Nama : Ainun Aisiyah

NO BP : 1810251009
Kelas : Bakteri Prot C

ISOLASI BAKTERI

1. Isolasi Bakteri Patogen

Isolasi patogen ialah memisahkan patogen / jasad renik yang satu dari lainnya sehingga
didapatkan suatu biakan murni. Untuk mengadakan isolasi terdapat berbagai macam cara
tetapi yang umum dipergunakan untuk mengisolasi patogen tanaman adalah sebagai berikut :
a. Cara Penanaman Jaringan (tissue planting method)
Cara ini didasarkan kepada kenyataan bahwa patogen selalu terdapat pada
jaringan atau bagian tanaman yang terserang. Jaringan atau bagian tanaman pada
perbatasan sehat dan sakit dipotong, dan bila perlu mengadakan desinfeksi permukaan
dengan alkohol 95%, kemudian potongan-potongan jaringan ini kemudian diletakkan
di atas media biakan yang steril. Maksud dari pada memotong jaringan atau bagian
tanaman pada perbatasan yang sehat dan sakit ialah untuk menghindarkan
kontaminasi yang terlalu banyak dan agar didapat patogen penyebab penyakit yang
primer.Sesudah terjadi pertumbuhan dari jasad renik, maka jasad renik ini kemudian
dimurnikan dengan cara memindahkannya ke dalam medium yang baru.
b. Cara pengenceran (dilution plate dan serial dilution method)
Suatu biakan murni sering dapat dibuat suatu populasi yang terdiri dari
berbagai macam jasad renik, dengan mempergunakan cara pengenceran di dalam
medium yang sesuai untuk pertumbuhan jasad renik yang dimaksud. Hal ini
dikerjakan berdasarkan pemikiran bahwa di dalam suatu populasi jasad renik yang
utamalah yang terdapat dalam jumlah yang terbanyak. Dengan diencerkannya
suspensi dari jasad renik ini, maka jasad renik yang terdapat di dalam pengenceran
yang terakhir. Dengan demikian, maka dalam pengenceran yang terakhir diharapkan
didapatkan jasad renik murni yang dimaksudkan. Cara ini banyak dikerjakan untuk
memurnikan populasi dari spora - spora cendawan atau bakteri.
c. Cara penggoresan (streaking method)
Pada dasarnya cara ini sama dengan cara pengenceran di atas, hanya dalam hal
ini populasi jasad renik tidak diencerkan di dalam suatu suspensi atau cairan,
melainkan diencerkan dengan cara penggoresan dalam bentuk gigi gergaji atau zigzag
 dengan mempergunakan jarum. Diharapkan bahwa pada goresan yang terakhir
didapatkan suatu jasad renik dalam keadaan mumi.
d. Cara Penanaman Skierotia (sclerotial planting method)
Cara ini dipergunakan untuk cendawan yang membentuk sklerotium seperti
Rhizoctonia sp, Sclerotium rolfsii dll. Sclerotium tersebut dapat langsung diletakkan
di atas media agar sesudah didesinfeksikan.
Contoh cara isolasi pada Tanaman tomat terserang Pseudomonas solanacearum
dengan metode penggoresan.
- Dengan menggunakan jarum ooze, bakteri dalam air steril digoreskan diatas media
biakan di dalam cawan petri yang sudah membeku.
- Untuk mengurangi kepekatan dari bakteri tersebut maka dilakukan beberapa kali
penggoresan dalam bentuk gigi gergaji atau zig zag.
- Pisahkan pertumbuhan koloni yang terakhir dari setiap goresan. Koloni ini telah
cukup murni.
- Koloni yang dipisahkan tersebut ditanam pada media baru dan amati pertumbuhan
koloni ini.

2. Isolasi bakteri endofit

a. Isolasi bakteri endofit dari tanaman kebar.
Tanaman kebar ditimbang sebanyak 10 gr dan dicuci dengan air mengalir
selama 20 menit. Sterilisasi permukaan tanaman dilakukan dengan cara merendam
tanaman dalam larutan alkohol 70% selama 2 menit, larutan NaOCl 5% selama 5
menit dan alkohol 70% selama 30 detik kemudian dibilas dengan akuades steril
sebanyak 2 kali. Tanaman yang steril di haluskan dengan mortal secara aseptis,
kemudian disaring menggunakan kertas saring dan dimasukkan ke dalam botol flakon
yang berisi akuades steril dengan perbandingan 1:10 dan dibuat pengenceran sampai
10-3. Sebanyak 1 ml disebarkan pada media nutrient agar steril yang dan diinkubasi
selama 24 jam dalam incubator dengan suhu 37°C.
b. Isolasi Bakteri Endofit Dari Akar Tanaman Karet
Isolasi bakteri endofit dari akar dan daun dilakukan dengan metode sterilisasi
permukaan menurut metode Radu & Kqueen (2002). Sampel yang diambil dari lokasi
dimasukkan ke dalam plastik diletakkan di dalam termos yang berisi es batu,
kemudian sampel dibawa ke laboratorium mikrobiologi untuk isolasi bakteri endofit.
Tahap awal yang dilakukan adalah mencuci akar dengan air mengalir selama 20
 menit. Sterilisasi bagian permukaan akar dilakukan dengan cara merendamnya di
dalam larutan secara berturut-turut: etanol 75% selama 2 menit, larutan sodium
hipoklorit 5,3% selama 5 menit dan etanol 75% selam 30 detik. Selanjutnya akar
dibilas dengan akuades steril, setelah kering bagian ujung kiri dan kanan akar
dipotong 1 cm, kemudian masing-masing akar dipotong membujur dan diletakkan di
permukaan media NA yang telah dicampur dengan antibiotik ketokonazole (0,3 g/100
ml) dengan posisi bekas potongan ke arah media, kemudian diinkubasi pada suhu
ruang selama 5 hari. Koloni yang muncul disubkultur ke media NA yang baru untuk
dimurnikan.

3. Isolasi Bakteri Rizobakteri

Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Penambat Nitrogen Tanah diambil dari KP Muara,
Cikabayan, Cikarawang, Leuwikopo, dan Sawah Baru. Isolasi bakteri dilakukan dengan cara
memasukkan 10 g tanah ke dalam erlenmeyer berisi 90 mL larutan fisiologis (NaCl 0.85%)
sebagai pengenceran 10-1. Suspensi tersebut dikocok dengan menggunakan shaker pada
kecepatan 150 rpm selama 30 menit. Ekstrak tanah tersebut selanjutnya diencerkan hingga
10-4 kemudian 0.1 mL dari pengenceran 10-3 dan 10-4 diteteskan pada masing-masing
media untuk isolasi Azotobacter atau Actinomycetes, lalu diinkubasi selama 3 hari. Isolasi
Azotobacter menggunakan media NFM (nitrogen free manitol) dan Actinomycetes dengan
media SCA (starch casein agar). Koloni Azotobacter ditandai dengan ciri bening seperti
tetesan air, permukaan cembung, sedangkan koloni Actinomycetes berwarna putih, diameter
3-20 mm, permukaan awal licin kemudian bertepung.
Pengujian reaksi hipersensitifitas dilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri pada
media nutrient broth (NB) dan dikocok menggunakan shaker dengan kecepatan 150 rpm
selama 24 jam. Isolat dengan kerapatan 109 cfu mL-1 diambil sebanyak 1 mL dengan jarum
suntik steril lalu diinjeksikan ke permukaan bawah daun tembakau secara perlahan.
Perubahan yang terjadi pada daun tembakau diamati, jika spot yang disuntikkan
menunjukkan gejala nekrosis (HR+) maka mengindikasikan mikroba tersebutmerupakan
patogen tanaman. Isolat dengan HR+ tidak diuji lebih lanjut. Kemampuan bakteri untuk
menambat N diuji pada media Ashby nitrogen free medium.