Richa Tesaliananda

1813101010063

Real-Time Polymerase Chain Reaction

Real-Time PCR (RT-PCR) nama lainnya PCR kuantitatif (Q-PCR). 1

Quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR) adalah suatu metode yang
jumlah PCR dapat ditentukan.2 Metode kuantifikasi RT-PCR bisa dilakukan pada
metode kurva standar.3 Kurva standar DNA diamplifikasi oleh qPCR, dilakukan
untuk kondisi normal bagi penguji spesifisitas primer.4 Untuk merencanakan Real-
Time PCR sebagai perangkat yang sensitif dan mudah dilakukan, metode
kuantitatif dapat menentukan ekspresi dua pompa efflux, MexAB-OprM dan
MexXY-OprM, dapat berkontribusi pada resistensi intrinsik.5

Metode lain Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan SYBR

Green I dan kurva lelehan alisis.6 SYBR Green I berfungsi untuk mendeteksi
untaian ganda (ds) Produk DNA, PCR tidak harus desain fragmen komplementer
spesifik untuk DNA.7 SYBR Green I adalah pewarna pengikat DNA alur kecil.
Dalam larutan (mis., Tidak terikat pada DNA) fluoresensinya rendah, jika terdapat
pengikatan dengan DNA beruntai ganda, fluoresensi bisa meningkat.8 Metode
pendeteksian amplikon, fragmen DNA yang direplikasi pada saat reaksi PCR,
adalah adanya perbedaan antara teknologi PCR konvensional dan real-time,
karena instrumen dapat mendeteksi intensitas sinyal fluoresensi setiap siklus
replikasi PCR.9 Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR) konvensional, yang
lebih khususnya sensitivitas lebih tinggi, spesifisitas lebih tinggi, dengan
amplifikasi yang diliat secara fluorimetri selama PCR serta memiliki potensi
untuk hasil kuantitatif.10

Sejak tahun 1985, konsep umum PCR primer yaitu, DNA polimerase,
nukleotida, ion spesifik, dan templat DNA, terdiri dari komponen-komponen yaitu
: Denaturasi, primeran, dan ekstensi.11 Konstanta laju denaturasi dan renaturasi
DNA adalah fungsi suhu operasi, dan panjang dari homologi molekul DNA. 12
Real-Time PCR primer lebih ke spesifik, untuk memperkuat fragmen 50 sampai
170-bp, diolah memakai perangkat Lunak Primer Express.5

Templat DNA sintetis untuk GAPDH, HPRT, dan HA (ATG Biosintetik)

dapat dilakukan untuk eksperimen. Primer dibuat menggunakan Probe universal
berfungsi untuk probe TaqMan ada hubungannya juga dengan HPRT dan Roche
Light Cycler BaqMan Master Mix.13 Probe yang digunakan dalam PCR kuantitatif
memiliki pewarna reporter yang fluoresensinya tinggi pada hibridisasi dengan
amplikon spesifik.8 Real-Time Polymerase Chain Reaction kuantitatif (qRT-PCR)
adalah alat yang baik untuk mengevaluasi ekspresi gen, tetapi akurasinya
tergantung pada pilihan dan stabilitasgen referensi yang digunakan untuk
normalisasi.14 Real-Time Polymerase Chain Reaction kuantitatif (qRT-PCR)
dilakukan dengan cara pengukuran yang akurat, nomor salinan gen dan ekspresi
gen.15 Peningkatan fluoresensi dapat dilihat menggunakan spektrofotometer
pendaran seperti Applied Biosystems LS-50B, 5700, 7200 dan 7700 thermal
cyclers untuk dilihat titik akhir.16 Kuantifikasi qPCR berhubungan dengan MPN
dengan model regresi biasa. Hubungan antara MPN dan qPCR dapat dilihat
ambang persamaan coeffi cient (CT) = 33,43 - 0,85 [ln (MPN)], dengan aR2
disesuaikan 0,88.17 Kemajuan terbaru dalam pendeteksian fluoresensi produk PCR
menggunakan detektor urutan ABI PRISM 7700 telah diaktifkandeteksi dan
kuantifikasi gen secara simultanurutan dalam `real-time '.18

Pada penelitian virus, Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan

gabungan lengkap primer degenerate dan deoxyinosinesines untuk herpesvirus
yang sangat terkonservasi Gen DNA polimerase sebelumnya dapat dikembangkan
untuk penemuan herpesvirus baru pada hewan.19 Real-Time Polymerase Chain
Reaction (PCR) menjadi digunakan dimetode alternatif cepat untuk mendeteksi
bakteri patogen dalam makanan. Diaplikasi ini, DNA yang akan digunakan
sebagai templat dalam PCR tidak diisolasi darisampel tetapi kultur bakteri
menjadi sasaran lisis sel dengan cara direbus.20
 DAFTAR PUSTAKA

1. Jia Y. Chapter 3 – Real-Time PCR [Internet]. Vol. 112, Methods in Cell

Biology. Elsevier; 2012. 55–68 p. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-405914-6.00003-2

2. Quantitative PCR : Things to Consider. :45–52.

3. Bailey LO, Washburn NR, Simon CG, Chan ES, Wang FW, Al BET.
Quantification of inflammatory cellular responses using real-time
polymerase chain reaction. 2004;

4. Sobanbua S, Dolkittikul S, Nakphaichit M, Keawsompong S, Nitisinprasert

S. Antimicrobial peptide presenting potential strain-specific real time
polymerase chain reaction assay for detecting the probiotic Lactobacillus
reuteri KUB-AC5 in chicken intestine. Poultry_Science [Internet].
2019;99(1):526–35. Available from: http://dx.doi.org/10.3382/ps/pez549

5. Road C. Non-invasive genetic identification of small mammal species

using real-time polymerase chain reaction. 2008;1267–9.

6. Harasawa R, Mizusawa H, Fujii M, Yamamoto J, Mukai H, Uemori T, et

al. Rapid Detection and Differentiation of the Major Mycoplasma
Contaminants in Cell Cultures Using Real-Time PCR with SYBR Green I
and Melting Curve Analysis. 2005;49(9):859–63.

7. Lo H, Chao Y. Rapid Titer Determination of Baculovirus by Quantitative

Real-Time Polymerase Chain Reaction. 2004;354–60.

8. Lee DA, Brand J, Salter D, Akanji OO, Chowdhury TT. Quantification of

mRNA using real-time PCR and Western blot analysis of MAPK events in
chondrocyte/agarose constructs. Methods Mol Biol. 2011;695(7):77–97.

9. Hanna SE, Connor CJ, Wang HH. Real-time Polymerase Chain Reaction
for the Food Microbiologist: Technologies, Applications, and Limitations. J
Food Sci. 2006;70(3):R49–53.

10. Piknova L. Detection of Salmonella enterica in food using two-step

 enrichment and real-time polymerase chain reaction. 2008;46:483–7.

11. Kralik P, Ricchi M. A Basic Guide to Real Time PCR in Microbial

Diagnostics : Definitions , Parameters , and Everything.
2017;8(February):1–9.

12. Mehra S, Hu W. A Kinetic Model of Quantitative Real-Time Polymerase

Chain Reaction. 2005;(612).

13. Ahrberg CD, Neužil P. Doubling Throughput of a Real-Time PCR. Sci Rep
[Internet]. 2015;5:1–9. Available from:
http://dx.doi.org/10.1038/srep12595

14. Abuna RPF, Freitas GP, Lopes HB, Rosa AL. Selection of reference genes
for quantitative real ‐ time polymerase chain reaction studies in rat
osteoblasts. 2018;(September 2017):1–8.

15. Sano N, Obata M, Komaru A. Quantitation of the male and female types of
mitochondrial DNA in a blue mussel , Mytilus galloprovincialis , using
real-time polymerase chain reaction assay. 2007;67–72.

16. O’Leary JJ, Sheils O, Martin C, Crowley A. TaqMan® Technology and

Real-Time Polymerase Chain Reaction. Mol Biol Cell Pathol. 2003;251–
68.

17. Furseth BJ, Conley SP, Ané J. Enumeration of Soybean-Associated

Rhizobia with Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction. 2010;
(December):2591–6.

18. Report S. Simultaneous detection and quantification of minimal residual

disease in childhood acute lymphoblastic leukaemia using real-time
polymerase chain reaction. 2000;(day 35):430–4.

19. Krascsenicsová, K., Piknová, L., Kaclíková, E., & Kuchta, T.

(2008). Detection of Salmonella enterica in food using two-step enrichment
and real-time polymerase chain reaction. Letters in Applied Microbiology,
46(4), 483–487.

20. Krascsenicsov RA, Kacl EVA. COMPARISON OF BLOCKED

THERMOSTABLE DNA POLYMERASES WITH DIFFERENT
ACTIVATION PERIODS AT. 2007;15:240–3.