Tugas Mingguan Biologi Sel dan Molekuler 30/12/2011

1. (Nilai 20) Dua struktur dasar yang berbeda diajukan sebagai model dari tight junction.
Struktur pertama yang konvensional adalah model protein. Perkembangan teknik
pengamatan sel dengan freeze-fracture electron microscopy membuka kemungkinan
untuk model lain, yaitu model lipid. Pada model ini, sealing sel antar sel pada tight
junction disebabkan oleh barrier lipid yang terbentuk sebagai hasil fusi antara dua sel
yang bersebelahan, dimana terbentuk slinder lipid pada salah satu titik fusinya (gambar
A dan B, menunjukkan perbedaan struktur kedua model tersebut)

Perbedaan ini juga memungkinkan terbentuknya dinamika yang berbeda pada fluiditas
lipid membran. Pada kedua model, lipid monolayer bagian sitosolik dapat berdifusi lebih
bebas melintasi bagian apikal dan basolateral sel. Namun berbeda untuk lipid monolayer
bagian exterior. Pada model lipid, lipid exterior tidak dapat berdifusi secara bebas
diantara bagian apikal dan basolateral, dikarenakan adanya barrier yang terbentuk karena
struktur slinder lipid. Sedangkan untuk model protein, lipid exterior dapat berdifusi lebih
bebas diantara bagian apikal dan basolateral

Sebuah percobaan dilakukan untuk menguji kedua model di atas berdasarkan

kemungkinan fluiditas lipidnya. Percobaan menggunakan galur sel MDCK yang berasal
dari sel ginjal anjing. Populasi sel tumbuh di permukaan kultur dan dapat membentuk
tight junction sehingga dapat dibedakan secara baik bagian apical dan basolateralnya.
Selain itu, sel MDCK dapat diinfeksi oleh virus influenza, dimana sel-sel yang diinfeksi
akan mengekspresikan suatu fusogenic protein. kehadiran protein fusogenic
memungkinkan untuk dilakukan manipulasi fusi liposome. 2 Kelompok sel liposom
disiapkan, pertama dengan bagian monolayer exterior terlabel fluoresense, kedua dengan
label fluoresense pada bilayer lipidnya. Pemaparan sel terinfeksi pada lingkungan dengan
pH rendah akan mengaktifkan protein fusogenic dan memungkinkannya untuk membantu
proses fusi liposom ke sel yang terinfeksi. Selanjutnya dapat diamati dinamika difusi
lipid terlabel dari liposom pada sel-sel MDCK tersebut dengan mikroskop fluoresense
(fluoresensi bagian apical dan basolateral sel dapat diamati secara terpisah/dibedakan
dengan mengatur focal plane). penghilangan Ca2+ dilakukan pada treatment yang lain,
dimana dalam kondisi Ca2+ dihilangkan, struktur tight junction akan rusak/terdisrupsi.
Hasil percobaan ditunjukkan pada gambar di bawah ini (gambar A dan B. sebagai
catatan, pada treatment A dan B (kultur sel terinfeksi ditambahkan tipe liposom yang
berbeda), hanya 50% dari kultur yang terinfeksi oleh virus influenza)
Berdasarkan data diatas, jelaskanlah model mana dari struktur tight junction yang
didukung! Jika anda merasa ragu, paparkanlah berbagai pendukung atau hal lain yang
melemahkan model anda atau model lain yang tidak anda dukung. Sebagai catatan,
metode eksperimen telah dilakukan dengan benar, jadi anda bisa menganalisisnya
berdasarkan data atau hal lain di luar metode eksperimen yang telah dilakukan.
2. (Nilai 30) Pada tahun 1953, urutan asam amino lengkap dari suatu protein untuk pertama
kali berhasil ditentukan oleh Fred Sanger. Anda mencoba menduplikasi percobaan Fred
Sanger dan memperoleh keuntungan dengan pengembangan teknik baru untuk penentuan
urutan protein. Di bawah ini ditampilkan data dari percobaan anda tersebut untuk
pengurutan sampel protein X. Berdasarkan data tersebut, tentukanlah urutan asam amino
pada protein X, beserta posisi jembatan disulfidanya (–S-S–). JELASKAN hasil deduksi
anda berdasarkan data (bukan hanya menggambarkan struktur proteinnya)

A. N-terminal analysis:
1. (PTH-Gly)
2. (PTH-Phe)
B. Carboxypeptidase A:
3. (Ala)
4. (Asn)
C. Carboxypeptidase B:
5. Nothing
D. Amino acid composition:
6. (Ala3,Arg,Asx3,Cys6,Glx7,Gly4,His2,Ilu,Leu6,Lys,[NH3]6,Phe3,Pro,Ser3,Thr,Tyr4,
Val5)
E. CNBr:
7. Same as (6)
F. Trypsin:
8. (Ala)
9. (Gly,Lys,Phe2,Pro,Thr,Tyr)
10. (Ala2,Arg,Asx3,Cys6,Glx7,Gly3,His2,Ilu,Leu6,[NH3]6,Phe,Ser3,Tyr3,Val5)
G. Chymotripsin:
11. (Ala,Lys,Pro,Thr)
12. 2(Phe)
13. 3(Tyr)
14. (Arg,Asx,Cys2,Glx,Gly2,NH3,Phe,Val)
15. (Leu)
16. (Ala,Glx,Leu,Val)
17. (Asx,Glx,His,Leu,[NH3]2,Val)
18. (Asx,Glx,NH3,Tyr)
19. (Ala,Cys4,Glx2,Gly2,His,Ilu,Leu2,NH3,Ser3,Val2)
20. (Glx,Leu,NH3)
H. Thermolysin:
21. (Gly)
22. (Ala,Lys,Pro,Thr,Tyr)
23. 3(Phe)
24. (Asx,Glx,His,[NH3]2,Val)
25. (Arg,Asx,Cys2,Glx,Gly2,NH3,Tyr,Val)
26. (Asx,Glx,Leu,NH3)
27. (Ala,Cys4,Glx2,Gly,His,Leu,NH3,Ser3,Val2)
28. 4(Leu)
29. (Ala,Glx,Val)
30. (Tyr)
31. (Ilu)
32. (Glx,NH3,Tyr)
I. Reduction and alkylation followed by thermolysin:
33. (Gly) 41. (Ala,Cys2,Glx2,NH3,Ser,Val)
34. (Ala,Lys,Pro,Thr,Tyr) 42. (Cys,Gly,His,Leu,Ser)
35. 3(Phe) 43. 4(Leu)
36. (Asx,Glx,His,[NH3]2,Val) 44. (Ala,Glx,Val)
37. (Asx,Cys,NH3,Tyr) 45. (Tyr)
38. (Arg,Cys,Glx,Gly2,Val) 46. (Ilu)
39. (Asx,Glx,Leu,NH3) 47. (Glx,NH3,Tyr)
40. (Cys,Ser,Val)
J. Reduction and alkylation:
48. (Ala,Asx2,Cys4,Glx4,Gly,Ilu,Leu2,[NH3]4,Ser2,Tyr2,Val2)
49. (Ala2,Arg,Asx,Cys2,Glx3,Gly3,His2,Leu4,Lys,[NH3]2,Phe3,Pro,Ser,Thr,Tyr2,Val3)
K. Reduction and aminoethylation followed by trypsin:
50. (Ala)
51. (Gly,Lys,Phe2,Pro,Thr,Tyr)
52. (Asx,NH3)
53. (Asx,Cys,Glx2,Leu2,[NH3]2,Ser,Tyr2)
54. (Ala,Cys,Ser,Val)
55. (Cys)
56. (Cys,Glx2,Gly,Ilu,NH3,Val)
57. (Asx,Cys,Glx,His,Leu,[NH3]2,Phe,Val)
58. (Ala,Cys,Glx,Gly,His,Leu3,Ser,Tyr,Val2)
59. (Arg,Glx,Gly)
L. Reduction and alkylation followed by pepsin:
60. (Gly,Ilu,Val)
61. (Asx,Cys,NH3,Tyr)
62. 2(Phe)
63. (Ala,Lys,Pro,Thr,Tyr)
64. (Ala,Cys3,Glx2,NH3,Ser2,Val)
65. (Cys,Gly,Leu,Val)
66. 3(Leu)
67. (Glx,NH3,Tyr)
68. (Asx,Glx,NH3)
69. (Tyr)
70. (Ala,Glx)
71. (Leu,Val)
72. (Cys,Gly,His,Leu,Ser)
73. (Asx,Glx,His,[NH3]2,Phe,Val)
74. (Arg,Glx,Gly)

M. Miscellaneous:
75. Peptide 24 give His, then Gln, with carboxypeptidase A.
76. Peptide 42 give His, then Ser, with carboxypeptidase A.
77. Peptide 41 give Ser with carboxypeptidase A.
78. Peptide 58 give AECys, then Val, then Leu, then Tyr with carboxypeptidase A
dan B
Keterangan:

A. Karakteristik pemotongan polipeptida

Pemotongan Terminal Sisi pemotongan Spesifisitas

1. Karboksipeptidase A Sisi N dari asam amino C Rn ≠ Arg, Lys, Pro
terminal Rn-1 ≠ Pro
2. Karboksipeptidase B Sisi N dari asam amino C Rn = Arg, Lys, AeCysb
terminal Rn-1 ≠ Pro
3. Degradasi Edman (N-terminal Sisi C dari asam amino N Rn = any amino acid
analysis) terminal
Pemotongan internal
4. CNBr Sisi C dari Rn Rn = Met
5. Trypsin Sisi C dari Rn Rn = Lys, Arg, AeCys
Rn+1 ≠ Pro
6. Chymotripsin Sisi C dari Rn Rn = Phe, Trp, Tyr, Leu
Rn+1 ≠ Pro
7. Thermolysin Sisi N dari Rn Rn = Leu, Ilu, Phe, Trp,
Tyr, Val
Rn-1 ≠ Pro
8. Pepsin Sisi N dari Rn Rn = Leu, Asp, Glu,
Phe, Tyr, Trp
Rn-1 ≠ Pro
b
AeCys = aminoethyl cysteine

B. Aminoetilasi merubah Cys menjadi AeCys, suatu analog Lys, sehingga dapat dipotong
oleh enzim tripsin atau karboksipeptidase B
C. Reaksi reduksi memutuskan semua ikatan disulfida pada polipeptida
D. Reaksi alkilasi mencegah reformation ikatan disulfida setelah pemutusan dengan reaksi
reduksi
E. Tiap nomor di atas merepresentasikan komposisi asam amino dari peptida(fraksi) yang
dihasilkan setelah reaksi pada isolat polipeptida X. komposisi asam amino di atas belum
diurutkan
F. Asx dan Glx artinya tidak dapat ditentukan apakah aspartat/aspargin atau
glutamin/glutamat. Ambiguitas ini muncul karena produk degradasi asam akan
menghidrolisis Asn dan Gln menghasilkan NH3 plus Asp dan Glu. NH3 tidak dapat
dideteksi oleh amino acid analyzer, sehingga kita tidak tahu apakah Asp yang dihasilkan
berasal dari Asn atau memang Asp. Namun pada soal/ di atas diasumsikan dengan suatu
teknologi telah dapat dideteksi NH3 oleh amino acid analyzer, sehingga anda dapat
menganalisa berapa Asp dan Asn atau Glu dan Gln pada suatu sampel peptida. Sebagai
tambahan dicantumkan referensi di bawah ini:
Treatment of polypeptide with 6N HCl for 20-24 hr at 110oC in vacuo hydrolizes
(cleaves) all peptide bonds. The resulting amino acids are separated and their molar ratios
are determined automatically using an amino acid analyzer. This procedure destroys Trp
 and hydrolizes Asn and Gln to NH3 plus Asp and Glu, respectively. Trp generally is
determined spectrophotometrically in a separate procedure
G. Protein X tidak mengandung tryptophan
H. PITH singkatan dari phenylthiohydantoin

**** SELAMAT LIBURAN ****