ECE-3, ECE-4, ECE-5, ECE-6 dan Pada uji biokimia dengan
ECE-7 tidak mempunyai kemampuan menggunakan media citrate diketahui bahwa
memfermentasikan glukosa maupun laktosa ECE-1 dan ECE-2 menggunakan citrate
253
Identifikasi dan Karakterisasi Bakteri Amilolitik.... Wulandari et al.
(=EHC-1)
(=EHC-2)
(=EHC-4)
Gambar 5a. Hasil nilai kemiripan dan pohon filogenetik dari isolat ECE-1(A), ECE-2(B), dan ECE-4(C)
254
J Bioteknol Biosains Indones – Vol 6 No 2 Thn 2019
sebagai sumber karbonnya sedangkan isolat Hasil identifikasi dengan teknik 16S rRNA
ECE-3, ECE-4, ECE-5, ECE-6 dan ECE-7 Dari ketujuh isolat bakteri endofit yang
tidak menggunakan citrate sebagai sumber diperoleh, lima isolat di antaranya dilanjutkan
karbonnya. Tujuan dari uji ini adalah untuk dengan identifikasi secara molekuler dengan
mengetahui kemampuan suatu mikroba analisis 16S rRNA. 16S rRNA adalah salah
menggunakan citrate sebagai sumber satu bagian dari ribosom pada semua
karbonnya. Di dalam media citrate ini organisme prokariotik, dimana bakteri
terdapat indikator bromothymol blue. Bakteri merupakan salah satu organisme prokariotik.
yang menggunakan citrate sebagai sumber Identifikasi molekuler menggunakan 16S
karbon akan menyebabkan suasana menjadi rRNA dapat digunakan untuk
basa sehingga terjadi perubahan warna mengidentifikasi suatu bakter i pada sampel.
indikator bromothymol blue dari hijau menjadi 16S rRNA berupa sekuens yang dapat
biru intens pada daerah miring karena reaksi digunakan untuk mengidentifikasi bakteri dari
basa (Brooks et al. 2013). Perubahan warna urutan pasangan basanya, sehingga
media dari hijau menjadi biru dikarenakan diperoleh hasil yang lebih akurat
perubahan suasana pH pada media menjadi (Kusumawati 2014). Isolat yang diidentifikasi
basa karena adanya amonium yang berasal dengan analisis 16S rRNA adalah isolat ECE-
dari mono ammonium phosphate yang 1, ECE-2, ECE-4, ECE-5, dan ECE-6
terdapat pada media (Sardiani et al. 2015). sedangkan isolat ECE-3 dan ECE-7 tidak
(=EHC-5)
(=EHC-6)
Gambar 5b. Hasil nilai kemiripan dan pohon filogenetik dari isolat ECE-5(D) dan ECE-6(E)
255
Identifikasi dan Karakterisasi Bakteri Amilolitik.... Wulandari et al.
diidentifikasi dengan 16S rRNA karena hasil olahan sagu. Adapun spesies yang
mempunyai kemiripan yang tinggi dengan mereka temukan adalah Bacillus mycoides,
isolat ECE-4. Hasil sekuensing dari kelima Bacillus cereus, Bacillus licheniformis,
isolat kemudian disejajarkan dengan program Bacillus alvei, dan Serratia liquefaciens.
BLAST-N (Basic Local Alignment Search
Tool-Nucleotide) dari NCBI. Tujuan dari KESIMPULAN
pensejajaran ini adalah untuk
membandingkan hasil sekuen DNA isolat Hasil isolasi bakteri dari umbi talas (C.
bakteri yang diperoleh dengan database esculenta L.) diperoleh tujuh isolat positif
sekuen DNA dari seluruh dunia yang telah mempunyai aktivitas amilolitik yang mampu
dipublikasikan secara online pada situs NCBI menghasilkan enzim amilase. Lima isolat
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). berhasil diidentifikasi dengan analisis 16S
Hasil pensejajaran menunjukkan rRNA dan diperoleh hasil isolat ECE-1 diduga
bahwa isolat ECE-1 mempunyai nilai Pseudomonas knackmussii, isolat ECE-2
kemiripan yang tinggi dengan bakteri diduga Bacillus siamensis, Isolat ECE-4
Pseudomonas knackmussii yakni sebesar adalah Bacillus siamensis, isolat ECE-6
99% (Gambar 5a). Sedangkan isolat ECE-2 diduga Bacillus altitudinis. Isolat bakteri ECE-
mempunyai kemiripan yang tinggi dengan 3 dan ECE-7 berdasarkan uji morfologi dan
Bacillus siamensis dengan nilai kemiripan biokimia diduga golongan dari Bacillus sp.
sebesar 99% (Gambar 5a). Isolat ECE-4
mempunyai nilai kemiripan 100% dengan UCAPAN TERIMA KASIH
Bacillus siamensis (Gambar 5a). Isolat ECE-
5 mempunyai nilai kemiripan yang sangat Kepada program Penelitian Dosen
tinggi dengan bakteri Bacillus subtilis dengan Pemula yang dibiayai oleh Direktorat Riset
nilai kemiripan sebesar 99% (Gambar 5b). dan Pengabdian Masyarakat, Direktorat
Terakhir isolat ECE-6 mempunyai kemiripan Jendral Penguatan Riset dan
yang tinggi dengan bakteri Bacillus altitudinis Pengembangan, Kementerian Riset,
dengan nilai kemiripan sebesar 99% Teknologi, dan Pendidikan Tinggi, dengan
(Gambar 5b). Semakin besar nilai kemiripan Kontrak Penelitian Nomor: 005/LPPM-
maka semakin besar juga homologi suatu USb/PDP/III/2018.
makhluk hidup, derajat kemiripan urutan basa
gen penyandi 16S rRNA lebih dari 97% bukan DAFTAR PUSTAKA
merupakan spesies baru (Pangastuti 2006).
Isolat yang mempunyai nilai kemiripan 99% Agama-Acevedo E, Garcia-Suarez FJ,
merupakan bakteri dengan spesies yang Gutierrez-Meraz F, Sanchez-Rivera
sama namun mempunyai galur yang MM, Martin ES, Bello-Perez LA (2011)
berbeda. Urutan genom pada mikroba dapat Isolation and partical characterization of
digunakan sebagai kunci untuk Mexican taro (Colocasia esculenta L)
mengidentifikasi spesies mikroba tersebut. starch. Starch 63:139−146. doi:
Spesies yang sama akan memiliki banyak 10.1002/star.201000113
kesamaan pada urutan genomnya. Armougom F, Raoult D (2009) Exploring
Berdasarkan hal tersebut, pengklasifikasian microbial diversity using 16S rRNA
mikroba dapat berdasarkan informasi genotip high-throughput methods. J Comput Sci
dan fenotipnya (Yarza et al. 2014). Syst Biol 2:074−092. doi:
Hasil penelitian ini menunjukkan dari 10.4172/jcsb.1000019
ketujuh isolat bakteri yang ditemukan 6 Brooks GF, Carroll KC, Butel JS, Morse SA,
diantaranya termasuk ke dalam genus Mietzner TA (2013) Mikrobiologi
Bacillus. Penelitian Reddy et al. (2013) kedokteran Edisi 25. EGC, Jakarta
menyatakan bahwa golongan bakteri Chung A, Rainey F, Nobre MF, Burghardt J,
amilolitik terbanyak berasal dari genus da Costa MS (1997) Meiothermus
Bacillus, Lactibacillus, Clostridium, Cerbereus sp. nov., a new slightly
Mikrococcus dan Actinomycetes. Hal ini tthermophilic species with high levels of
sejalan dengan penelitian yang dilakukan 3-hydroxy fatty acids. Int J Syst
oleh Hastuti et al. (2014) yang berhasil Bacteriol 47:1225–1230. doi:
mengisolasi bakteri amilolitik dari dari limbah 10.1099/00207713-47-4-1225
256
J Bioteknol Biosains Indones – Vol 6 No 2 Thn 2019
Cole JR, Wang Q, Fish JA, Chai B, McGarrell Sardiani N, Litaay M, Budji RG, Priosambodo
DM, Sun Y, Brown CT, Porras-Alfaro A, D, Syahribulan, Dwyana Z (2015)
Kuske CR, Tiedje JM (2013) Ribosomal Potensi tunikata Rhopalaea sp. sebagai
database project: Data and tools for sumber inokulum bakteri endosimbion
high throughput rRNA analysis. Nucleic penghasil antibakteri; 1. Karakterisasi
Acids Res 42:D633−642. doi: isolat. J Alam Lingkung 6
10.1093/nar/gkt1244 Stackebrandt E, Goebel BM (1995) A place
Hastuti US, Yakub P, Khasanah HN (2014) for DNA-DNA reassociation and 16S
Biodiversity of indegenous amylolytic rRNA sequence analysis in the present
and cellulolytic bacteria in sago waste species definition in bacteriology. Int J
product at Susupu, North Moluccas. J Syst Bacteriol 44:846−849. doi:
Life Sci 8:920−924. doi: 10.1099/00207713-44-4-846
10.17265/1934-7391/2014.11.010 Setyati WA, Subagiyo S (2012) Isolasi dan
Kusumawati DE (2014) Isolasi dan seleksi bakteri penghasil enzim
karakteristik senyawa antibakteri dari ekstraseluler (proteolitik, amilolitik,
bakteri endofit tanaman miana (Coleus lipolitik dan selulolitik) yang berasal dari
scutellariodes [L.] Benth.). Curr. Biochem. sedimen kawasan mangrove. Ilm
1:45−50. doi: 10.29244/cb.1.1.45-50 Kelaut 17:164−168. doi:
Leonita S, Bintang M, Pasaribu FH (2015) 10.14710/ik.ijms.17.3.164-169
Isolasi dan identifikasi bakteri endofit Singh H, Saharan R, Sharma KP (2014)
dari tumbuhan nyawai (Ficus variegata Isolation and characterization of
Blume) sebagai penghasil senyawa amylase producing bacteria from
antibakteri. Curr Biochem 2:116–128. diverse environmental samples. J
doi: 10.29244/cb.2.3.116-128 Microbiol Biotechnol Res 4:8−18
Mitidieri S, Martinelli AHS, Schrank A, Soeka Y S (2010) Optimasi dan karakterisasii
Vainstein MH (2006) Enzymatic a-amilase dari isolat aktinomisetes
detergent formulation containing yang berasal dari Kalimantan Timur.
amylase from Aspergillus niger: A Ber Biol 10:361–367. doi:
comparative study with commercial 10.14203/beritabiologi.v10i3.751
detergent formulations. Bioresour Subhash C, Sarla S, Jaybarden (2012)
Technol 97:1217−1224. doi: Phytochemical screening of garhwal
10.1016/j.biortech.2005.05.022 himalaya wild edible tuber Colocasia
Nurmalinda A, Periadnadi, Nurmiati (2013) esculenta. Int Res J Pharm 3:181−186.
Isolasi dan karakterisasi parsial bakteri doi: 10.7879/2230-8407
indigenous pemfermentasi dari buah Tan R, Zou WX (2001) Endophytes: A rich
durian (Durio zibethinus Murr.). J Bio UA source of functional metabolites. Nat
2:8−13. doi: 10.25077/jbioua.2.1.%25p.2013 Prod Rep 18:448−459. doi: 10.1039/
Pangastuti A (2006) Definisi spesies b100918o
prokaryota berdasarkan urutan basa Türker C, Özcan BD (2015) Isolation of alpha-
gen penyandi 16S rRNA dan gen amylase producing thermophilic
penyandi protein. Biodiversitas bacillus strains and partial
7:292−296. doi: 10.13057/biodiv/d070319 characterization of the enzymes. Turk J
Pawar HA, Choudhary PD, Kamat SR (2018) Agric-Food Sci Technol 3:387−393. doi:
An overview of traditionally used herb, 10.24925/turjaf.v3i6.387-393.312
Colocasia esculenta, as a Utomo JS, Yulifianti R, Kasno A (2012) Kajian
phytomedicine. Med Aromat Plants sifat fisikokimia dan amilografi pati garut
7:1−7. doi: 10.4172/2167-0412.1000317 dan ganyong. In: Prosiding seminar
Pelczar MJ, Chan ECS (2005) Dasar-dasar hasil penelitian tanaman aneka kacang
mikrobiologi. UI Press, Jakarta dan umbi. Pusat Penelitian dan
Reddy NS, Nimmagadda A, Rao KRSS Pengembangan Tanaman Pangan,
(2003). An overview of the microbial α- Malang, pp 673−680
amylase family. Afr J Biotehnol Van der Maarel MJ, van der Veen B,
2:645−648. doi: 10.5897/AJB2003.000- Uitdehaag JC, Leemhuis H, Dijkhuizen
1119 L (2002) Properties and applications of
257
Identifikasi dan Karakterisasi Bakteri Amilolitik.... Wulandari et al.
258