LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DAN PARASITOLOGI

“PEWARNAAN BAKTERI (BAKTERI GRAM NEGATIF Escherichia coli)”

DISUSUN OLEH :

NAMA : NIKE FADILLAH

NIM : 1900078

PRODI : D-III IIB

HARI PRATIKUM : KAMIS (08.00-11.00)

GRUP : B4

DOSEN PEMBIMBING : EMMA SUSANTI,M.Farm,Apt

ASISTEN DOSEN :

1. DHEA ANANDA
2. YULINDA ANGGRAINI

PROGRAM STUDI D-III FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI RIAU

YAYASAN UNIVERSITAS RIAU

2020
 OBJEK IV

“PEWARNAAN BAKTERI (BAKTERI GRAM NEGATIF Escherichia coli)”

I. TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mengetahui macam-macam pewarnaan bakteri.
2. Memahami dan dapat melakukan macam-macam pewarnaan bakteri.
3. Memahami pewarnaan gram sebagai salah satu cara identifikasi bakteri.
II. TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-
sifat yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna
dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri yang ada di suspensikan. Salah satu cara
unutk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah di identifikasi adalah dengan cara
metode pengenceran atau pewarnaan. Hal tersebut berfungsi untuk mengetahuisifat
fisiologisnya  yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecetan
atau pewarnaan (Dwidjoseputro, 2005).
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri
yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk
basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus
dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum
hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro.2005).
Escherichia coli  adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang yang tidak
membentuk spora yang merupakan flora normal di usus. Meskipun demikian, beberapa
jenis Escherichia coli  dapat bersifat patogen, yaitu serotipe-serotipe yang masuk dalam
golongan Escherichia coli  Enteropatogenik, Escherichia coli Enteroinvasif, Escherichia
coli  Enterotoksigenik dan Escherichia coli Enterohemoragik (Smith-Keary, 1988 ;
Jawetz et al., 1995).
Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang pendek yang
memiliki panjang sekitar 2 µm, diameter 0,7 µm, lebar 0,4-0,7µm dan bersifat anaerob
fakultatif. E. coli membentuk koloni yang bundar, cembung, dan halus dengan tepi yang
nyata (Smith-Keary, 1988 ; Jawetz et al., 1995).
 Pengenalan bentuk mikroba kecuali mikroalage harus dilakukan pewarnaan
terlebih dahulu, agar dapat diamati dengan jelas. Pada umumnya bakteri bersifat tembus
cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna
(Waluyo,2004).
Pewarnaan merupakan salah satu cara yang pagar sedang digunakan untuk
membedakan mikroorganisme khususnya bakteri yaitu bakteri gram positif dan bakteri
gram negative. (Gazali,2009)
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel
bakteri, memperluas ukuran jasad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan
melihat reaksi jasad terhadap pewarnaan yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia
jasad dapat diketahui (Hadiutomo,1990).
Metode pengenceran pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun
1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu gram positif
dan bakteri gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat
tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya
sehingga pewarnaan gram tidak dapat dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.(Lay,1994).
Berhasil atau tidaknya suatu pewarnaan ditentukan oleh waktu pemberian warna
dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat
warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan
positif dan negatif dim.ana salah satu ion tersebut sudah memiliki warna
(Hadiutomo,1990).
Macam-macam pewarnaan bakteri, pewarnaan pada bakteri dibagi 3 yaitu :
(Dwidjoseputro,2005).
 Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang sering
yang digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis
zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri
mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basafilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan
 pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel
bakteri pewarnaan basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana
ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuchsin yang mana pewarnaan
sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan, yaitu :
(Umni,2008)
a. Pewarnaan asam
Pewarnaan asam atau positif merupakan pewarnaan yang
menggunakan satu warna atau dengan tujuan hanya untuk melihat
bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan
positif adalah metilen biru dan air fuchsin.
b. Pewarnaan basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan
untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi
gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan
(tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan
morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan tinta cina.
 Pewarnaan diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris
untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu
Gram positif dan negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisika dinding sel
mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Denmark Hans Christian (1853-1938) yang mengembangkan teknik ini
pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri
klebslella pneumoniac. Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan gram.
Bakteri Gram positif akan mempertahankan warna ungu pada metode
pewarnaan gram. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal
ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri Gram
negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini
bertujuan untuk mengklarifikasi kedua tipe bakteri ini berdasarkan
perbedaan struktur dinding sel.
 Dalam pewarnaan Gram diperlukan reagen, antara lain :

 Zat warna utama

 Mordan (larutan iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk
mengidentifikasi warna utama
 Pencuci / peluntur zat warna (alkohol / aseton) yaitu solvent
organik yang digunakan untuk melunturkan zat warna
 Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk
mewarnai kembali sel-sel yang telh kehilangan cat utama setelah
perlakuan dengan alkohol

Bakteri Gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan

terluar yaitu lipid yang kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga saat
diwarnai dengan safranin menjadi warna merah. Bakteri Gram positif
memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah
pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna ungu.

Contoh bakteri gram positif yaitu Staphylococcus aureus,

Lactobacillus, dan Bacillus. Sedangkan contoh bakteri gram negative
yaitu Escherichia coli, Salmonellsa sp., dan Bacillus sp.. (Umni,2008)
 Pewarnaan khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai
struktur bakteri khusus atau tertentu seperti bagian spora, kapsul, flagel,
dsb. Contoh pewarnaan khusus : pewarnaan endospora anggota dari genus
clostridium, pesulfomaculatum, dan bacillus adalah bakteri yang
memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan
bentuk domain dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya besifat inaktif
dan mampu bertahan dalam tekanan fisika dan kimia seperti panas,
kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan
endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif sehingga
perbedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat dibawah
 mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan
transparan.
a. Pewarnaan kapsul
Menggunakan larutan kristal violet panas lalu larutan tembaga
sulfat sebagai pembilas, menghasilkan warna biru pucat pada kapsul.
b. Pewarnaan spora
Dinding spora relatif tidak permeable namun zat warna bisa
menembusnya dengan cara pemanasan preparat.
c. Pewarnaan flagel
Dengan memberi suspensi koloid asam tanat yang tidak stabil,
sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
d. Pewarnaan nukleoid
Pewarnaan nukleoid menggunakan pewarna fuchsin yang khusus
untuk DNA.
III. ALAT DAN BAHAN
1. Alat
 Kaca objek
 Aquadest
 Tissue/kertas hisap
 Lampu spiritus
 Pipet tetes
 Mikroskop
 Jarum ose
 Tissue
2. Bahan
 Kultur bakteri (Escherichia coli)
 Zat warna metilen blue, kristal violet, safaranin O
 Alkohol
 Larutan lugol
 Aquadest
  Larutan NaCl fisiologis
IV. CARA KERJA
a. Pewarnaan Sederhana
1) Apusan bakteri dibuat dan difiksasi diatas api.
2) Zat warna bitu metilen blue atau larutan karbol fuksin basa ditambahkan.
3) Zat warna dibiarkan selama 30 detik, kemudian dicuci dan dikeringkan
dengan kertas saring atau tissue.
4) Apusan bakteri yang telah diwarnai diamati dibawah mikroskop.
5) Hasil pengamatan dibuat pada lembar kerja.
b. Pewarnaan Gram
1) Apusan bakteri dibuat dan difiksasi diatas api.
2) Larutan Kristal violet ditambahkan dan didiamkan selama 1 menit,
kemudian dicuci dengan air.
3) Larutan lugol ditambahkan dan didiamkan selama 1 menit, kemudian
dicuci dengan air.
4) Larutan pemucat (alkohol) ditambahkan dan didiamkan selama 10-20
detik, dan dicuci dengan air.
5) Larutan safranin O ditambahkan dan didiamkan selama 1 menit,dan dicuci
dengan air dan dikeringkan dengan kertas saring atau tissue.
6) Preparat diamati dibawah mikroskop.
7) Hasil pengamatan diamati pada lemba kerja.
V. HASIL DAN PEMBAHASAN
a) Hasil

Nama Pewarnaan Gambar Keterangan

Bakteri
Escherichia Sederhana  Pewarnaan
coli sederhana
dilakukan
untuk melihat
struktur dari
bakteri
 Pewarna
methylen blue
 Koloni
tampak
berwarna
ungu
 Bentuk E.coli
tampak seperti
basil (batang)
Escherichia Gram  Pewarnaan
coli gram
dilakukan
untuk
membedakan
bakteri gram
(+) dan
bakteri gram
(-)
 Sel bakteri
berwarna
merah (bakteri
gram
negative)
 Berbentuk
basil (batang)
 pendek yang
membentuk
koloni yang
tersusun
seperti rantai
yang
memanjang
b) Pembahasan
Dalam percobaan ini kami melakukan pewarnaan bakteri. Bakteri yang
digunakan yaitu bakteri Escherichia coli. Escherichia coli (E. coli) adalah salah
satu jenis spesies bakteri Gram negatif. Pada umumnya, bakteri ini dapat
ditemukan dalam usus besar manusia. Kebanyakan E. coli tidak berbahaya, tetapi
beberapa, seperti E. coli tipe O157:H7, dapat mengakibatkan keracunan makanan
yang serius pada manusia yaitu diare berdarah karena eksotoksin yang dihasilkan
bernama verotoksin.
E.coli merupakan Bakteri batang Gram negatif, tidak berkapsul, umumnya
mempunyai fibria dan bersifat motil. Sel E.coli mempunyai ukuran panjang 2,0-
6,0 mm dan lebar 1,1-1,5 mm, tersusun tunggal, berpasangan. Bakteri ini dapat
menggunakan asetat sebagai sumber karbon. Bakteri ini tumbuh pada suhu antara
10-40 °C, dengan suhu optimum 37 ºC. pH optimum untuk pertumbuhan adalah
pada 7,0-7,5, pH minimum pada pH 9,0. Bakteri ini relatif sangat sensitif terhadap
panas dan dapat diinaktifkan pada suhu pasteurisasi makanan (50-100°C) atau
selama pemasakan makanan.
Pada percobaan ini dilakukan dengan dua cara yaitu pewarnaan sederhana
dan pewarnaan gram.
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu macam zat
warna dengan tujuan hanya untuk melihat sel bakteri dan untuk mengetahui
morfologi dan susunan selnya. Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan
basa pada umumnya, antara lain kristal violet, metilen blue, karbol fuhsin, dan
safranin.
 Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk
mengelompokkan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif
akan mempertahankan zat warna kristal violet dan akan tampak berwarna ungu
tua dibawah mikroskop.adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna
kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna
safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh
perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang digunakan
dalam pewarnaan gram antara lain kristal violet, alkohol, safranin, dan lugol
(iodium).
Pewarnaan sederhana memiliki prinsip yang didasarkan pada zat warna yang
digunakan dan hanya terdiri dari suatu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut
yang merupakan suatu cara yang tepat untuk melihat morfologi bakteri secara
umum. Sedangkan pewarnaan gram menggunakan prinsip yang didasarkan pada
perbedaan struktur dinding sel bakteri. Sehingga menyebabkan perbedaan reaksi
dengan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci.
Bakteri Gram Negatif adalah bakteri yang mempunyai daya mengikat zat
warna utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat
diwarnai lagi oleh zat warna lawan (safronin), pada pengamatan mikroskop sel-sel
bakteri tampak berwarna merah.
Percobaan pertama yang dilakukan yaitu pewarnaan sederhana pada bakteri
Escherichia coli. Pada percobaan pewarnaan sederhana Escherichia coli, kaca
objek ditetesi NaCl fisiologis lalu ditambahkan Escherichia coli dengan difiksasi
diatas api sampai kering. Fiksasi adalah proses yang dilakukan untuk pewarnaan
yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Proses fiksasi dilakukan supaya
bakteri benar-benar melekat pada kaca objek sehingga olesan bakteri tidak akan
terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses
fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala
api. Fiksasi dapat gagal jika dilakukan terlalu lama sehingga mengakibatkan
bakteri menjadi mati, maka dari itu kita harus mengfiksasi bakteri sebaik
mungkin. Setelah difiksasi ditambahkan metilen blue dan ditunggu selama 30
detik lalu dicuci dengan aquadest dan keringkan. Setelah itu diamati di
mikroskop, dan dari hasil pengamatan didapatkan hasil berbentuk basil (batang).
Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel
bakteri Escherichia coli.
Selanjutnya pada percobaan pewarnaan gram terhadap Escherichia coli
dengan menggunakan larutan kristal violet, lalu dicuci dan ditambahkan lugol lalu
dicuci kembali, selanjutnya diberi alkohol yaitu untuk larutan pemucat atau
peluntur, kemudian ditambahkan safranin O dan dicuci kembali dan dikeringkan.
Setelah kering diamati dengan mikroskop dan didapatkan bentuk basil (batang)
dan berwarna merah dari hasil tersebut dapat diketahui bahwa bakteri tersebut
tergolong bakteri gram negatif ditandai dengan tidak dapat mempertahankan
warna kristal violet pada percobaan ini, pemberian alkohol berfungsi untuk
dekolonisasi bakteri sehingga menyebabkan zat utama dalam sel muncul.
Kristal violet merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna
pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu
berikatan dengan sel organisme bersifat kusam. Dengan pewarnaan ini, sel
organisme transparan akan berwarna ungu.
Pewarnaan lugol merupakan pewarna modern yaitu pewarna yang berfungsi
memfiksasi pewarnaan primer yang diserap mikroorganisme target atau
mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pewarnaan gram
dimaksudkan untuk memperkuat pengikat warna oleh bakteri.
Alkohol yang diteteskan berfungsi sebagai pemucat. Alkohol diteteskan lalu
didiamkan 10-20 detik bertujuan agar warna dapat luntur secara sempurna dan
tidak ada yang tersisa di dalam kaca objek.
Setelah pembakuan reagen alkohol pada kaca objek, selanjutnya diteteskan 1
tetes safranin kemudian didiamkan dan dibilas dengan aquadest. Safranin
merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk
mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah pencucian
dengan alkohol atau disebut juga pewarna sekunder. Dengan kata lain, safranin
memberi warna pada mikroorganisme target serta menghabiskan sisa warna.
Pewarna safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna
merah pada bakteri gram negatif. Sedangkan pada bakteri Gram positif dinding
 selnya terhidrasi dengan perlakuan alkohol, pori-pori mengkerut dengan tembus
dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk
sehingga sel berwarna ungu.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna
lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat warna tersebut
dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu yang
ditentukan. Pembentukan zat warna satu dengan yang lainnya tidak lama sehingga
proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna selalu dilakukan pembilasan
terhadap kaca objek dengan menggunakan aquadest. Pembilasan ini bertujuan
untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir
pembilasan masing-masing reagen perlu dilakukan penyerapan air bilasan
aquadest dengan menggunakan tisu agar aquadest tidak bercampur dengan reagen
atau pewarna baru yang akan diberikan setelah pembilasan terakhir. Kaca objek
dikeringkan dan diamati bakteri gram positif Escherichia coli berwarna merah.
VI. KESIMPULAN
- Bakteri yang digunakan dalam pewarnaan adalah bakteri Escherichia coli.
- Pewarnaan bakteri digunakan untuk membedakan mikroorganisme, khususnya
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negative.
- Bakteri gram negative mempunyai dinding sel tipis yang berada diantara dua lapis
membrane sel.
- Pewarnaan sederhana hanya dapat digunakan dalam mengenali morfologi bakteri
dan hasil dari pewarnaan sederhana yaitu berbentuk batang (basil).
- Pewarnaan gram digunakan untuk membedakan bakteri gram positif dan bakteri
gram negative.
- Bakteri Gram positif ditandai dengan warna ungu, sedangkan bakteri Gram
negatif warna merah.
- Hasil yang didapat dari pewarnaan gram yaitu berbentuk batang (basil) dan
berwarna merah.
- Pewarnaan yang digunakan dalam pewarnaan bakteri adalah pewarnaan
sederhana, pewarnaan Gram.
 - Langkah-langkah utama teknik pewarnaan bakteri antara lain :
 Pembuatan olesan bakteri
 Fiksasi
 Aplikasi zat warna
VII. DAFTAR PUSTAKA
 Dwidjoseputro,D.,2005. Dasar-dasar mikrobiologi. Djambatan,Jakarta
 Hadiutomo, 1990, Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek, Jakarta:PT.Gramedia
 Jawetz E., J. L. Melnick, E. A. Adelberg, G. F. Brooks, J. S. Butel, L. N. Ornston,
1995, Mikrobiologi Kedokteran, ed. 20, University of California, San
Francisco
 Lay, B.W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada,
Jakarta
 Smith-Keary P. F., 1988, Genetic Elements in Escherichia coli, Macmillan
Molecular biology series, London, p. 1-9, 49-54
 Umni. 2008. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Erlangga
 Waluyo, L., 2004, Mikrobiologi Umum, Malang, UMM press.
LAMPIRAN

Hasil dari pewarnaan sederhana pada bakteri Escherichia coli

Hasil dari pewarnaan gram pada bakteri Escherichia coli