PENDAHULUAN
hepar, ginjal, limpa, dan jantung. Ulserasi dinding usus disebabkan oleh LPS yang
dilepaskan ke aliran darah pada saat demam yang lama. Gejala enterik pada kasus ini
sering juga ditemukan.
Gastroenteritis disebabkan oleh sejumlah species Salmonella. Simptom yang
ada hubungannya dengan tipe keracunan makanan, biasanya terdiri dari sakit perut,
mual, muntah, dan diarea, yang terjadi dalam 24 jam setelah memamakan makanan yang
terkontaminasi. Gejala ini biasanya berlangsung beberapa hari.
Beberapa shigellae menyebabkan shigellosis, satu disentri basiler yang
perjalanan penyakitnya bervariasi. Ulserasi usus abesar, diarea yang eksplosif, demam
dan dehidrasi bisa terjadi pada kasus-kasu yang lebih berat.
Isolasi dan identifikasi bakteri enterik dari tinja, urine, darah dan bahan-bahan
yang terkontaminasi tinja sangat penting pada infeksi enterik. Walaupun
Enterobacteriaceae secara morfologis dan mempunyai beberapa alur metabolisme yang
mirip, namun prosedur laboratorium untuk identifikasi bakteri-bakteri didasarkan pada
perbedaan aktivitas biokimianya.
PENUNTUN GEH 2
Revisi terahir: November 2016
SPECIMEN FECAL
(Tinja atau apusan rectum)
SUBCULTURE
Dipakai medium differential seperti MacConkey agar,
EMB, dll
IMVIC
Peragian Karbohidrat (gula-gula)
Motility
PENUNTUN GEH 3
Revisi terahir: November 2016
Urease
MEDIUM DIFFERENSIAL
Bisa dipakai untuk membedakan kelompok bakteri berdasar morfologi dan
reaksi biokimia. Medium ini mengandung bahan-bahan kimia, yang setelah inokulasi dan
inkubasi akan menampilkan perubahan yang khusus pada penampilan koloni dan atau
perubahan medium disekiatar koloni, yang akan daipakai sebagai pedoaman identifikasi.
1. MacConkey Agar
Crystal violet menghambat pertumbuhan bakteri positif-gram sehingga memungkinan
isolasi dari bakteri negatif-gram. Dengan menambahkan garam empedu dan neutral
red sebagai indikator pH selain crystal violet, memungkinkan defirensiasi bakteri
enterik berdasar kemampuannya untuk meragikan laktose.
Berdasar hal ini, bakteri enterik diabagi atas dua kelompok:
a. Basil-basil Koliform, menghasilkan asam sebagai hasil peragian laktose. Koloni
bakteri ini akan menunjukkan warna merah pada permukaannya. Escherechia coli
lebih banyak menghasilkan asam dari basil-basil koliform yang lain. Bila hal ini
terjadi maka medium disekitar koloni juga akan berwarna merah karena asam
yang mengendap pada garam empedu yang diikuti oleh absorbsi neutral red.
b. Basil-basil disentri, tifoid, dan para tifoid tidak meragikan laktose karena itu
tidak menghasilkan asam. Koloni nampak tidak berwarna dan biasanya tembus
pandang.
PENUNTUN GEH 4
Revisi terahir: November 2016
TES-TES BIOKIMIA
1. TES OKSIDO-FERMENTASI
Tujuan tes
Adalah untuk melihat pemecahan karbohidrat dalam keadaan aerobik/oksidatif atau
anaerobik/fermentatif.
Cara tes
a. Bakteri yang akan dites ditanam pada masing-masing dua medium semisolid yang
disebut medium OF. Medium ini mengandung glukosa atau karbohidrat lain, dan
bromthymol blue sebagai indicator pH yang akan berubah menjadi kuning bila pH
medium menjadi asam.
b. Bagian atas salah satu medium kemudian ditutupi dengan paraffin cair, yang
dipakai untuk melihat pemecahan karbohidrat secara anaerobik. Medium yang
lain dengan bagian atas yang terbuka, dipakai untuk melihat pemecahan
karbohidrat secara aerobik.
c. Kedua medium tersebut kemudian diinkubasikan semalam pada 35-36oC,
d. Keesokan harinya dilihat ada-tidaknya reaksi.
Hasil oksidatif
PENUNTUN GEH 5
Revisi terahir: November 2016
Tabung yang tertutup paraffin tidak berubah warna sedang tabung yang terbuka
berubah menjadi kuning.
Hasil fermentative
Kedua tabung, yang terbuka dan tertutup, menjadi kuning.
Hasil non-oksidatif
Kedua tabung tetap tidak berubah setelah diinkubasi selama 4 hari.
Kontrol
Pseudomonas aeroginosa: Oksidatif untuk glukosa
Non-fermentatif untuk maltosa
Alkaligenes faecalis : Non-oksidatif untuk glukosa dan maltosa
Xanthomonas maltophilia: Oksidatif untuk maltosa.
Catatan
Tes O-F hanya dilakukan pada basil-basil yang tidak meragikan gula-gula, sebagai
pengganti tes peragian gula-gula dengan menggunakan medium TSI.
Cara tes 1
Bakteri ditanam pada medium cair yang mengandung pepton, dan salah satu gula-
gula berikut: glukosa, laktosa, sukrosa, maltosa, atau mannitol. Sebagai indikator pH
dipakai phenol red, yang akan berubah menjadi kuning bila pH menjadi asam.
Ke dalam tabung yang berisi glukosa dimasukkan secara terbalik satu tabung kecil,
yang dikenal sebagai tabung Durham, yang akan dipakai untuk menampung gas,
bila terbentuk gas disamping asam, sebagai hasil peragian glukosa.
PENUNTUN GEH 6
Revisi terahir: November 2016
Hasil tes 1
Positif : Ada peragian karbohidrat, warna indikator berubah menjadi kuning.
Negatif: Tidak ada peragian karbohidrat, warna indikator tetap merah.
Cara tes 2
Bakteri ditanam pada medium TSI (Triple Sugar Iro agar), dengan cara menusuk
tegak lurus ke dalam bagian butt dan mengoleskan pada permukaan bagian slant dari
medium.
Medium TSI agar mengandung:
- Tiga karbiohidrat: glukosa, laktosa, dan sukrosa.
- FeCl2
- Asam amino dengan gugus sulfur.
- Indikator pH: phenol red yang pada pH asam,
akan menjadi kuning.
Hasil tes 2
Bila ada pemecahan karbohidrat secara fermentasi, maka bagian butt dari medium
akan menjadi kuning dan dibaca sebagai reaksi asam pada butt dan alkali pada slant
(reaksi : alkali/asam).
Bila terjadi pemecahan karbo-hidrat secara aerobik dan anaerobik, maka bagian slant
dan butt dari agar menjadi kuning dan dibaca sebagai reaksi asam pada slant dan butt
(reaksi: asam/asam).Kalau tidak ada peragian, maka indikator menjadi merah, dan
dibaca sebagai reaksi alkali, atau tidak ada perubahan warna yang dibaca sebagai
reaksi netral.
Pembentukan gas akan nampak jelas sebagai pecahnya dan terangkatnya agar oleh
adanya gas.
Cara tes
PENUNTUN GEH 7
Revisi terahir: November 2016
Tanam bakteri yang akan dites pada medium MR-VP, yang mengandung pepton dan
glukosa. Inkubasikan pada 35-36oC selama 24 sampai 48 jam, kemudian tetesi dengan
indikator methyl red.
Hasil tes
Positif : dihasilkan asam stabil: warna indikator menjadi merah.
Negatif : tidak dihasilkan asam stabil: warna indikator kuning.
Kontrol
Positif : Escherechia coli
Negatif : Enterobacter cloacae
4. TES VOGES-PROSKAUER
Tujuan
Untuk melihat dihasilkannya asam tidak stabil dari pemecahan glukosa, sehingga
mudah terurai menjadi alkohol dan selanjutnya terurai lagi sehingga sebagai hasil ahir
akan ditemukan acethyl methyl carbinol atau 2,3 butylene glycol.
Cara tes
Bakteri yang dites ditanam pada medium MR-VP dan setelah diinkubasi 24 sampai
48 jam, kemudian ditetesi dengan -naftol 5% dan setelah beberapa saat ditetesi
dengan potassium hidroksida (KOH) 40%.
Hasil tes
Positif : terbentuk cincin merah di antara lapisan -naftol dan KOH., artinya
terdapat acethyl methyl carbinol, karena terbentuknya asam tidak stabil
pada peragian glukosa.
Negatif : tidak terbentuk cincin merah, yang artinya tidak terdapat acethyl methyl
carbinol, karena pada peragian glukosa terbentuk asam yang stabil.
Kontrol
Positif : Enterobacter cloacae
PENUNTUN GEH 8
Revisi terahir: November 2016
Cara tes
Bakteri ditanam pada medium TSI atau SIM yang mengandung asam amino dengan
gugus sulfur, dan ferro chlorida (FeCl2), lalu diinkubasi semalam.
Hasil tes
Positif : dihasilkannya H2S bisa dilihat dengan terbentuknya FeS yang ber-warna
hitam sebagai hasil ikatan antara H2S dan FeCl2.
Negatif : tidak terlihat perubahan agar menjadi hitam, karena tidak dihasilkan H2S
sehingga tidak terbentuk FeS yang berwarna hitam.
Kontrol
Positif : Proteus vulgaris
Negatif : Shigella sonnei
6. TES INDOL
Tujuan
Untuk melihat kemampuan bakteri menghasilkan indol sebagai hasil pemecahan
tryptophan (atau asam amino lain) yang ada dalam pepton.
Cara tes
Bakteri ditanam dengan cara menusukkan ke dalam bagian butt dari medium TSI atau
ke dalam medium SIM, satu medium semisolid yang mengandung tryp-tophan dan
PENUNTUN GEH 9
Revisi terahir: November 2016
FeCl2. Medium ini juga dipakai untuk melihat pembentukan H 2S dan gerakan
(motility) dari bakteri.
Inkubasikan semalam pada 35-36oC, dan setelah meliwati masa inkubasi teteskan
reagens Kovac (p-dimethyl-amino benzaldehyde) pada permukaan medium.
Hasil tes
Positif : Warna reagensia berubah menjadi merah.
Negatif : Warna reagensia tetap coklat muda.
Kontrol
Positif : Escherechia coli
Negatif : Enterobacter cloacae
Cara tes
Bakteri ditanam pada medium citrat, yang mengandung citrat sebagai satu-satunya
sumber karbon dan energi, dengan bromthymol blue sebagai indikator pH.. Ini
kemudian diinkubasikan semalam pada 35-36oC.
Hasil tes
Positif : Ada pertumbuhan bakteri pada permukaan slant agar dan pH medium
berubah sehingga warna indikator menjadi biru.
Negatif : Tidak ada pertumbuhan bakteri pada permukaan slant agar dan pH
medium tidak berubah sehingga warna indikator pH tetap hijau.
Kontrol
Positif : Klebsiella aerogenes
Negatif : Escherechia coli
PENUNTUN GEH 10
Revisi terahir: November 2016
Hasil
Positif : Warna indikator menjadi ungu.
Karena reaksi dekarbonisasi hanya bisa terjadi pada pH asam, maka
medium harus terlebih dahulu diasamkan oleh fermentasi glukosa.
Karena itu medium ini juga dipakai untuk melihat kemampuan bakteri
meragikan glukosa.
Negatif : Seluruh medium menjadi kuning. Tapi dengan inkubasi yang lama terjadi
alkalisasi dari medium sehingga warna indikator berubah menjadi ungu
Medium LIA juga bisa dipakai untuk melihat pembentukan H2S. bila ada
pembentukan H2S, maka warna medium menjadi hitam akibat pembentukan iron
sulfida (FeS2).
Hasil reaksi dekarboksilasi beberapa bakteri:
Bakteri Argine Lysine Ornithine
Proteus vulgaris - - -
Klebsiella eroginosa - + -
Morganella morgagnii - - +
Salmonella typhi + + -
Enterobcter cloacae + - -
Enterobacter aerogenes - + +
Salmonella typhimurium + + +
PENUNTUN GEH 11
Revisi terahir: November 2016
9. TES UREASE
Tujuan tes
Untuk melihat apakah bakteri yang dites menghasilkan urease atau tidak.
Cara tes
Bakteri yang akan dites ditanam pada medium uease yang mengandung urea dengan
neutral red sebagai indikator pH. Setelah melewati masa inkubasi, hasilnya dibaca.
Hasil tes
Positif : Warna pH indikator berubah menjadi merah, karena pH menjadi alkalis
disebabkan oleh terbentuknya ammonia dari urea dengan bantuan enzim
urease.
NH2.CO.NH2 + H2O 2NH3 + CO2
Urease
Negatif : Warna pH indikator tidak berubah menjadi merah.
Kontrol
Positif : Proteus vulgaris
Negatif Escherechia coli
Prisip tes
-kero acid akan bereaksi dengan ferri chlorida membentuk satu produk ahir yang
berwarna hijau (phenylpiruvic acid).
PENUNTUN GEH 12
Revisi terahir: November 2016
Cara kerja
1. Siapkan reagens ferri chlorida seperti di bawah ini :
Ferri chlorida (Fecl2) (Sigma Chemical Co.) 12 gram
Aquadestilata 94,6 ml
Concentrated HCL (37%) 5,4 ml
Larutkan FeCl2 dalam air dan tambahkan HCL pekat perlahan-lahan. Hal ini
dilakukan dalam lemari asam, dan simpan reagens ini dalam botol berwarna
coklat di dalam lemari es.
2. Tanam bakteri yang mau dites dalam medium agar miring yang mengandung
phenylalanine.
3. Inkubasi semalam pada 35-36oC.
4. Setelah masa inkubasi selesai, tambahkan 0,5 ml (5 tetes) reagens ke biakan
bakteri pada permukaan agar miring tersebut, biarkan reagens mengenai seluruh
permukaan.
5. Goyang tabung ke kiri dan ke kanan sehingga reaksi lebih intensif.
6. Perhatikan terjadinya satu perubahan warna menjadi hijau, yang menunjukkan
adanya phenypyruvic acid. Warna tersebut akan menghilang dalam 10 menit, oleh
karena itu pemeriksaan harus dilakukan segera setelah reagens ditambahkan.
Penambahan reagens setelah itu akan menyebabkan perubahan warna hijau lagi.
Kontrol
Positif : Proteus vulagaris
Negatif : Escherechia coli
PENUNTUN GEH 13
Revisi terahir: November 2016
PETUNJUK
1. Untuk 4 regu mahasiswa disediakan masing-masing:
- Satu set medium transport untuk tinja dan medium
enrichment untuk salmonella dan shigella.
- Satu set yang tediri dari gambaran mikroskopis, gambaran
koloni dan hasil tes biokimia dari Salmonella typhi, Shigella dysentriae , dan
Shigella flexneri,
2. Setiap mahasiswa diwajibkan untuk meneliti semua hasil biakan dan hasil tes-tes
biokimia yang didemonstarsikan.
3. Buat catatan apa yang dilihat.
DEMONSTRASI
MEJA 1
Disediakan
Satu seri yang tediri dari gambaran mikroskopis, gambaran koloni Salmonella typhi
pada lempeng agar Salmonella-Shigella, BHI agar dan hasil tes biokimia.
Perhatikan
PENUNTUN GEH 14
Revisi terahir: November 2016
PENUNTUN GEH 15
Revisi terahir: November 2016
MEJA 2
Disediakan
Satu seri biakan Shigella dysentriae pada lempeng agar Salmonella-Shigella, BHI agar
hasil tes biokimia.
Perhatikan
PENUNTUN GEH 16
Revisi terahir: November 2016
Hasil Pengamatan
PENUNTUN GEH 17
Revisi terahir: November 2016
Perhatikan
Hasil Pengamatan
PENUNTUN GEH 18
Revisi terahir: November 2016
PENUNTUN GEH 19
Revisi terahir: November 2016
Lysine decarboxylase
Peragian gula-gula: Glukosa
Gas
Laktosa
Sukrosa
Maltosa
Tes Oksidase
Tes katalase
MEJA 4
Disediakan
1. Kapas lidi
b. Carry and Blair medium: dipakai untuk transportasi tinja atau apusan rectum
yang dicurigai mengandung Vibrio atau Enterobacteriaceae yang patogen.
PENUNTUN GEH 20
Revisi terahir: November 2016
Selenite medium
Air pepton alkalis Bile pepton broth
REAKSI BIOKIMIA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Slant As As As As As Alk Alk Alk Alk Alk Alk Alk Alk
TSI Butt As As As As As As As As As As As N N
H2S Neg Neg Neg pos pos pos D- Neg Neg Neg Neg Neg Neg
Gas pos Neg Neg D+ pos Neg pos Neg D- Neg D+ Neg Pos
Indol Pos Neg Neg pos Neg Neg Neg D- D- pos pos Neg Neg
SIM H2S Neg Neg Neg pos pos pos D- Neg Neg Neg Neg Neg Neg
Motility pos pos Neg pos pos pos pos Neg D- pos pos pos pos
M R Pos Neg D- pos pos pos pos pos D- pos pos Neg Neg
V P Neg pos pos Neg D+ Neg Neg Neg D+ Neg Neg Neg Neg
C I t r a t Neg Pos Pos D+ Pos Neg Neg Neg D+ Pos Pos D Pos
U r e a Neg Neg pos pos pos Neg Neg Neg D- Neg Neg D D+
Phenylalanin diaminase Neg Neg Neg pos pos Neg Neg Neg D- pos pos pos Neg
Lysine decarboxylase Neg pos pos Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg
Arginin dihydrolase D- Neg Neg Neg Neg Neg pos D- Neg Neg Neg Neg Pos
Ornithine decarboxylase D+ Pos Neg Neg Pos Neg Pos Neg Neg Neg Neg Neg Neg
Glukosa- peragian pos pos pos D+ pos Neg Pos Pos D- Neg D+ Neg Pos
Gas pos pos pos pos pos Neg Pos Neg Neg Neg Pos Neg Pos
KH Laktose pos pos pos Neg Neg Neg Neg Neg D Neg Neg Neg Neg
Sucrose pos pos pos pos D- Neg Neg Neg D Pos D Neg Neg
Mannitol pos pos pos Neg Neg pos pos pos pos D Neg Neg Neg
OF Oksidasi glukosa Neg D D- D+ Neg Neg
Fermentasi glukosa Neg D D+ D- Neg
Oksidase Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg pos pos
Katalase Neg Neg Neg Neg Neg Pos Pos Neg Neg Neg Neg pos pos
KETERANGAN
1. Escherichia coli D Reaksinya bermacam-macam
2. Klebsiella aerogenes
3. Klebsiella pneumoniae D + Reaksinya bermacam-macam tapi lebih banyak
4. Proteus vulgaris yang positif
5. Proteus mirabilis
6. Salmonella typhi D – Reaksinya bermacam-macam tapi lebih banyak
7. Salmonella paratyphi A yang negatif
8. Shigella flexneri
9. Enterobacter aglumerans
PENUNTUN GEH 21
Revisi terahir: November 2016
PENUNTUN GEH 22