BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian Dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan yaitu eksperimen laboratorium dan

rancangan penelitiannya dengan post test only control group design.

3.2 Variabel dan Defenisi Operasional

3.2.1 Variabel

Variabel bebas : Ekstrak etanolikdaun dan

batangkitolod.

Variabel Tergantung : Aktivitasbakteri Staphylococcus

epidermidis.

3.2.2 Definisi operasional

3.2.2.1 Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus epidermidis ATCC 35984yangterdapat

di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Univesitas

Gajah Mada Yogyakarta

3.2.2.2 Aktivitas Antibakteri

Penghambatan bakteri dihitung dengan mengukur

diameter zona bening sekitar sumuran ekstrak etanolik daun

dan batang kitolod terhadap Staphylococcus epidermidis

dengan menggunakan penggaris.

23
 24

3.2.2.3 Ekstrak Daun Kitolod

Ekstrak etanolikdaun kitolod merupakan hasil dari

maserasi dari daun kitolod muda, daun tunggal, warna hijau,

bentuk lanset, permukaan kasar, ujung runcing, pangkal

meyempit, bergigi sampai melengkung menyiripyang

diperoleh dari daerah Gunung Pati Semarang. Yang

dipekatkan dengan rotary evaporator sehingga menjadi

ekstrak yang pekat yang dibuat dengan konsentrasi 0,001%,

0,01%, 0,1%, 1%, 10%, dan 100%.

3.2.2.4 Ekstrak Batang Kitolod

Ekstrak etanolik batang kitolod merupakan hasil dari

maserasi daribatang kitolod muda, bertangkai panjang,

bergetah putih , berwarna kehijauan, yang diperoleh dari

daerah Gunung Pati Semarang.Yang dipekatkan dengan

rotary evaporator sehingga menjadi ekstrak yang pekat yang

dibuat dengan konsentrasi 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 10%,

dan 100%.

3.3 Populasi dan Sampel

3.3.1 Populasi

Populasi yang digunakan adalah bakteri Staphylococccus

epidermidis yang terdapat di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas

Farmasi Univesitas Gajah Mada Yogyakarta.

 25

3.3.2 Sampel

Sampel yang digunakan adalah bakteri Stapyhlococcus

epidermidis dengan kepekatan kuman sesuai standar, dibuat suspensi

bakteri menggunakan NaCl 0,9 % steril. Kekeruhan sel disetarakan

dengan standar Mc.Farland 0,5.kemudian dibiakkan dalam media agar

Mueller Hinton. Besar sampel yang digunakan sebanyak 3 replikasi.

3.4 Instrument dan bahan penelitian

3.4.1 Instrumen Penelitian

Cawan petri(Pyrex),Timbangan analitik(Memmert), Autoklaf(

EYELA),Labu Erlenmeyer(Pyrex),Tabung Reaksi(Pyrex),Penggaris,

Blender (Maspion), Incubator(Memmert),

Batangpengaduk(Pyrex),Pinset(Pyrex),Gelas ukur(Pyrex), Ose

bulat(Pyrex), Oven(Memmert),Rotavapor( Heidolph).

3.4.2 Bahan Penelitian

Staphylococcus epidermidis ATCC 35984, Daun dan batang

kitolod, Akuades, sterilMuller Hinton Agar(Oxoid),

LampuSpritus(Pyrex),Etanol 70%, (teknis) (Merck),Paper disk,

standar Mc. Farland ( Brataco),Antibiotic penisilin.

3.5 Cara penelitian

3.5.1 Determinasi Tanaman

Determinasi di Laboratorium Biologi FMIPA Universitas

Negeri Semarang.Determinasi di lakukan dengan cara mengumpulkan

 26

daun, bunga, batang, dari tanaman kitolod(Hippobroma longiflora

(L)G Don.) kemudian di determinasi.

3.5.2 Pembuatan Serbuk Simplisia danEkstrak Etanol Daun Kitolod

Pembuatan serbuk simplisia yaitu 2000 gram (2 kg) daun kitolod

segardikeringkan dengan cara menjemur dibawah sinar matahari

secara tidak langsung yaitu dengan ditutup kain hitam sampai kering.

Lalu dikeringkan lagi dengan menggunakan bantuan oven.Daun

kitolod yang sudah dikeringkan, dihancurkan sampai berbentuk

serbuk.

Selanjutnya pembuatan ekstrak etanol daun kitolod dalam

penelitian ini dilakukan dengan ekstraksi cara dingin metode maserasi.

Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah etanol 70%.Daun

kitolod yang sudah dikeringkan, dihancurkan sampai berbentuk

serbuk, lalu dimasukkan ke dalam bejana Erlenmeyer dengan

ditambah etanol 70% sebanyak 1000 ml. Campuran ini kemudian

digojog-gojog agar tercampur rata dan di diamkan selama

3x24jam.Setelah 3 hari campuran ini disaring untuk didapat sari-

sarinya.Sari daun kitolod yang diperoleh kemudian dievaporasi

menggunakan evaporator dengan suhu 45°C untuk menghilangkan

pelarutnya sehingga didapatkan ekstrak kental.

 27

3.5.3 Pembuatan Serbuk Simplisia dan Ekstrak Etanol Batang Kitolod

Pembuatan ekstrak yaitu 2000 gram (2 kg) batang kitolod

segardikeringkan dengan cara menjemur dibawah sinar matahari

secara tidak langsung yaitu dengan ditutup kain hitam sampai kering.

Lalu dikeringkan lagi dengan menggunakan bantuan oven.Batang

kitolod yang sudah dikeringkan, dihancurkan sampai berbentuk

serbuk.

Selanjutnya pembuatan ekstrak etanol batang kitolod dalam

penelitian ini dilakukan dengan ekstraksi cara dingin metode maserasi.

Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah etanol

70%.Batang kitolod yang sudah dikeringkan, dihancurkan sampai

berbentuk serbuk, lalu dimasukkan ke dalam bejana erlenmeyer

dengan ditambah etanol 70% sebanyak 1000 ml. Campuran ini

kemudian digojog-gojog agar tercampur rata dan didiamkan selama

3x24 jam.Setelah 3 hari campuran ini disaring dengan untuk didapat

sari-sarinya.Sari batang kitolod yang diperoleh kemudian dievaporasi

menggunakan evaporator dengan suhu 45°C untuk menghilangkan

pelarutnya sehingga didapatkan ekstrak kental

3.5.4 Pembuatan medium

Tabel 3.1.Pembuatan Media Mueller Hinton :

R/ Beef dehydrated infusion 300g
Casein hydolysate 17,5 g
Amylum 1,5g
Agar-agar 17g
Aquades ad 1000 ml
 28

Media agar Mueller hinton ditimbang sebanyak 39 gram,

dilarutkan dalam aquades sampai 1 liter dengan jalan dididihkan,

tunggu selama 15 menit, kemudian didihkan. Setelah larut disterilkan

dengan autoklaf 1210C selama 15 menit.Larutan kemudian dituang ke

dalam cawan petri steril dan ditutup dan dibiarkan sampai membeku.

Larutan memiliki pH 7,2-7,6 (Soegiartono, 1991).

Tabel 3.2Pembuatan media agar darah

Formula TSA R/ Bacto tryptone 15 g
Bacto soytone 5g
Sodium chloride 5g
Bacto agar 15 g

Ditimbang TSA 40 gram dilarutkan dalam aqua sampai 1 liter

dengan jalan dipanaskan.Setelah larut disterilkan dalam autoklaf

1210C selama 15 menit.Tiap 300 ml larutan TSA ditambahkan 30 ml

darah kambing.Media lalu dituang dalam cawan petri steril, ditutup,

dan dibiarkan membeku (Soegiartono, 1991).

3.5.5 Uji Daya Hambat

Staphylococcus epidermidisdiinkubasi dalammedia agar selama

24 jam dalam kondisi aerob, kemudian dibuat suspensi bakteri

menggunakan NaCl 0,9 % steril. Kekeruhan sel disetarakan dengan

standar Mc.Farland 0,5. Kapas lidi steril dimasukkan ke dalam tabung

yang berisi bakteri, kemudian ditekan-tekankan di dinding tabung agar

tidak terlalu basah. Kapas tersebut diusapkan pada media Mueller

Hinton yang sebelumnya telah diinkubasi selama kurang lebih 2 jam

sampai rata dan setipis mungkin, kemudian dibuat sumuran pada

media Mueller Hinton dengan menggunakan besi steril pada media

 29

tersebut. Setelah itu ekstrakdaun dan batang kitolod dan kontrol positif

masuk ke dalam lubang, Pelatkemudian diinkubasipada suhu 37

°Cselama 24jam dengan kondisi aerob (Niyomkam et al., 2010)

3.6 Alur Penelitian

Determinasi

Maserasi

Ekstrak Etanolik Daun dan Batang Kitolod dengan

Konsentrasi 0,001%,0,01%,0,1%,1%,10%,100%.

Kontrol Positiv
Staphylococcus epidermidis
Penicillin G

Inkubasi suhu 37oC

secara aerob

Pengukuran Zona Inhibisi

Analisa Data

3.7 Tempat dan Waktu Penelitian

3.7.1 Tempat

Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmasi Prodi Farmasi

Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung (UNISSULA)

 30

Semarang dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi

Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.dan Laboratorium Biologi

FMIPA Universitas Negeri Semarang.

3.7.2 Waktu

Waktu yang diperlukan untuk penelitian selama 2 bulan, dengan

membuat ekstrak pada bulan Desember 2015 dan perlakuan pada

bulan Januari- Februari 2016.

3.8 Analisis Data

Analisis data dilakukan denganuji normalitas dan homogenitas. Data

tidak terdistribusi normal dan tidak homogen sehingga dilanjutkan ke uji statistik

non parametrik Kruskal Wallisdan dilanjutkan dengan Mann-Whitney.