Nama kelompok :

1. Dafa Muda Arsena (18030204059)

2. Sindy Putri Nan Mega (18030204085)
3. Ankankinem B.P. Rumbewas (18030204097)

Tahap percobaan Transgenic Mouse Technologi

1. Pemurnian fragmen DNA transgen
1) Pemurnian plasmid yang tidak tercerna mengandung kontruksi transgen dengan
CsCl gradien atau dengan metode kolom membran.
2) Pembatasan mencerna vektor dengan enzin restriksi hingga tuntas dan
memisahkan transgen dari vektor prokariotik.
3) Elektroforesis hasil pencernaan restriksi melalui gel agrosa.
4) Menggunakan transilluminator memotong pita DNA.
5) Menutup penutup dan memutar perangkat yang dirakit selama 10 menit pada
500x g. Setelah selesai buang cup filter sampel dan nebulizer gel.
6) Menentukan volume sampel.

2. Superovulasi
1) Hari ke-0 adalah hari injeksi mikro embrio. Super ovulasi dimulai pada d-3.
Waktu yang dilakukan harus sore hari, misalnya jam 2 siang. Setelah injeksi
selesai, tikus betina dikembalikan ke rumah regulernya.
2) Diberikan hCG 46 hingga 48 jam setelah injeksi PMSH (d-1). Setelah injeksi,
pasangkan betina dengan pejantan utuh bertempat tinggal sama dan biarkan
kawin semalaman.
3) Pagi harinya betina dikeluarkan dan diperiksa sumbat kopulasinya.
4) Pada d-1, disiapkan cawan kultur embriodengan menmpatkan empat tetes KSOM
di dasar dua cwan petri 35mm. Olesi dengan minyak mineral ringan dan
setarakan semalam pada 36C dalam inkubator yang dilembabkan.

3. Produksi betinna penerima Pseudopregnan

1) Mengansumsikan pejantan yang dibeli sudah divaksetomi a dari sumber
komerial, pembiakan betina peneruma harud dimulai setidaknya hari itu sebelum
injeksi mikro embrio dijawalkan (d-1).
2) Pasangkan mencit betina dewasa secra alami dengan tikus jantan yang telah
divaksetpmi pada 1-2 betina pada tiap jantan. Tambahkan betina ke kandang
jantan, daripada menambahkan jantan ke kandang betina. Tetapkan setidaknya 15
pasangan kawin.
3) Keesokan paginya keluarkan betina dari jantan dan periksa kopulasi plugs.

4. Koleksi embrio
1) Menyiapkan cawan ukuran sedang 35 mm dengan cara menuang 3 ml M2 steril
ke tiga piring.
2) Streilkan instrumen bedah.
 3) Mempersiapkan betina berbaring telentang di permukaan penyerap dan
membasahi perut denga 70% ethanol.
4) Pegang kulit bagian bawah setiap tikus dan membuat satu garis melintang potong
dengan gunting iris. Kulit kemudian ditarik kebelakang dengan memgang sayatan
dan ekor lalu menarik ke arah yang berlawanan.
5) Pegang dinding tubuh. Ulangi membuat sayatan melintang di perut bagian bawah,
dan gunakan gunting untuk menambah potongan di kedua sisi tubuh. Libat
dinding tubuh kembali keatas dada.
6) Dengan tang bersih pindahkan usus keluar rongga tubh dan cari ginjal di setiap
sisi tulang belakang. Ovarium terletak di rostal masing-masing ginjal, dengan
saluran telur dan tanduk uterus terpasang. Ambil ovarium dengan satu tangan dan
renggangkan dengan lembut, gunakan gunting iris mikro untuk memotong ikat
selaput antara ovarium dan saluran telur. Pegang jarak antara saluran telur dan
tanduk uterus dan memotong dengan cara yng sama. Tempatkan saluran telur
dipotong di piring M2.
7) Pindahkan slauran telur yang dipotong ke piring M2 dan hyaluronidase. Dibawa
stereo miskroskop, gunakan penjepit bersih untuk melumpuhkan satu saluran
telur di bagian bawah piring. Temukan ampula dan sobek dengan ujung tang
lainnya. Massa kumulus yang mengandung embrio akan mengalir keluar saluran
telur.
8) Setelah semua saluran telur dikeluarkan dari cawan, pasang pipet transfer ke
perakitan aspirator mulut. Ambil embrio yang jatuh dari kumulus massa saat sel
menyebar di hyalurinidase.
9) Cuci embrio di cawan ke tiga M2, cuci di KSOM, pindahkan setets kultur KSOM
dan tempatkan di inkubator sampai mikroinjeksi.

5. Preparasi DNA transgen untuk injeksi mikro

1) Sebelum injeksi mikro, siapkan pengenceran transgen.
2) Putar konstruksi kecil dengn kecepatan tinggi selama 10 menit untuk membuat
pelet partikulat. Lepaskan bagian atas supensi denga hati-hati dan pindahkaan ke
tabung microcentrifuge yang bersih. Dipertahankan pada suhu 4C untuk
digunakan hari itu.

6. Injeksi mikro
1) Siapkan cawan injeksi dan melapisinya dengan minyak mineral ringan.
Tempatkan wadah injeksi pada ruang lingkup terbalik dan nyalakan penghangat
hingga suhu 37 derajat celcius.
2) Pasang pipet penahan dan tempatkan pada manipulator.
3) Tarik jarum injeksi mikro dan tempatkan ujung tumpul ddngan hatihati ke dalam
DNA larutan biarkan ujungnya memuat dengan aksi kapiler. Masukkan jarum
dudukan dan putar di femtojet. Microinjector akan membutuhkan waktu untuk
menetapkan tekana di dalam sistem, tetapi jarum harus dimaasukkan sebelum
menyalakan femtojet.
 4) Turunkan pipet penahan dan harum suntik ke dalam mikroinjeksi, secara manual
lalu elanjutya sesuaiakan dengan kontrl vertikal dari manipulasi. Kedua
instrumen harus diposisikan secara horisontal melintasi bidang pandang.
5) Keluarkaan embrio dari inkubator dan pindahkan sedirit ke piring M2. Angkat
embrio dalam volume kesil M2 dan pada perbesaran rendah pada mikroskop
terbalik, sipan injeksi mikro tepat disebelah alat kapiler kaca.
6) Salaat perbesaran rendah, putar kembali pipet penahan untuk menghasilkan hisap
dan mencoba mengambil embrio.
7) Berilah perbesaran tinggi. Posisikan embrio sehingga pronukleusnya tidak
dikabrukan oleh benda kutub.
8) Setelah embrio diposisikan, fokuslah pada membran pronuklear menyesuaikan
fokus halur pada mikroskop, selanjutnya dekatkanlah jarum suntik tepi embrio.
9) Masukkan jarum kedalam embrio dan tusuk membran pronuklear. Suntikkan
larutan DNA sampai pronukleus tampak membengkak lalu cabut jaarum dengan
cepat namun lembut.
10) Pindahkan embrio yang disuntikkan ke atas cawan injeksi mikro dan ulangi
dengan embrio berikutnya.

7. Transfer embrio ke betina penerima

1) Operasi pemindahan embrio membutuhkaan area untuk persiapan heewan,
penanganan embrio, operasi dan pemulihan. Mulailah dengan menimbang betina
penerima.
2) Keluarkan embrio yang disuntikkan dari inkubator dan pindahkan ke piring M2.
3) Hapus rambut dari bagian belakang tikus dengan memotongnya dengan pisau #50
dan mempersiapkan alkohol.
4) Sterilkan semua intrumen, ambil kulit yang terletak tepat diatas punggung area
ginjal satu sisi dan buat sayatan kesil degan gunting iris.
5) Angkat dinding tubuh dengaan forsep. Ovarium terletak di sebelah kanan ginjal
dan dapat dikenali banalan lemak yang menempel.
6) Masukkan embrio ke dalam pipet transfer dengan volume sekecil mungkin.
7) Gerakkan tikus ke panggung mikroskop dan fokus pada saluran telur. Identifikasi
infudibulum dan gunakan tang bersih, robek tepat diatas pembukaan saluran telur.
8) Angkat rakitan aspirasi dn posisikan pipet tranfer bukan di infundibulum.
Masukkan pipet dan pegang baian luar saluran telur diatas pipet dengan tang di
tangan yang berlwanan. Keluarkan isi pipet hingga dua gelembung udara muncul
di ampula.
9) Lepaaskan penjepit dan kembalikan saluran ke rongga tubuh. Tutupp kulit
dengan penjepit luka. Tempatkan betina penerima di kandang bau dan biarkan
luka pulih.

8. Genotip dan identifikasi pendiri

1) Anak tikus akan lahir antar d19 dan 21. Anak tikus akan disapih pada usia tiga
minggu dan mengumpulkan biopsi ekor. Tempatkan biopsi ekor dalam
 microentrifuge tabung dan tandai dengan nomorr identifikaasi. Tempakan diatas
es sementara sampel lain dikumpulkan.
2) Jika DNA yang diekstrak dari ekor hanya untuk analisis PCR, DNA modern kit
isolasi akan bekerja dan terbukti murah, cepat dan dapat diandalkan.
3) Lyse ekor dalam 500 μl lysis buffer. Tambahkan 20 μl 20 mg/ml proteinase K
dan inkubasi pada suhu 55 Celcius.
4) Tambahan 250 μl NaCl 6M jenuh.
5) Kocok tabung kurang lebih 500 kali. Jangan vortex untuk mencegag geser DNA
genomik.
6) Dinginkan diatas es selama 10 menit. Centrifuge pada 7000 rpm selama 10 menit.
7) Aspirasi 650 μl dan pindahkan ke tabung microcentrifuge baru. Tambahkan 2
volume etanol 100%, balikkan 10-20 kali. Tangguhkan kembali dalam 50 μl
penyangga TE.
8) Tentukan kualitas preparasi DNA dengan speekteofotometer.
9) Cairkan semua reagen, templat, dan kontrol PCR di atas es.
10) Campur mengikuti tabung PCR untuk setiap reeaksi. Tambahkan ddH 2O steril ke
volume akhir 50 μl.
11) Tempatkan ke termosikler.
12) Jalankan produk PCR pada gel agarosa dan visualisasikan pada transiluminator.

9. Penerapan teknologi transgenik

Teknologi transgenik menawarkan peluang untuk menentukan fungsi gen in vivo

dengan berbagai cara. Secara umum transgen diekspresikan dengan cara spesifik
jaringan/sel menggunakan homolog atau heterologus. Gen tikus atau cDNA ditandai
dengan tepat dengan oligo acak atau direkayasa dengan DNA poladenilasi hilir heterolog
urutan juga digunakan. Efek dari transgen yang berlebihan pada organ perkembangan
dan / atau fisiologi kemudian dipantau. Dalam beberapa kasus, ekspresi ektopik transgen
juga dicapai dengan mengarahkan ekspresinya ke jaringan / sel berbeda dari gen tikus
yang biasanya diekspresikan.
Dalam beberapa contoh, data diperoleh dengan studi transfeksi sel pada
pengaturan pemetaan daerah gen yang paling sering memberikan ekspresi spesifik
jaringan / sel tidak terlalu baik berkorelasi atau sulit untuk ditafsirkan, dibandingkan
dengan skenario in vivo yang sesuai. Sedemikian. Dalam kasus, pendekatan transgenik
sering digunakan untuk mengidentifikasi, memetakan dan mendefinisikan regulasi
minimal elemen promotor tertentu yang menentukan ekspresi spesifik jaringan / sel dan
hormonal peraturan. Ini biasanya dicapai dengan merekayasa serangkaian konstruksi
penghapusan dari bagian yang lebih besar dari gen yang diketahui memberikan ekspresi
spesifik jaringan / sel. Selanjutnya, transgen yang terpotong diinjeksi mikro untuk
menghasilkan tikus transgenik dan ekspresinya dalam jenis sel yang dipilih dipantau di
RNA dan / atau tingkat protein sebagai titik akhir. Strategi serupa juga telah digunakan
di mana faktor transkripsi yang dikenal- situs pengikatan bermutasi pada promotor
tertentu yang mendorong ekspresi transgen dan transgennya konsekuensi fungsional diuji
secara in vivo. Dalam hal, elemen promotor diberikan gen sudah diidentifikasi dan
 dikarakterisasi, ini dapat digunakan untuk mengarahkan ekspresi reporter berguna yang
dapat diuji secara qauntitative. Reporter yang biasa digunakan untuk mengukur aktivitas
promotor termasuk lacZ dari E. coli , kloramfenikol asetil transferase dan kunang-
kunang luciferase.

Prinsip umum teknologi tikus transgenik

Prinsip umum teknologi tikus transgenik adalah dengan dimasukkannya DNA asing
ke dalam genom tikus terutama dengan tiga cara. 

Metode pertama melibatkan pengiriman DNA melalui infeksi retroviral pada embrio
tikus pada tahap perkembangan yang berbeda. Karena banyak masalah teknis, metode ini
tidak dipraktikkan untuk produksi rutin mencit transgenik.

Metode kedua yang telah menjadi prosedur yang banyak digunakan sejak
penemuannya hampir 25 tahun lalu, melibatkan mikroinjectioin langsung dari DNA asing ke
dalam pronukleus embrio tikus satu sel yang telah dibuahi. Karena transgen secara acak
berintegrasi sebagai satu atau lebih salinan ke dalam genom tikus sebelum pembelahan
embrio, semua sel termasuk yang berasal dari luar embrionik pada akhirnya akan membawa
transgen. Embrio yang diinjeksi mikro dipindahkan ke saluran telur ibu asuh pseudopregnant
yang kemudian menghasilkan pendiri pembawa transgen pada frekuensi yang bervariasi. Para
pendiri biasanya diidentifikasi dengan tes Southern blot atau genomic PCR menggunakan
DNA ekor yang dicerna proteinase-K dan akhirnya digunakan untuk menetapkan garis
independen yang akan bervariasi sehubungan dengan situs integrasi transgen serta dalam
nomor salinannya. . Teknologi ini menjadi sangat populer dengan upaya perintis Ralph
Brinster dan Richard Palmiter, meskipun telah merevolusi hampir setiap disiplin biologi,
memiliki hubungan yang signifikan dengan bidang endokrinologi molekuler. Ini berasal dari
fakta bahwa salah satu strain pertama dari tikus transgenik yang dibuat berukuran raksasa
sebagai hasil dari ekspresi hormon pertumbuhan yang berlebihan.

Metode ketiga mengeksploitasi manipulasi yang ditargetkan dari sel induk embrionik
tikus (ES) pada lokus yang diinginkan dengan memasukkan kehilangan atau perolehan
mutasi fungsi sekecil perubahan pasangan basa tunggal ke perubahan kromosom rentang
megabase ( 6 - 9 ). Sel ES berasal dari massa sel dalam blastokista tikus E3.5. Sel-sel ini
bersifat majemuk dan dapat berkontribusi pada semua garis keturunan sel embrio dengan
tepat ketika disuntikkan ke blastokista penerima ( 6 - 9).). Biasanya, blastokista donor dan
penerima diperoleh dari tikus dengan warna bulu yang berbeda yang memungkinkan
identifikasi yang mudah dari keturunan yang dihasilkan, yang disebut chimera yang
menampilkan distribusi warna bulu yang khas. Transmisi germline dari alel mutan dicapai
dengan mengawinkan tikus jantan chimeric dengan tikus betina kontrol normal. Tikus
heterozigot yang dihasilkan disilangkan untuk mendapatkan tikus mutan homozigot biasanya
pada frekuensi 25%, jika mutasi tersebut tidak merugikan kelangsungan hidup dan
perkembangan embrio ( 6 - 9 ). Selain pendekatan di atas gen standar menargetkan, inaktivasi
gen juga dapat dicapai baik secara spasial dan temporal dan dalam sel-spesifik kondisional
dibatasi ( 10 - 12). 

Fungsi tiap tahapan pembuatan tikus trasngeniik

Tahap 1 : pemurian fragmen DNA transgenic

Berfungsi untuk mendapatkan fragmen DNA yang memiliki promoter,protein coding

dan polyadenylation site.

Tahap 2 : superovulasi

Berfungsi untuk mendapatkan tikus betina yang memiliki telur yang dibuahi (zigot)
dalam jumlah banyak dengan pemberian PMSH yang bertujuan untuk menstimulasi ovulasi

Tahap 3 : produksi betina hamil palsu(pseudopregnan)

Untuk menghasilkan tikus betina dengan kehamilan palsu, saat dipasangkan dengan
jantan yang telah disterilkan dengan pemotongan kantong sperma.

Tahap 4 : koleksi embrio

Berfungsi untuk mengumpulkan embrio-embrio dari tikus betina yang telah diberi
perlakuan saat superovulasi, yang akan diggunakan sebagai kultur.

Tahap 5 preparasi DNA transgen untuk injeksi mikro

untuk mempersiapkan DNA transgen yang digunakan untuk injeksi mikro ke betina
penerima

Tahap 6 injeksi mikro

Untuk memasukkan larutan yang mengandung transgen,zigot yang ditransfer haruslah

normal yang ditandai oleh adanya 2 pronukleus dan 2 polar bodi

Tahap 7 transfer embrio ke betina penerima

untuk melakukan transfer embrio ke tikus betina penerima

tahap 8 genotip dan identifikasi pendiri

untuk menjalankan produk PCR pada gel agarosa dan mendapat visualisasi pada
transiluminator

tahap 9 penerapan teknologi transgenik

Teknologi transgenik menawarkan peluang untuk menentukan fungsi gen in vivo

dengan berbagai cara. Secara umum transgen diekspresikan dengan cara spesifik jaringan/sel
menggunakan homolog atau heterologus.