Th e bahasa Inggris dan jurnal baru dari obat

Laporan singkat

Sel Punca yang Diedit CRISPR pada Pasien dengan

HIV dan Leukemia Limfositik Akut
Lei Xu, MD, Ph.D., Jun Wang, MD, Ph.D., Yulin Liu, BS, Liangfu Xie, BS, Bin Su, Ph.D., Danlei
Mou, MD, Ph.D., Longteng Wang , BS, Tingting Liu, MD,
Xiaobao Wang, BS, Bin Zhang, MD, Ph.D., Long Zhao, Ph.D., Liangding Hu,
MD, Hongmei Ning, MD, Ph.D., Yufeng Zhang, BS,
Kai Deng, Ph.D., Lifeng Liu, Ph.D., Xiaofan Lu, Ph.D., Tong Zhang, MD, Ph.D.,
Jun Xu, Ph.D., Cheng Li, Ph.D., Hao Wu, MD, Hongkui Deng, Ph.D.,
dan Hu Chen, MD, Ph.D. *

Ringkasan

Afiliasi penulis tercantum dalam Lampiran. Alamat Keamanan penyuntingan genom berbasis CRISPR (pengulangan palindromik pendek berselang-seling secara
permintaan cetak ulang ke Dr.
teratur) dalam konteks terapi gen manusia sebagian besar tidak diketahui.
H. Deng di Departemen Biologi Sel,
Sekolah Ilmu Kedokteran Dasar, Pusat Penelitian
CCR5 adalah target yang masuk akal tetapi tidak mutlak protektif untuk penyembuhan infeksi human
Sel Punca Universitas Peking, Laboratorium Kunci immunodeficiency virus tipe 1 (HIV-1), karena CCR5- sel darah nol sebagian besar resisten terhadap
Negara Alam dan Bio-
masuknya HIV-1. Kami mentransplantasikan CRISPR-diedit CCR5- ablated stem hematopoietic dan sel
Obat mimetik, Kesehatan Universitas Peking
Pusat Sains, dan Laboratorium Kunci MOE dari
progenitor (HSPCs) menjadi pasien dengan infeksi HIV-1 dan leukemia limfoblastik akut. Leukemia
Proliferasi dan Diferensiasi Sel, Sekolah Tinggi Ilmu limfoblastik akut sembuh total dengan chimerism donor penuh, dan sel donor membawa ablasi.
Hayati, Peking–
Pusat Tsinghua untuk Ilmu Hayati, Peking
Universitas, No. 5, Yiheyuan Rd., Beijing
CCR5 bertahan selama lebih dari 19 bulan tanpa efek samping terkait pengeditan gen.
100871, China, atau di hongkui_deng @ pku Persentase sel CD4 + dengan CCR5 ablasi meningkat sedikit selama periode penghentian terapi
. edu.cn.
antiretroviral. Meskipun kami berhasil mencapai transplantasi dan pencangkokan jangka panjang
* Meninggal. HSPC yang diedit CRISPR, persentase CCR5 gangguan pada limfosit hanya sekitar 5%, yang
Dr. L. Xu, Dr. J. Wang, Mr. Y. Liu, dan Mr.
mengindikasikan perlunya penelitian lebih lanjut terhadap pendekatan ini. (Didanai oleh Komisi
L. Xie dan Drs. H. Wu, H. Deng, dan H. Sains dan Teknologi Kota Beijing dan lainnya; ClinicalTrials.gov
Chen berkontribusi sama besar untuk artikel ini.

Artikel ini diterbitkan pada bulan September nomor, NCT03164135.)

11, 2019, di NEJM.org.

N Engl J Med 2019; 381: 1240-7. DOI:

C
10.1056 / NEJMoa1817426
Hak Cipta © 2019 Massachusetts Medical Society.
mengulangi teknologi [CRISPR] –CRISPR terkait protein 9 [Cas9]) telah
RISPR – Cas9
diterapkan (berkelompok
secara palindromik
luas untuk mengedit genom pendek bersilangan
sel mamalia secara
secara in vitro. teratur
1-4 Meskipun

pendekatan ini menunjukkan kegunaan klinis yang potensial dan uji klinis telah dimulai untuk
mengeksplorasi keamanan dan kelayakan terapi berbasis CRISPR (misalnya, nomor
ClinicalTrials.gov, NCT03655678 dan NCT03399448), hasil uji coba ini belum dilaporkan. 5

Telah terbukti bahwa pemberantasan jangka panjang human immunodeficiency virus tipe 1 (HIV-1) dapat
dicapai setelah transplantasi alogenik sel punca dan progenitor hematopoietik (HSPCs) yang terjadi secara
alami. CCR5 mutasi, karena CCR5 adalah koreseptor kunci untuk masuknya HIV. 6-9 Kasus ini meningkatkan
kemungkinan transplantasi dengan sel di dalamnya CCR5 terganggu secara artifisial mungkin merupakan
pendekatan alternatif untuk membuat sel resisten terhadap infeksi HIV-1. Dalam studi sebelumnya, kami
membuat sistem pengeditan genom CRISPR bebas virus yang dihasilkan

CCR5 gangguan pada HSPC manusia dengan efisiensi 27%. 10 Pada seekor binatang

1240 n engl j med 381; 13 nejm.org 26 September 2019

Jurnal Kedokteran New England

Diunduh dari nejm.org pada 28 September 2020. Hanya untuk penggunaan pribadi. Tidak ada kegunaan lain tanpa izin.
Hak Cipta © 2019 Massachusetts Medical Society. Seluruh hak cipta.
 Laporan singkat

model, ini CCR5- HSPC yang dimodifikasi secara kuat sel mononuklear darah dari donor dan kemudian menjalani
menghasilkan sistem kekebalan manusia yang resistan pemeriksaan CRISPR pada berkas
terhadap infeksi HIV-1. Di sini, kami melaporkan transplantasi CCR5 tempat. Karena keterbatasan dalam efisiensi penyortiran,
alogenik CCR5- mengedit HSPCs menjadi pasien dengan infeksi sel-sel yang kekurangan CD34 (2,66 × 10 10 sel) mengandung
HIV-1 yang telah berkembang menjadi leukemia limfoblastik sel CD34 + sisa, yang menyumbang 28,8% dari total sel CD34
akut. + (Tabel S1 dalam Lampiran Tambahan). Kedua CCR5- sel
CD34 + yang diedit (2.84 × 10 6 sel per kilogram) dan sel tanpa
CD34 yang tidak diedit (3,21 × 10 8 karyo-
Laporan Kasus

Seorang pria 27 tahun menerima diagnosis HIV-
AIDS (sindrom imunodefisiensi didapat) dan 14 Mei dan 30
leukemia limfoblastik akut (tipe sel T) pada nosis, viral load lopinavir-ritonavir diganti dengan untuk menghindari
Mei 2016, masing-masing. Pada diagmilliliter, dan jumlah
HIV adalah 8,5 × 10 6 salinan per liter. Obat antiretroviral
CD4 + adalah 528 × 10 6
(lamivudine dengan dosis setiap hari, dan
dari 300 mg sehari, tenofovir dengan takaran 300 mg lopinavir
lopinavir-ritonavir dengan dosis 400 mg segera diberikan,
dan 100 mg ritonavir dua kali sehari) untuk mengendalikan
yang menghasilkan virus RNA dalam serum (<40
infeksi HIV-1 dan ter tidak terdeteksi setelah 1 tahun. Pasien
eksemplar per mililiof kemoterapi standar untuk bagian
menerima enam program tic leukemia (lihat Metode:
limfoblasRegimens akut di AppenNEJM.org), yang
cytes per kilogram) koinfus ke dalam obat paviral
tegang. Selama transplantasi, antiretroraltegravir
(dengan dosis 400 mg setiap 12 jam) profilaksis
interaksi obat dengan siklosporin. Untuk pasien menerima
melawan penyakit graft-versus-host, metotreksat,
siklosporin, perjalanan singkat tubuh), dan mofetil
basiliximab (antikoid anti-CD25 dan tacrolimus
mikofenolat. Pengobatan glukokortithe penyakit
digunakan terus menerus untuk
graft-versus-host (Gbr. 1A).
Metode
Pengawasan Studi

Kemoterapi Penelitian ini dirancang untuk menilai keamanan dan

menyebabkan morfologi lengkap ditambang dengan
dix, tersedia dengan teks lengkap artikel ini di remisi.
sitometri aliran, masing-masing adalah 3,10% kemoterapi,
Penyakit sisa minimal, tentukan 0,04% sebelum kursus
dan menjadi tidak terdeteksi-
kelima dan keenam mampu (<0,01%) setelah kursus
keenam.
Penularan HIV ditentukan sebagai metode. 11,12 Pasien
CCR5- Tropic berdasarkan tingkat RNA HIV plasma yang
memiliki tidak terdeteksi (jumlah CD4 +, 201,31 × 10 6 per
dijelaskan sebelumnya dan memiliki donor laki-laki limfopenia
liter). Program 33 tahun yang belum dimutasi CCR5 gen
dari China Marrow Donor jenis HLA yang cocok sepenuhnya (A *
memiliki 58:01; C * 03: 02, 04:03; DRB1 * 03: 01, 11:01;
02: 23, 33:03; B * 39: 01, DQ * 02: 01, 03: 01). Pada tanggal 9
dan menjalani sel induk hematopoietik alogenik dengan
Juli 2017, transplantasi pasien setelah pengkondisian
siklofosfamid dengan dosis 60 mg per −3) dan iradiasi
kelayakan transplantasi pasien CRISPR dengan kanker
HSPC termodifikasi Cas9 menjadi paconsent HIV-1-positif
hematologi. Informasi tertulis telah disetujui oleh komite
disediakan oleh pasien. Studi Rumah Sakit Tentara
etik dari 307 China. Tidak ada sponsor komersial yang
Pembebasan Rakyat dalam eksperimen dilakukan sesuai
terlibat. Semua protokol (tersedia di NEJM.org). Naskah
dengan yang dirancang oleh tiga penulis terakhir. Yang
studi ditulis dan direvisi oleh yang pertama, semua
ketiga, dan dua penulis terakhir dan telah disetujui oleh
penulis. Penulis melakukan kurasi data dan untuk
analisis dan menjamin kelengkapan dan studi protokol.
kepatuhan
Pengeditan Gen dan Sel Preinfusi
Persiapan

mieloablatif kilogram berat badan per hari (pada hari -4 dan per
tubuh total dengan dosis 5,0 Gy
hari (pada hari -2 dan -1).
CD34 + HSPCs (2,36 × 10 8 sel) diurutkan
dengan manik-manik magnet dari perangkat mobilisasi-
Sel darah perifer dimobilisasi dari ekspresi HLACD34
donor yang cocok dipisahkan berdasarkan sistem,
dengan menggunakan ion CliniMACS. Populasi yang
mengikuti instruksi pabrik, setara dengan 71,2% dari
disortir adalah 95% CD34 + (Tabel S1 dalam Lampiran
total sel CD34 +
Tambahan). Disortir

n engl j med 381; 13 nejm.org 26 September 2019 1241

Jurnal Kedokteran New England

Diunduh dari nejm.org pada 28 September 2020. Hanya untuk penggunaan pribadi. Tidak ada kegunaan lain tanpa izin.
Hak Cipta © 2019 Massachusetts Medical Society. Seluruh hak cipta.
 Th e bahasa Inggris dan jurnal baru dari obat

SEBUAH Jumlah Sel dalam Darah Perifer

Sel darah putih Neutrofil Limfosit Hemoglobin Trombosit

Siklofosfamid dan
iradiasi tubuh total

Methotrexate dan basiliximab

Mycophenolate mofetil
Pengobatan

SENI
Tacrolimus siklosporin IV gangguan

Siklosporin oral

Glukokortikoid

40 400

30

20 300
Hitungan Sel (10 −9 × liter)

atau Trombosit (10 −9 × liter)

Hemoglobin (g / liter)
15

200

10

100
5

0 0
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600

Hari sejak Transplantasi

B Ganti CCR5 Tingkat Modifikasi di Sumsum Tulang C CCR5 Tingkat Modifikasi pada 19 Mo

10 8

8
6
CCR5 Efisiensi Modifikasi
CCR5 Tingkat Modifikasi

6
4
(%)

(%)

2
2

0 0
0 100 200 300 400 500 600
4

19

33
h

5a
D

D
a
al

D
C

C
ar

23
C

C
er

Hari sejak Transplantasi

D

D
rif

C
Pe

Gambar 1. Ukiran dari CCR5- Sel yang Dimodifikasi.

Jumlah sel sel darah putih, neutrofil, dan limfosit dalam darah tepi dari waktu ke waktu ditampilkan pada sumbu y kiri Panel A, dan fluktuasi
kadar hemoglobin dan jumlah trombosit ditampilkan di sumbu y kanan. Rejimen prakondisi utama mengandung siklofosfamid (pada hari -4
dan -3) dan iradiasi seluruh tubuh (pada hari -2 dan -1). Pengobatan imunosupresi termasuk metotreksat (pada hari ke 1, 3, dan 6),
basiliximab (pada hari ke 0, 4, dan
8), mycophenolate mofetil (dimulai pada hari 0 dan meruncing dari hari 31 hingga 47), dan siklosporin (diberikan secara intravena [IV] dari hari ke-1 hingga hari
ke-30 dan secara oral dari hari ke-31 hingga ke-74). Penyakit graft-versus-host diobati dengan glukokortikoid (metilprednisolon atau prednison, diberikan secara
intravena dari hari ke 32 sampai hari ke 124 dan diturunkan secara oral dari hari ke 125 sampai 185) dan tacrolimus (diberikan secara oral dari hari ke 75 sampai
156 dan diturunkan dari hari ke 157 sampai 185) . Terapi antiretroviral (ART) dihentikan dari hari ke-221 sampai hari ke-249. Desain papan kotak-kotak
menggambarkan periode pengurangan. Panel B menunjukkan CCR5 efisiensi gangguan gen pada kariosit sumsum tulang yang dideteksi dengan sekuensing
dalam pada titik waktu yang berbeda setelah transplantasi. Panel C menunjukkan CCR5 efisiensi gangguan gen pada berbagai jenis sel dari sampel darah tepi
diperoleh 19 bulan setelah transplantasi.

1242 n engl j med 381; 13 nejm.org 26 September 2019

Jurnal Kedokteran New England

Diunduh dari nejm.org pada 28 September 2020. Hanya untuk penggunaan pribadi. Tidak ada kegunaan lain tanpa izin.
Hak Cipta © 2019 Massachusetts Medical Society. Seluruh hak cipta.
 Laporan singkat

Tabel 1. Nilai Laboratorium Utama sebelum dan sesudah Transplantasi. Mengukur

Jarak normal Penyaringan Setelah Transplantasi

3 Mo 6 Mo 9 Mo 12 Mo 15 Mo 19 Mo

Jumlah sel darah putih (10 −9 / liter) 3.5–9.5 5.41 4.89 7.53 6.49 9.63 11.57 7.52

Jumlah neutrofil (10 −9 / liter) 1.80–6.30 3.17 3.27 4.88 2.31 5.04 6.16 3.59

Jumlah limfosit (10 −9 / liter) 1.10–3.20 1.42 1.22 2.02 3.28 3.25 4.11 3.27

Jumlah CD4 + sel (10 −6 / liter) jumlah 404–1612 201.31 285.75 592.94 718.85 467,97 641,00 802.58

CD8 + sel (10 −6 / liter) Jumlah sel darah 220–1129 964.85 1239.86 1959.35 3002.72 1595.43 1629.91 2380.74

merah (10 −12 / liter) 4.3–5.8 4.05 3.33 3.33 3.75 4.00 4.40 4.20

Hemoglobin (g / liter) 130–175 131 123 107 131 131 139 127

Jumlah trombosit (10 −9 / liter) 125–350 133 52 122 144 159 250 289

Kreatinin (μmol / liter) * 40–106 85 48 63 74 82 69.5 62

Alanine aminotransferase (U / liter) 9–50 26 40 29 35 40 25 37

Aspartate aminotransferase (U / liter) 15–40 15 24 20 32 28 32 18

Total bilirubin (μmol / liter) † 2–20 10.3 7.9 5.0 8.5 7.6 7.9 11.8

Nilai sumsum tulang (%) ‡

Ledakan <5 2.0 0,5 0,5 0,5 0,5 2.0 1.5

Penyakit sisa minimal - 0 0 0 0 0 0 0

Rasio chimeric > 95 - 99,56 99.83 99.74 99,56 100 100

WT1 - ABL - 0,085 0.173 0,053 0,368 0,041 0,034 0.463

* Untuk mengubah nilai kreatinin menjadi miligram per desiliter, bagi dengan 88,4. † Untuk mengubah
nilai bilirubin menjadi miligram per desiliter, bagi dengan 17,1.

‡ Ledakan, penyakit sisa minimal, dan rasio chimeric ditentukan dengan morfologi, aliran sitometri, dan urutan pengulangan tandem pendek, masing-masing. WT1 - ABL adalah
tingkat ekspresi dari gen tumor Wilms yang dinormalisasi menjadi gen Abelson.

HSPC dibiakkan dalam media bebas serum selama 48 jam Hasil

sebelum transfeksi dengan kompleks ribonukleo-protein yang
terdiri dari protein Cas9 dan dua panduan penargetan RNA yang Pencangkokan Penerima dan Pengujian
dirancang sebelumnya. Leukemia Limfoblastik Akut

CCR5. 10 Sel yang diedit gen dikultur selama 2 jam untuk pemulihan.
Sel-sel yang kekurangan CD34, sel-sel darah perifer yang
dimobilisasi yang tersisa dari donor setelah pemilahan CD34,
ditransplantasikan dengan sel CD34 + yang telah diedit.
Pengujian Pengeditan Gen
Efisiensi pengeditan gen dievaluasi dengan cara
sekuensing Sanger dan sekuensing dalam (3 juta bacaan)
dari genom sel sumsum tulang besar penerima, sel CD34
+ dari sumsum tulang, sel darah tepi, dan sel CD4 + dari
sel perifer. darah. Untuk menyelidiki potensi efek di luar
target dari sistem pengeditan gen CRISPR, sekuensing
seluruh genom dilakukan pada sel yang diedit setelah
pengeditan genom dan setelah engraftment.
Engraftment neutrofil dan platelet terjadi pada hari ke 13
dan 27, masing-masing, setelah transplantasi (lihat
bagian Metode: Transplantasi Alogenik di Lampiran
Tambahan). Jumlah limfosit dan subset T-limfosit
meningkat setelah transplantasi, disertai dengan
pemulihan jumlah sel CD4 + menjadi 592,94 × 10 6 per
liter di bulan ke 6 dan stabilisasinya dalam kisaran
normal (Tabel 1). Meskipun jumlah trombosit menurun
drastis pada bulan ke-3, jumlah tersebut pulih secara
spontan dan stabil dalam kisaran normal (Gbr. 1A).
Chimerism donor penuh dicapai pada minggu ke-4
setelah transplantasi dan bertahan hingga titik waktu
terakhir, 19 bulan setelah transplantasi.
Leukemia limfoblastik akut mengalami remisi total
morfologis pada minggu ke-4 setelahnya

n engl j med 381; 13 nejm.org 26 September 2019 1243

Jurnal Kedokteran New England

Diunduh dari nejm.org pada 28 September 2020. Hanya untuk penggunaan pribadi. Tidak ada kegunaan lain tanpa izin.
Hak Cipta © 2019 Massachusetts Medical Society. Seluruh hak cipta.
 Th e bahasa Inggris dan jurnal baru dari obat

transplantasi; remisi ini berlanjut selama periode tindak
lanjut 19 bulan. Selain itu, penyakit sisa minimal tetap
tidak terdeteksi untuk fenotipe terkait leukemia
berdasarkan aliran sitometri. Tingkat ekspresi gen tumor
Wilms ( WT1) dinormalisasi ke gen Abelson ( ABL) -
peningkatan prediksi kambuh - kurang dari 0,5% setelah
transplantasi, yang merupakan tingkat yang tidak
berubah dari sebelum transplantasi (Tabel 1). 13,14
CCR5 Pengeditan Gen
HSPC yang disortir dan diturunkan dari donor (sel CD34 +)
diedit dengan menggunakan CRISPR – Cas9, menghasilkan CCR5
efisiensi penyisipan atau penghapusan (indel) sebesar 17,8%
yang ditunjukkan dengan sekuensing. Jika HSPC yang diedit
tidak menghasilkan engraftment jangka panjang, HSPC yang
diedit gen ditransplantasikan dengan sel yang kekurangan
2 minggu, yang diatasi dengan penggunaan terapi antibiotik
standar. Penyakit graft-versus-host akut (pada kulit; derajat
1), frekuensi kencing dan urgensi (derajat 2), viremia
sitomegalovirus (derajat
3), dan reaktivasi herpes simpleks terjadi pada bulan
ke-2. Eksotropia mata kiri intermiten, gejala mirip
influenza, dan peningkatan kadar aminotransferase
diamati secara berturut-turut dari bulan ke-5 setelah
transplantasi hingga titik waktu terakhir mengikuti -naik.
Semua peristiwa ini diselesaikan. Tidak ada efek samping
yang terkait CCR5 pengeditan gen dicatat (Tabel S2 di
Lampiran Tambahan).
Untuk memeriksa efek off-target dari pengeditan gen, kami
melakukan sekuensing genome-lebar throughput tinggi pada
cakupan 100x untuk menganalisis genom HSPC yang
dimodifikasi yang diambil dari produk prarilis. Kami pertama kali
menganalisis situs di luar target yang diprediksi sebelumnya

CD34, yang berisi 28,8% dari total sel CD34 +. Akibatnya, dalam sistem kami (chr4: 18476075–18476173); Pembelahan

proporsi CCR5 ablasi dalam genom kariosit sumsum tulang DNA tidak terdeteksi di situs ini dalam penelitian ini. 10

berkisar antara 5,20% dan 8,28% selama engraftment jangka

panjang 19 bulan (Gbr. 1B). Jenis perwakilan dari CCR5 mutasi Untuk mengidentifikasi situs lain yang berpotensi di luar target, kami
gen ditunjukkan pada Gambar S1 di Lampiran Tambahan. menggunakan alat terkomputerisasi untuk memprediksi lokus 1997
Pengurutan dalam digunakan untuk menentukan efisiensi menjadi kandidat dengan membandingkan dua RNA pemandu tunggal
ablasi gen dalam beberapa garis keturunan hematopoietik, dalam sistem kami dengan genom manusia. 16 Menggunakan data
termasuk sel CD4 +, CD8 +, CD19 +, CD33 +, dan CD235a +. CCR5
sekuensing seluruh genom, kami mengecualikan situs kandidat tanpa
ablasi terdeteksi pada beberapa garis keturunan darah, dan indel di dekat situs prediksi dalam HSPC yang dimodifikasi, dengan
tingkat efisiensi pengeditan yang serupa atau sedikit lebih tinggi indel yang terdeteksi dalam sampel donor, atau dengan indel yang
diamati pada sel CD19 +, CD33 +, dan CD235a +, diidentifikasi sebelumnya, dan kami memperoleh 26 kandidat situs
dibandingkan dengan total kariosit darah tepi (Gambar 1C). termasuk 2 lokus target (Tabel S3 dalam Lampiran Tambahan). Kami
Tingkat CCR5 ablasi dalam sel CD4 + dan CD8 + tidak setinggi selanjutnya melakukan pengurutan mendalam untuk memvalidasi 24
pada subset sel lainnya, mungkin karena persistensi jangka calon situs di luar target ini. Indel terdeteksi hanya di 14 lokasi, yang
panjang dari sel T dalam sel koinfus yang kekurangan CD34. 15 Hasil
semuanya merupakan varian panjang 1-bp pada pengulangan
ini secara kolektif menunjukkan bahwa HSPC yang disunting nukleotida dan dengan demikian tidak dianggap sebagai peristiwa di
CRISPR berhasil menyusun dan berdiferensiasi menjadi luar target yang sebenarnya.
beberapa garis keturunan yang mempertahankan penyuntingan
gen.

Untuk menentukan apakah ada pengeditan di luar target yang

Analisis Keamanan
Pasien menunjukkan efek samping yang dapat diprediksi setelah
pengkondisian awal, termasuk anemia (kadar hemoglobin, 79 g
per liter pada hari ke 22), neuropenia (neutrofil tidak terdeteksi
pada hari ke 0), dan trombositopenia (jumlah trombosit, 12 × 10 9 per
liter pada hari ke 6). Tidak ada respon imun akut yang diamati
setelah infus sel donor. Neutropenia demam (tingkat 3) dan
bakteremia ( Staphylococcus epidermidis; kelas 3)
dikembangkan di kelas satu
muncul setelah engraftment, kami melakukan uji sekuensing genom
keseluruhan pada sampel darah sumsum tulang yang diperoleh pada
minggu ke 15, bulan.
12, dan 19 bulan setelah transplantasi. Tidak ada situs di luar target
yang diidentifikasi dalam sampel ini. Selain itu, tidak ada
pengaturan ulang kromosom atau penghapusan jarak jauh yang
diidentifikasi di salah satu dari empat kumpulan data sekuensing
genom utuh.
Pengukuran Viral Load HIV-1
Pekerjaan sebelumnya telah menunjukkan bahwa infus
autologous CCR5- sel T yang diedit dapat menurunkan viral
load pada pasien selama periode 4 minggu penghentian
ART. 17 Temuan ini-

1244 n engl j med 381; 13 nejm.org 26 September 2019

Jurnal Kedokteran New England

Diunduh dari nejm.org pada 28 September 2020. Hanya untuk penggunaan pribadi. Tidak ada kegunaan lain tanpa izin.
Hak Cipta © 2019 Massachusetts Medical Society. Seluruh hak cipta.
 Laporan singkat

Hal ini menunjukkan bahwa penghapusan CCR5 mungkin berpotensi Diskusi

untuk mengurangi penggunaan terapi antiretroviral jangka panjang.
Untuk menentukan apakah CCR5-
sel punca yang telah diedit dapat memberikan manfaat
yang serupa pada pasien kami, penghentian terapi
antiretroviral diusulkan. Setelah kami memperoleh
persetujuan tertulis yang terpisah dari pasien, yang secara
khusus terkait dengan penghentian sementara terapi
antiretroviral, penghentian analitik yang direncanakan
dilakukan 7 bulan setelah transplantasi ketika jumlah sel
CD4 + pasien meningkat ke nilai di nor- kisaran mal dan
salinan viral load HIV dalam plasma tetap tidak terdeteksi.
Viral load serum meningkat menjadi 3 × 10 7 salinan
per mililiter pada minggu ke-4 selama penghentian terapi
antiretroviral, dan obat tersebut kemudian dilanjutkan
(Gambar 2A). Viral load secara bertahap menurun ke
tingkat tidak terdeteksi selama beberapa bulan
berikutnya. Selama penghentian terapi antiretroviral,
jumlah CD4 + perifer menurun dari 575 × 10 6 per liter
sampai 250 × 10 6 per liter, dan tren yang sama diamati
pada rasio sel CD4 + ke sel CD8 +. Selain itu, tingkat CCR5yang menunjukkan keberhasilan engraftment jangka panjang CCR5-
gangguan pada sel CD4 + perifer sebelum gangguan
adalah 2,96%. Tingkat CCR5 gangguan pada sel CD4 +
memuncak (4,39%) selama interupsi, pada tingkat yang
1,6 kali lebih besar dari tingkat rata-rata, dan disertai
dengan penurunan jumlah sel CD4 + (360 × 10 6 per liter).
Selain itu, jumlah sel kekebalan dievaluasi sebelum dan
sesudah transplantasi. CD4 + T-limfopenia berkembang
sebelum transplantasi, pada saat jumlah sel 201,31 × 10 6 sehingga memberikan perlindungan kepada pasien dari
per liter (Tabel 1), dan jumlah CD4 + meningkat ke nilai
dalam kisaran normal pada bulan ke-6 setelah
transplantasi (Gambar 2C) dan sementara infeksi HIV-1
dapat dikendalikan dengan terapi antiretroviral.
Untuk mengidentifikasi tropisme HIV setelah
transplantasi, kami menguji sampel darah tepi pada
bulan ke 8 dan 19 setelah transplantasi, dan tropisme
virus tetap ada. CCR5. Selain itu, reservoir perifer HIV-1
dievaluasi dengan deteksi salinan DNA HIV-1 dalam sel
CD4 + perifer. Tingkat DNA HIV-1 total dan terintegrasi
adalah 734 dan 72,5 salinan per juta sel CD4 +, setelah
transplantasi (Gambar S2 dalam Lampiran Tambahan).
Peningkatan cepat mereka setelah penghentian terapi
antiretroviral bertepatan dengan munculnya viral load
yang dapat diukur.
Kami melaporkan transplantasi alogenik yang sukses dan
engraftment jangka panjang CRISPR – Cas9– diedit, CCR5-
ablasi HSPC pada pasien dengan infeksi HIV-1 dan
leukemia limfoblas akut. Sel-sel donor terukir dengan
kapur penuh, dan leukemia limfoblastik akut sembuh total
selama 19 bulan setelah transplantasi, selama waktu itu
sel-sel dengan yang dimodifikasi. CCR5 gen bertahan,
dan gangguan CCR5 berkisar dari 5,20 hingga 8,28% di
sel sumsum tulang (Gbr. 1B). Hasil ini menunjukkan bukti
prinsip bahwa transplantasi dan engraftment jangka
panjang HSPC alogenik yang diedit CRISPR dapat
dicapai; namun, tanggapan yang efisien tidak memadai
untuk mencapai target penyembuhan infeksi HIV-1.
CRISPR-mediated CCR5 efisiensi ablasi adalah
5,20 sampai 8,28% dalam sampel sumsum tulang selama 19 bulan
masa tindak lanjut (Gbr. 1B), dan CRISPR-mediated CCR5 ablasi
diamati pada beberapa garis keturunan hematopoietik (Gbr. 1C),
ablasi HSPC pada pasien. Secara khusus, sel CD4 +
dengan CCR5 Indel terus diproduksi dan dilepaskan ke
dalam darah perifer (Gambar 2C), dan jumlah sel CD4 +
darah tepi secara bertahap pulih ke kisaran normal pada
bulan ke 6 setelah transplantasi sementara pasien
menerima pengobatan untuk infeksi HIV-1 (Gambar 2B),
infeksi oportunistik.
Aspek penting dari penelitian kami adalah evaluasi
keamanan klinis terapi gen yang dimediasi CRISPR-Cas9.
Terapi gen berbasis HSPC sebelumnya kurang efektif karena
integrasi acak DNA eksogen ke dalam genom, yang
terkadang memicu respons imun akut atau neoplasia. 18,19 Dalam
penelitian kami, ribonukleotrotein Cas9 diperkenalkan melalui
transfeksi nonviral untuk menghindari pengenalan DNA
eksogen dan mencegah keberadaan Cas9 dalam jangka
panjang dalam sel yang ditargetkan, yang merupakan faktor
penyebab potensial untuk kematian yang tidak terduga.
-target indels. 20,21 Menggunakan uji genom utuh throughput
tinggi untuk mensurvei sampel prapransplantasi serta sampel
yang diperoleh pada 15 minggu, 12 bulan, dan 19 bulan
setelah transplantasi, kami tidak mendeteksi varian nukleotida
tunggal, penghapusan besar, atau penataan ulang kromosom
terkait. untuk modifikasi CRISPR. Selain itu, tidak ada bukti
efek samping terkait pengeditan gen

n engl j med 381; 13 nejm.org 26 September 2019 1245

Jurnal Kedokteran New England

Diunduh dari nejm.org pada 28 September 2020. Hanya untuk penggunaan pribadi. Tidak ada kegunaan lain tanpa izin.
Hak Cipta © 2019 Massachusetts Medical Society. Seluruh hak cipta.
 Th e bahasa Inggris dan jurnal baru dari obat

SEBUAH
Terapi antiretroviral
periode interupsi
8

Viral Load (log [salinan / ml])

6

0
100 150 200 250 300 350 400

Hari sejak Transplantasi

B
Terapi antiretroviral
periode interupsi
1200 0,5

0.4
900
Hitungan Sel (10 −6 × liter)

Rasio CD4 + ke CD8 + Sel

Perbandingan
0.3
600
0.2

300 CD4 0.1

0 0.0
100 150 200 250 300 350 400

Hari sejak Transplantasi

C
Terapi antiretroviral
periode interupsi
4.5

3.5
CCR5 Tingkat Modifikasi
di CD4 + Sel (%)

2.5

1.5

0
100 150 200 250 300 350 400

Hari sejak Transplantasi

Gambar 2. Hasil Klinis selama dan setelah Penghentian Terapi Antiretroviral.

Ditunjukkan adalah hasil penilaian viral load (Panel A), jumlah CD4 + dan rasio sel CD4 + terhadap sel CD8 + (Panel B), dan CCR5 efisiensi
gangguan gen dalam sel CD4 + (Panel C) dari bulan ke-3 hingga bulan ke-12 setelah transplantasi. Terapi antiretroviral dihentikan dari hari
ke 221 sampai hari ke 249.

diamati (Tabel S2 di Lampiran Tambahan). Tidak adanya di HSPC lebih lanjut di bawah efisiensi penargetan gen yang lebih tinggi.

peristiwa klinis yang merugikan dari pengeditan gen dan

efek di luar target memberikan dukungan awal untuk Ketika terapi antiretroviral dihentikan pada 7 bulan
keamanan pendekatan pengeditan gen ini. Namun, setelah transplantasi, peningkatan kecil dalam persentase CCR5
efisiensi rendah saat ini CCR5 penargetan membatasi indels diamati 2 minggu setelah dimulainya interupsi (Gbr.
kedalaman analisis penyuntingan gen di luar target. 2C). Efisiensi yang rendah dari pengeditan gen pada
Penting untuk menganalisis keamanan yang dimediasi pasien mungkin disebabkan oleh rekayasa kompetitif dari
CRISPR – Cas9 CCR5 ablasi HSPC koinfusi pada CD34 yang habis.

1246 n engl j med 381; 13 nejm.org 26 September 2019

Jurnal Kedokteran New England

Diunduh dari nejm.org pada 28 September 2020. Hanya untuk penggunaan pribadi. Tidak ada kegunaan lain tanpa izin.
Hak Cipta © 2019 Massachusetts Medical Society. Seluruh hak cipta.
 Laporan singkat

sel dan persistensi sel T donor. 15 Untuk genom sel sumsum tulang yang bersirkulasi, dan selanjutnya mengklarifikasi efek
anti-HIV CCR5- efek target ablated dari pengeditan gen tidak dicatat. HSPC, sangat penting untuk meningkatkan gen-
Pernyataan berbagi data yang disediakan oleh penulis tersedia

efisiensi pengeditan sistem CRISPR – Cas9 kami dengan teks lengkap artikel ini di NEJM.org.
Didukung oleh hibah dari Beijing Municipal Science and Technology
dan meningkatkan protokol transplantasi. Commission (D171100000517004), National Key Research and Development
Sebuah penelitian terbaru menunjukkan bahwa homozigositas untuk Program of China (2017YFA0103000), Proyek Perencanaan Sains dan
Teknologi Kota Beijing (Z181100001818004), dan Program Nasional Lima
CCR5- Δ32 mutasi dikaitkan dengan penurunan harapan
Tahun ke-13 di Key Pengendalian Penyakit Menular (2017ZX10202102-005-
hidup, yang menyoroti potensi
efek merusak dari CCR5 mutasi pada individu- 003 dan 2017ZX10202101-004-001).
tingkat ual. 22 Namun, tidak seperti strategi penyuntingan gen lainFormulir
yangpengungkapan yang disediakan oleh penulis tersedia dengan
telah diusulkan untuk pria- teks
lengkap artikel ini di NEJM.org.
Kami berterima kasih kepada Zeyu Chen, Shicheng Sun, Chengyan Wang,
agement infeksi HIV, CCR5 ablasi dalam sistem hematopoietik Weifeng Lai, dan Shunyi Liao atas bantuannya dengan desain eksperimen dan
dengan merevisi versi naskah sebelumnya; Edouard Stanley dan Tung-Tien Sun
orang yang terinfeksi tidak akan mengubah ekspresi pada
untuk bantuannya dalam merevisi versi awal naskah; Yang Gao, Yang Liu,
jaringan nonhematopoietik. Sebagai kesimpulan, penelitian kami Huangfan Xie, Hanwei Li, Jingyi Wei, Kailong Xia, Cui Zhang, Qiang Shi,
menggambarkan engraftment jangka panjang CCR5 Sel CD34 + Guol-iang Hu, Xiaoyue Gao, dan Xuanling Shi untuk bantuan teknis; dan Jing
Zhang, Min Jiang, Yongfeng Su, Na Liu, Xiao Lou, Yizhi Wang, Ying Sun, dan
yang diedit CRISPR setelah transplantasi sel induk alogenik, yang
Yafei Wang, dari Rumah Sakit 307 Tentara Pembebasan Rakyat, atas kontribusi
menimbulkan gangguan gen kurang dari 8% di untuk merawat pasien.

Lampiran
Afiliasi penulis adalah sebagai berikut: Departemen Transplantasi Sel Punca Hematopoietik (L. Xu, JW, TL, BZ, LH, HN,
YZ, HC) dan Pusat Terapi Sel dan Gen (BZ, LZ, LH, HC), 307 Rumah Sakit Tentara Pembebasan Rakyat, Pusat Medis Kelima Rumah Sakit Umum Tentara
Pembebasan Rakyat, Departemen Biologi Sel, Sekolah Dasar Ilmu Kedokteran, Pusat Penelitian Sel Punca Universitas Peking, Laboratorium Utama Negara untuk
Obat Alami dan Biomimetik, Pusat Ilmu Kesehatan Universitas Peking, dan Laboratorium Utama Kementerian Pendidikan (MOE) untuk Proliferasi dan Diferensiasi
Sel, Sekolah Tinggi Ilmu Hayati, Pusat Peking– Tsinghua untuk Ilmu Hayati (YL, L.Xie, XW, JX, HD), dan Sekolah Ilmu Kehidupan, Pusat Ilmu Statistik dan Pusat
Bioinformatika (LW, CL), Universitas Peking, dan Pusat Penyakit Menular, Beijing Youan Rumah Sakit, Universitas Kedokteran Modal,Laboratorium Utama Beijing
untuk Penelitian HIV-AIDS (BS, DM, LL, XL, TZ, HW), Beijing, dan Institut Virologi Manusia, Sekolah Kedokteran Zhongshan, Universitas Sun Yat-sen, Guangzhou
(KD) - semuanya Di Tiongkok.

Referensi
1. PetersonCW, Wang J, NormanKK, dkk. Pencangkokan
multilineage jangka panjang dari hematopoietik yang
diedit genom autologus
sel induk pada primata bukan manusia. Darah 2016; 127:
2416-26.
2. Dever DP, Bak RO, Reinisch A, dkk. CRISPR / Cas9
β-globin gen yang menargetkan sel punca
hematopoietik manusia. Alam 2016; 539: 384-9.
3. De Ravin SS, Li L, Wu X, dkk. CRISPR-Cas9
perbaikan gen sel induk hematopoietik dari pasien
dengan penyakit granulomatosa kronis terkait-X. Sci
Transl Med 2017; 9 (372): eaah3480.
4. Komor AC, BadranAH, LiuDR. Teknologi berbasis
CRISPR untuk manipulasi genom eukariotik. Sel
2017; 168: 20-36.
5. Porteus MH. Kelas baru obat melalui
penyuntingan DNA. N Engl J Med 2019; 380:
947-59.
6. Hütter G, Nowak D, Mossner M, dkk. Pengendalian HIV
jangka panjang dengan CCR5 Transplantasi sel induk
Delta32 / Delta32. N Engl J Med 200; 360: 692-8.
7. Allers K, Hütter G, Hofmann J, dkk. Bukti untuk
penyembuhan infeksi HIV dengan transplantasi sel
induk CCR5Δ32 / Δ32. Darah 2011; 117: 2791-9.
8. Gupta RK, Abdul-Jawad S, McCoy LE, dkk.
Remisi HIV-1 setelah transplantasi sel induk
hematopoietik CCR5Δ32 / Δ32. Alam 2019; 568:
244-8.
9. Deng H, Liu R, Ellmeier W, dkk. Identifikasi
ko-reseptor utama untuk isolat primer HIV-1. Alam
199; 381: 661-6.
10. Xu L, Yang H, Gao Y, dkk. Ablasi CCR5 yang dimediasi
CRISPR / Cas9 dalam sel induk / progenitor hematopoietik
manusia menghasilkan resistansi HIV-1 secara in vivo. Mol
Ther 2017; 25: 1782-9.
11. Jiao Y, Lagu Y, Kou B, dkk. Penggunaan koreseptor
CXCR4 primer pada infeksi HIV akut menyebabkan
perkembangan penyakit yang cepat pada subtipe AE. Viral
Immunol 200; 25: 262-7.
12. Du P, Liu A, Jiao Y, dkk. RNA HIV dan DNA HIV
proviral dapat dideteksi dalam air mani setelah 6 bulan
terapi antiretroviral meskipun viral load HIV tidak
terdeteksi dalam darah. Microbiol Immunol 2016; 60:
187-95.
13. Heesch S, Goekbuget N, Stroux A, dkk.
Implikasi prognostik mutasi dan ekspresi gen tumor
Wilms 1 (WT1) pada leukemia T-limfoblas akut
dewasa. Haematologica 2010; 95: 942-9.
14. Chiusa L, Francia di Celle P, Campisi P, Ceretto
C, Marmont F, Pich A. Nilai prognostik analisis
kuantitatif transkrip gen WT1 pada leukemia
limfoblastik akut dewasa. Haematologica 200; 91:
270-1.
15. Roberto A, Castagna L, Zanon V, dkk. Peran sel
induk memori T yang diturunkan secara naif dalam
pemulihan sel-T setelah alogen
transplantasi neic. Darah 2015; 125: 2855-
64.
16. Zhu LJ, Holmes BR, Aronin N, Brod- sky MH.
CRISPRseek: paket biokonduktor untuk mengidentifikasi
RNA panduan spesifik-target untuk sistem pengeditan
genom CRISPR-Cas9. PLoS One 2014; 9 (9): e108424.
17. Tebas P, Stein D, Tang WW, dkk. Pengeditan gen CCR5
pada sel T CD4 autologus dari orang yang terinfeksi
HIV. N Engl J Med 2014; 370: 901-10.
18. Aiuti A, Cattaneo F, Galimberti S, dkk. Terapi gen
untuk defisiensi imun akibat defisiensi adenosin
deaminase. N Engl J Med 2009; 360: 447-58.
19. Hacein-Bey-Abina S, von Kalle C, Schmidt M,
dkk. Efek samping yang serius setelah terapi gen
yang berhasil untuk imunodefisiensi gabungan parah
terkait-X. NEngl J Med 200; 348: 255-6.
20. Liang X, Potter J, Kumar S, dkk. Rekayasa sel
mamalia yang cepat dan sangat efisien melalui
transfeksi protein Cas9. J Biotechnol 2015; 208:
44-53.
21. Wroblewska L, Kitada T, Endo K, dkk. Sirkuit
sintetis mamalia dengan protein pengikat RNA untuk
pengiriman RNA saja. Nat Biotechnol 2015; 33:
839-41.
22. Wei X, Nielsen R. CCR5-Δ32 berubah menjadi
homozigot pada manusia. Nat Med 2019; 25:
909-10.
Hak Cipta © 2019 Massachusetts Medical Society.

n engl j med 381; 13 nejm.org 26 September 2019 1247

Jurnal Kedokteran New England

Diunduh dari nejm.org pada 28 September 2020. Hanya untuk penggunaan pribadi. Tidak ada kegunaan lain tanpa izin.
Hak Cipta © 2019 Massachusetts Medical Society. Seluruh hak cipta.