Padang, 10 Juni2020

Hal : Permohonan Jadwal Seminar hasil

Lamp : Draft Proposal

Kepada Yth,
Ketua Prodi S1 STIFIPerintis Padang
Di
Tempat

Dengan hormat,
Saya yang bertanda tangan di bawah ini :
Nama :Hera purnama sari
NIM : 1604105

SehubungandenganakandilakukannyaSeminarhasil
sayadalambidangFarmakologi denganjudul“Isolasi dan Identifikasi Gen 16s
rRNA Bakteri Endofit AkarTanaman Pepaya (Carica Papaya L.) Serta
Aktivitas Antibakterinya”maka saya mohon kesediaan Bapak/Ibu untuk dapat
memberikan jadwal ujianseminar hasil.
Demikian Surat Permohonan ini saya buat, untukdapatdipertimbangkan.
AtasperhatianBapak/Ibu saya ucapkan terimakasih.

Padang,10 Juni 2020

Pembimbing Akademik Hormat saya

(Tisa Mandala Sari, S.Pd, M.Si) (Hera purnama sari )

Mengetahui,

Pembimbing I Pembimbing II

(Irwandi, M.Farm, Apt) (Diza sartika, M.Farm,Apt)

 TRANSKRIP NILAI
Program Studi Strata Satu (S-1)

NamaMahasiswa : HERA PURNAMA SARI

Nomor Buku Pokok : 1604105

Jurusan : Farmasi

Tempat/TanggalLahir : Singkut, 16 Juli1997

Alamat : Sungai kalu,Kudu gantiang V KOTO TIMUR,

PARIAMAN

HURUF ANGKA NILAI

No KODE MATA KULIAH SKS
MUTU MUTU MUTU
1. FPK 1101 Pancasila & 2
A 4 8
Kewarganegaraan
2. FPK 1102 Agama & Etika 2 A 4 8
3. FPK 1103 Bahasa Inggris 2 A 4 8
4. FKK1201 Matematika Dasar 2 C 2 4
5. FKK 1202 Kimia Dasar 3 B 3 9
6. Pengantar Ilmu
B 3 3
FKK 1203 Farmasi 1
7 FKK 1204 Biologi Dasar 2 B 3 6
8 FKK 1205 Kimia Organik 4 A 4 16
9 FKK 1206 Botani Farmasi I 3 C 2 6
10 FKB 2301 Farmasetika Dasar 3 B 3 9
Kosmetika & Alat
C 2 4
11 FKB 2302 Kesehatan 2
12 FKK 2207 Botani Farmasi II 3 B 3 9
13 FKK 2208 Kimia Analisa 3 C 2 6
14 FKK 2209 Biokimia Dasar 2 A 4 8
15 FKK 2210 Fisika Dasar 2 C 2 4
Biologi Sel &
C 2 4
16 FKK 2211 Molekuler 2
Anatomi fisiologi
C 2 6
17. FKK 2212 Manusia 3
18. FKB 3303 Farmasi Fisika 4 B 3 12
Formulasi Sed Cair
B 3 9
19 FKB 3304 & Semi Solid 3
Farmakologi Dasar &
20 FKB 3305 C 2 6
Toksikologi 3
21 FKB 3306 Analisa Fisiko Kimia 3 C 2 6
22 FKB 3307 Metode Pemisahan 2 B 3 6
23 FKB 3213 Biokimia Farmasi 3 C 2 6
24 FKB 4104 Bahasa Indonesia 2 A 4 8
Formulasi Sediaan
C 2 6
25 FKB 4308 Steril 3
26 FKB 4309 Kimia Farmasi I 3 B 3 9
Farmakognosi-
B 3 9
27 FKB 4310 Fitokimia I 3
28 FKB 4311 Farmakologi I 3 B 3 9
29 FKB 4312 Patofisiologi 2 C 2 4
Mikrobiologi &
B 3 9
30 FKK 4214 Virologi 3
Formulasi Sediaan
B+ 3.5 10.5
31 FKB 5313 Padat 3
32 FKB 5314 Kimia Farmasi II 3 C+ 2,5 7.5
33 FKB 5215 Serologi Immunologi 2 B+ 3.5 7
34 FKB 5315 Farmakologi II 3 C 2 6
Farmakognosi -
B+ 3.5 10.5
35 FKB 5316 FitokimiaII 3
 36 FKB 5317 Analisis Kosmetika 1 C+ 2.5 2.5
Kimia Bahan
B 3 6
37 FKB 5318 Makanan 2
38 FKBE5304 Radio Farmasi 2 C 2 4
Terapi Nutrisi
B 3 6
39 FKKE5203 Medikal 2
Manajemen
B+ 3.5 7
40 FBB 7501 Kewirausahaan 2
41 FPB 7401 UU & Etika Farmasis 2 B 3 6
42 FKB 6319 Farmakoterapi I 2 B 3 6
Metode Penelitian &
C+ 2.5 5
43 FKB 6320 Statistika 2
44 FKB 6321 Biofarmasetika 2 C 2 4
Sistem Penghantaran
B 3 6
45 FKB 6322 Obat 2
Sintesa Senyawa
A 4 8
46 FKK 6216 Obat 2
47 FKB 6323 Kimia Medisinal 3 C+ 2.5 7.5
48 FKB 6324 Farmakokinetika 2 C 2 4
49 FKB 6325 Kimia Bahan Alam 3 C+ 2.5 7.5
JUMLAH 123 111 329

IP KUMULATIF: 2,67

Diketahui Padang, 28 November 2019

Pembimbing Akademik Hormat Saya

(Miftahur Rahmi M.pd) (Hera purnama sari)

 ISOLASI dan IDENTIFIKASI GEN 16s rRNA
BAKTERI ENDOFIT AKAR TANAMAN PEPAYA
(Carica Papaya L.) SERTA AKTIVITAS
ANTIBAKTERINYA

DRAFT PROPOSAL

Oleh :

HERA PURNAMA SARI

NIM: 1604105

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

SEKOLAH TINGGI FARMASI INDONESIA
PERINTIS PADANG
2019
 PERNYATAAN ORISINILITAS DAN PENYERAHAN HAK CIPTA

Saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : HERA PURNAMA SARI

NIM : 1604105

Judul Skripsi : Isolasi dan Identifikasi Gen 16s rRNA Bakteri Endofit Akar
Tanaman Pepaya (Carica Papaya L.) Serta Aktivitas
Antibakterinya”

Dengan ini menyatakan bahwa:

1. Skripsi yang saya tulis merupakan hasil karya saya sendiri, terhindar dari
unsur plagiarisme, dan data beserta seluruh isi skripsi tersebutadalahbenar
adanya.
2. Saya menyerahkan hak cipta dari skripsi tersebut Sekolah TinggiFarmasi
Indonesia Perintis Padang untuk dapat dimanfaatkan
dalamkepentinganakademis

Padang, 20 Juni 2020

Hera purnama sari

 ABSTRAK
Bakteri endofit didefinisikan sebagai bakteri yang menjajah jaringan
tanaman sehat tanpa menyebabkan kerusakan yang signifikan pada inang.
Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa bakteri endofit tertentu dapat
menghasilkan senyawa kimia yang memiliki efek kesehatan, terutama senyawa
penghasil antibakteri. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan
bakteri endofit dari akar tanaman pepaua, untuk menghindari aktivitas antibakteri
bakteri ugainst bakteri patogen endofit bucteria Escherichia coli dan
Staphylococcus aureus yang terisolasi, dan untuk mengidentifikasi spesies bakteri
endofit yang memiliki aktivitas antibakteri tertinggi berdasarkan analisis
molekuler menggunakan gen penyandi 165 rRNA. Isolasi bakteri dilakukan
dengan metode penanaman. Tiga isolat diinokulasi berdasarkan perbedaan
morfologis. Pengujian aktivitas antibakteri diuji dengan metode difusi agar.
Isolat bakteri endofit yang memiliki aktivitas antibakteri tertinggi adalah isolat
Akar 3 yang dikategorikan lemah Escherichia coli dan resisten terhadap
Staphylococcus aureus. Hasil identifikasi molekuler menunjukkan bahwa isolat
Akar 3 memiliki kemiripan 99% dengan Bacillus cereus strain CCM 2010 16S
ribosomal RNA, partial sequence.

Kata kunci: Bakteri Endofit, Akar tanaman pepaya, Staphylococcus aureus,

Escherichia coli 16S rRNA Gene.
 DAFTAR ISI
BAB I. PENDAHULUAN ......................................................................................... 20
1.1 Latar Belakang ............................................................................................ 20
1.2 Rumusan Masalah ....................................................................................... 21
1.3 Tujuan Penelitian......................................................................................... 22
1.4 Manfaat Penelitian ....................................................................................... 22
1.5 Hipotesis ....................................................................................................... 22
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................... 23
2.1 Tinjauan Biologi Tanaman Pepaya ( Carica papaya L.) ............................. 23
2.1.1 Klasifikasi Tanaman Pepaya ( Carica papaya L.)................................ 23
2.1.2 Nama daerah ........................................................................................ 24
2.1.3 Deskripsi Tanaman Pepaya ................................................................. 24
2.1.4 Kandungan kimiadan efek farmakologi .............................................. 24
2.2 Bakteri.......................................................................................................... 25
2.2.1 Definisi .................................................................................................. 25
2.2.2 Struktur bakteri ................................................................................... 26
2.2.3 Klasifikasi Bakteri ................................................................................... 27
2.3 Bakteri endofit ............................................................................................. 29
2.4 PCR (Polymerase Chain Reaction). ............................................................ 31
2.4.1 Komponen PCR ................................................................................... 33
2.4.2 Tahapan PCR ....................................................................................... 35
2.5 Uji Aktivitas Antibakteri ............................................................................. 38
2.6 Elektroforesis ............................................................................................... 41
2.7 Sequensing DNA .......................................................................................... 42
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ................................................................ 47
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ..................................................................... 47
3.2 Alat dan Bahan ............................................................................................ 48
3.2.1 Alat ....................................................................................................... 48
3.2.2 Bahan .................................................................................................... 48
3.3 Prosedur Kerja .................................................................................................. 48
3.3.1 Pengambilan dan Identifikasi Sampel ........................................................ 48
3.3.2 Sterilisasi Alat dan Pembuatan media ...................................................... 49
3.3.3 Isolasi dan Pemurnian Bakteri Endofit Akar Pepaya ........................ 49
 3.3.4 Identifikasi Morfologi Isolat Bakteri Endofit ...................................... 50
3.3.5 Uji Aktivitas Antibakteri Bakteri Endofit ........................................... 52
3.3.6 Identifikasi Bakteri Endofit Terpilih Secara Molekuler ..................... 53
3.4 Teknik Pengolahan Dan Analisa Data ........................................................ 56
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................... 56
4.1 Hasil ................................................................................................................... 57
4.1.1 Hasil Pemeriksaan Identifikasi Akar Papaya (Carica papaya L.) ............. 57
4.1.2 Hasil Isolasi dan Purifikasi Bakteri Endofit Daun Pepaya ........................ 57
4.1.3 Identifikasi secara morfologi koloni isolat bakteri endofit dari akar
tanaman pepaya................................................................................................... 57
4.1.4Identifikasi bakteri secara mikroskopis dilakukan dengan metode
pewarnaan Gram. ................................................................................................ 58
4.1.5 Uji Aktivitas Antibakteri Bakteri Endofit ................................................. 58
4.1.6 Amplifikasi DNA dengan Metode PCR ...................................................... 59
4.1.7 Hasil Sekuensing ......................................................................................... 61
4.2 Pembahasan ....................................................................................................... 63
BAB V.......................................................................................................................... 67
KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................................ 67
5.1 KESIMPULAN .............................................................................................. 67
5.2 SARAN........................................................................................................... 67
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................. 68
 KATA PENGANTAR
Alhamdulillah, penulis haturkan ke hadirat Allah Yang Maha Kuasa yang
telah melimpahkan rahmat, hidayah dan kemudahan kepada penulis sehingga
dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul “Isolasi dan
Identifikasi Gen 16s rRNA Bakteri Endofit Akar Tanaman Pepaya (Carica
Papaya L.) Serta Aktivitas Antibakterinya” sebagai salah satu syarat untuk
memperoleh gelar Sarjana Farmasi diSekolah Tinggi Farmasi Indonesia Perintis
Padang.
Penulis mempersembahkan rasa terima kasih yang tak terhingga kepada
Ayahandaku Zarwadi dan Ibundaku Hera wati yang telah memberikan semangat
dan cinta yang teramat tulus dan selalu memberikan uang jajan dan uang
kuliahku., untuk adikku tersayang Suci rahmadani, Indah, Hamzah serta kakak-
kakakku Hengki pratama, Haris prima, Heny yuni, Hamka atas semua doa, kasih
sayang, semangat dan pengorbanan baik moril maupun materil. Semoga Allah
SWT selalu melindungi kalian semua.

Pada kesempatan ini, penulis juga mengucapkan terima kasih yang

sebesar-besarnya kepada:

1. Bapak Irwandi, M.Farm, Apt selaku pembimbing I dan Diza Sartika ,

M.Farm, Apt selaku pembimbing II, yang dengan penuh perhatian dan
kesabaran telah meluangkan waktu untuk memberikan petunjuk, arahan dan
nasehat dalam menyelesaikan penelitian dan penulisan SKRIPSI ini.
2. Bapak Zulkarni R, MM, Apt selaku Ketua di Sekolah Tinggi Farmasi
Indonesia Perintis Padang.
3. Bapak dan Ibu staf pengajar di Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia Perintis
Padang yang telah mendidik penulis selama masa perkuliahan.
4. Kepala laboratorium Farmakologi dan analis yang telah membantu Semoga
Allah SWT membalas segala kebaikan yang telah diberikan degan pahala
yang berlipat ganda.
5. Sahabat-sahabat penulis: Natasya Adzura yang selalu ada saat duka maupun
suka, Indah tamara yang selalu ingin mendengar keluh kesah dari penulis ini.
6. Dan para pejuang untuk menjadi sarjana Wilda ilwahyuli, Nailul hariri, Welly
zafarani, Diah rahmatika, Widia febrina, yang telah memberi semangat dan
dukungan
7. Rekan-rekan di Laboratorium Ulfa Rosiatul huda, Puji rahmasari yang telah
sabar dengan sikap ego dan sikap tergesa-gesa dari diri penulis dan selalu
memberi dukungan, semangat, bantuan.
8. Dan teman gas touring Bobo, Atika, Sanah, Tio, Alva, Ade yang telah
menjadi teman perjalan touring yang baik.
9. Para sahabat seperjuangan (VEREN16EN) angkatan 16 serta rekan-rekan
mahasiswa STIFI_YP yang telah memberikan semangat dan membantu
penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

Serta seluruh pihak yang telah memberikan bantuan, motivasi dan inspirasi
bagi penulis selama masa perkuliahan sampai penyusunan skripsi ini. Semoga
Allah SWT memberikan balasan yang berlipat ganda dan pahala yang sebesar-
besarnya kepada semua pihak yang telah membantu penyelesaian skripsi ini.
 Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak
guna perbaikan skripsi ini. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini dapat
bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya di bidang Farmasi.

Padang, 20 Juni 2020

Penulis,

Hera purnama sari

 BAB I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Secara empiris tanaman pepaya memang sudah banyak dimanfaatkan

dalam pengobatan. Akar pepaya sering dimanfaatkan sebagai obat cacing,

diuretik, kandung kemih, sakit persendian dan pegal-pegal. Senyawa yang

terkandung dalam akar papaya diantaranya alkaloid, saponin, polifenol, dan

flavonoid (Hutapea, 1991).

Tanaman pepaya (Carica papaya L.) juga mengandung senyawa yang

berfungsi sebagai antibakteri diantaranya alkaloid karpain, glukotropaeolin, dan

benzil isotio sianat (Jzou et al., 2003). Daughari et al. (2007) telah meneliti

tentang aktivitas antibakteri dari akar pepaya (Carica papaya L.) terhadap

berbagai bakteri patogen dengan metode difusi agar. Akar pepaya diekstraksi

menggunakan air dan pelarut organik (metanol dan aseton). ekstrak metanol

mempunyai aktivitas antibakteri yang paling tinggi pada semua bakteri uji baik

Gram positif maupun Gram negatif. Hasil skrining fitokimianya menunjukkan

bahwa ekstrak metanol akar pepaya (Carica papaya L.) mengandung senyawa

alkaloid, tannin, saponin, glikosida, dan fenol.

Umumnya, Pengambilan senyawa bioaktif dari suatu tanaman obat dapat

dilakukan dengan cara mengekstrak bagian dari tanaman tersebut. Cara ini tentu

tidak efektif, karena apabila tanaman obat tersebut terus-menerus diambil untuk

diekstrak senyawa bioaktifnya maka ketersediaan tanaman tersebut dilingkungan

akan menurun, Namun cara efisien untuk memperoleh senyawa tersebut adalah

menggunakan bakteri endofit yang mampu menghasilkan sejumlah senyawa yang

dibutuhkan, sehingga tidak harus mengekstrak senyawa tersebut dari tanaman

inangnya (Simarmata dkk., 2007).

Hal ini mengakibatkan penelitian-penelitian terkait eksplorasi bakteri

endofit dari berbagai tanaman terus di tingkatkan. Dengan berkembangnya

identifikasi mikroorganisme, maka penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi

bakteri endofit dari akar pepaya dan uji aktivitas antibakteri akar pepaya (Carica

papaya L.) terhadap S. aureusyangmerupakan bakteri patogen penyebab bisul

bernanah, radang selaput otak, dan racun pada makanandan E. coli dapat

menyebabkan diare yang ringan sampai sedang, bahkan dapat berakibat fatal

(Buchanan dan Gibbons 1974). serta mengisolasi bakteri endofit dari bagian akar

tanaman pepaya untuk menentukan spesies dari bakteri endofit dengan

menggunakan PCR (Polymerase Chain Reaction). Identifikasi dengan analisis

sekuensing gen 16S rRNA dinilai memberikan hasil yang akurat, dan

menunjukan hasil yang dapat digolongkan pada genus atau spesies tertentu

(Kattar et al., 2000). Gen 16S rRNA dapat digunakan sebagai penanda

molekuler karena bersifat ubikuitus dengan fungsi yang identik pada

seluruh organisme (Stackebrandt dan Goebel, 1995).

1.2 Rumusan Masalah

1. Apakah bakeri endofit dapat diisolasidan diidentifikasidari akar pepaya

(Carica Papaya L.) ?

2. Berapa besar aktivitas antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri endofit

akar tanaman pepaya (Carica Papaya L.) ?

1.3 Tujuan Penelitian

1. Untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri endofit dari akar

pepaya(Carica Papaya L.)

2. Untuk mengetahui berapa besar aktivitas antibakteriyang dihasilkan oleh

bakteri endofit akar tanaman pepaya (Carica Papaya L.)

1.4 Manfaat Penelitian

1. Dari penelitian ini diharapkan diperoleh informasi mengenai keberadaan

bakteri endofit pada jaringan tanaman akar pepaya (Carica Papaya L.)

yang mempunyai aktivitas bakteri.

2. Hasil peneliian ini diharapkan memberikan masukkan dalam

pengembangan ilmu pengetahuan dan menjadi bahan referensi bagi

peneliti berikutnya.

1.5 Hipotesis

1. H0 : Bakteri endofit dari akar pepaya tidak memiliki aktivitas antibakteri.

H0 : Tidak dapat dilakukan isolasi dan identifikasi bakteri endofit dari

akar pepaya dengan PCR.

2. H1 : Bakteri endofit dari akar pepaya memiliki aktivitas antibakteri.

H1 : Dapat dilakukan isolasi dan identifikasi bakteri endofit akar pepaya

dengan PCR.
 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tinjauan Biologi Tanaman Pepaya ( Carica papaya L.)

2.1.1 Klasifikasi Tanaman Pepaya ( Carica papaya L.)

Divisi : Spermatophyta

Sub divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Bangsa : Cistales

Suku : Caricacea

Marga : Carica

Jenis : Carica papaya, Linn. (Depkes, 2000).

Gambar 1. Tanaman pepaya (da Silva, 2007)

Gambar 2. Akar pepaya (da Silva, 2007)

2.1.2 Nama daerah

Pente (Aceh), Pertek (Gayo), Pastela (Batak), Embetik (Karo), Botik

(BatakToba), Bala (Nias), Sikailo (Mentawai), Kates (Palembang), Kalikih

(Minangkabau), Gedang (Lampung), Gedang (Sunda), Kates (Jawa Tengah),

Kates (Madura), Bali (Gedang), Kustela (Banjar), Bua medung (Dayak Busang),

Buah dong (Dayak Kenya), Kates (Sasak), Kampaya (Bima), Kala jawa

(Sumbawa), Padu (Flores), Papaya (Gurontalo), Papaya(Buol), Kaliki (Baree),

Papaya (Manado), Unti jawa (Makasar), Kaliki riaure (Bugis), Papai (Buru),

Papaya (Halmahera), Papae (Ambon), Pepaya Palaki (Seram), Kapaya (Tidore),

Tapaya (Ternate), Ihwarwerah (Sarmi), Siberiani (Windesi) (Depkes, 2000).

2.1.3 Deskripsi Tanaman Pepaya

Tanaman pepaya merupakan perdu tinggi kurang lebih 10 meter, tidak

berkayu, silindris, berongga, putih, kotor. Daun tunggal, bulat, ujung runcing,

pangkal bertoreh, tepi bertoreh, tepi bergerigi, diameter 25-75 cm, pertulangan

menjari, panjang tangkai 25-100 cm, hijau. Bunga tunggal, bertekuk bintang, di

ketiak daun, berkelamin satu atau berumah dua. Bunga jantan terletak pada tandan

yang serupa malai, kelopak kecil, kapala sari bertangkai pendek atau duduk,

kuning, mahkota bentuk terompet, tepi bertajuk lima, bertabung panjang, putih

kekuningan. Bunga betina berdiri sendiri, mahkota lepas, kepala putik lima,

duduk, bakal buah beruang satu, putih kekuningan. Biji bulat atau bulat panjang,

kecil, bagian luar dibungkus selaput tipis yang berisi cairan, masih muda putih,

setelah tua hitam. Akarnya tunggang, bercabang bulat, putih kekuningan (Depkes,

2000).

2.1.4 Kandungan kimiadan efek farmakologi

 Daun, akar dan kulit batang Carica papaya L. mengandung alkaloid,

saponin dan flavonoid. Daun dan akar juga mengandung polifenol dan biji

mengandung saponin (Depkes, 2000). Daunnya mengandung enzim papain,

alkaloid karpaina, pseudo karpaina, glikosid, karposid, dan saponin. Buahnya

mengandung beta karotene, pectin, d-galaktosa, l-arabinosa, papain, papayotimin

papain. Bijinya mengandung glukosida cacirin, karpain. Daun pepaya berkhasiat

sebagai bahan obat malaria dan menambah nafsu makan. Akar dan bijinya

berkhasiat sebagai obat cacing, getah buah berkhasiat sebagai obat memperbaiki

pencernaan (Depkes, 2000). Pepaya bersifat manis dan netral. Akar berguna

sebagai peluruh kencing (diuretik), obat cacing, penguat lambung, serta

perangsang kulit. Biji dapat dipakai untuk obat cacing dan peluruh haid. Buah

matang dapat memacu enzim pencernaan, peluruh empedu (cholagogue),

menguatkan lambung (stomatik) dan antiscorbut. Buah mengkal bermanfaat

sebagai pencahar ringan (laxative), peluruh 6 kencing, pelancar keluarnya ASI

(galaktagog), dan abortivum. Daun dapat menambah nafsu makan, meluruhkan

haid, dan menghilangkan sakit (analgetik) (Wijayakusuma dan Dalimartha, 2000).

2.2 Bakteri

2.2.1 Definisi

Bakteri pertama kali ditemukan pada tahun 1683 oleh Antonie Van

Leeuwenhoek. Bakteri adalah organisme prokariotik bersel tunggal yang hidup

bebas dan tidak berklorofil, mempunyai DNA dan RNA serta mampu

menunjukkan semua proses-proses dasar kehidupan seperti metabolisme, tumbuh

dan berkembang biak, memiliki habitat alami yang beragam seperti air, udara,

tanah, makanan dan organisme tingkat tinggi. Pada beberapa habitatnya bakteri
sebagai organisme normal, tetapi karena suatu keadaan tertentu jumlah bakteri

tersebut dapat meningkatkan dan menyebabkan penyakit pada manusia. Bakteri

dapat bersimbiosis dengan organisme lain di alam, dimana simbiosis ini dapat

bersifat mutualisme, komensalisme dan parasitisme. Sifat parasitisme ini dapat

menimbulkan penyakit pada tumbuhan, hewan dan manusia (Wesley A. Volk,

1993).

2.2.2 Struktur bakteri

Gambar 3. Sruktur Bakteri (Jawetz, 2010)

Struktur dasar bakteri : dinding sel tersusun dari peptidoglikan yaitu

gabungan protein dan polisakarida (ketebalan peptidoglikan membagi bakteri

menjadi bakteri gram positif bila peptidoglikannya tebal dan bakteri gram negatif

bila peptidoglikannya tipis). Membran plasma adalah membran yang

menyelubungi sitoplasma tersusun atas lapisan fosfolipid dan protein. Sitoplasma

merupakan cairan sel yang terdiri dari 80% air. Selain air juga mengandung asam

nukleat, protein, karbohidrat dan lipid. Ribosom adalah organel yang

tersebardalam sitoplasma, tersusun atas protein dan RNA. Granula penyimpanan,

karena bakteri menyimpan cadangan makanan yang dibutuhkan (Singleton, P. P.,

1981).

2.2.3 Klasifikasi Bakteri

Berdasarkan bentuk morfologinya, maka bakteri dapat dibagi atas tiga
bagian (Pratiwi, 2008) yaitu :
1. Bentuk Basil

Basil dari kata bacillus, merupakan bakteri yang bentuknya menyerupai

batang atau silinder, membelah dalam satu bidang, basil dapat berupa batang

tunggal, berpasangan atau bentuk rantai pendek atau panjang. Bentuk basil ini

dapat dibedakan atas, Bentuk tunggal, yaitu basil yang terlepas satu sama lain

dengan ujung-ujungnya yang tumpul. Diplobasil, yaitu basil yang bergandengan

dua-dua dengan ujung-ujungnya yang tumpul. Streptobasil, yaitu basil yang

bergandeng-gandengan panjang dengan ujung-ujungnya yang tumpul.

2. Bentuk kokus

Kokus adalah bakteri yang berbentuk bulat atau oval, ada yang hidup sendiri

dan ada yang dijumpai hidup berpasangan, kubus atau membentuk rantai panjang,

bergantung pada caranya membelah diri kemudian melekat satu sama lain setelah

pembelahan. Bentuk kokus ini dapat dibedakan atas :Diplokokus, yaitu kokus

vang bergandengan dua-dua. Tetrakokus, yaitu kokus yang mengelompok

berempat. kemudian melekat satu sama lain setelah pembelahan, Bentuk kokus ini

dapat dibedakan atas : Diplokokus, yaitu kokus yang bergandengan dua-dua.

Tetrakokus, yaitu kokus yang mengelompok berempat. Stapilokokus, yaitu kokus

yang mengelompok merupakan suatu untaian. Streptokokus, yaitu kokus yang

bergandeng-gandengan panjang seperti rantai. Sarsina, kokus yang mengelompok

serupa kubus.
3. Bentuk Spiral

Kelompok bakteri ini terdiri atas beraneka ragam bentuk bakteri berbentuk

silinder, yang bukan lurus seperti basil melainkan melingkar, Bakteri bentuk spiral

ini dibedakan menjadi beberapa jenis antara lain: Vibrio, yaitu bakteri yang

berbentuk batang melengkung menyerupai koma, ada yang tumbuh sebagai

benang-benang membelit atau berbentuk 's'. Spiril, yaitu dari kata spirilium yang

menyerupai spiral atau lilitan yang sebenarnya. Spirochaeta, yaitu merupakan

bakteri spiral. tetapi bakteri ini memiliki spiril yang bersifat fleksibel (mampu

melenturkan dan melekukkan tubuhnya sambil bergerak).

Berdasarkan pewarnaan Gram, maka bakteri dapat dibedakan menjadi dua

bagian (Lay, 1994) yaitu:

1. Bakteri Gram positif, yaitu bakteri yang dapat mengikat zat warna pertama

(kristal violet) akan memberikan warna ungu dan setelah dicuci dengan

alkohol, warna ungu tersebut akan tetap kelihatan. Kemudian ditambahkan

zat warna kedua (safranin), warna ungu pada bakteri tidak berubah. Contoh

Stapylococcus aureus, Stapylococcus epidermidis, Stapylococcus

saprophyticus, Streptococcus pneumoniae, dan Streptococcus agalactiae.

2. Bakteri Gram negatif, yaitu bakteri yang kehilangan warna dari kristal violet

ketika dicuci dengan alkohol dan setelah diberi zat warna kedua (safranin).

bakteri akan memberikan warna merah muda. Contoh : Salmonella species,

Salmonella typhi. Salmonella dysenteriae, Klebsiella pneumoniae,Eschericia

coli, dan Pseudomonas dan deruginosa.

Jika dilihat di bawah mikroskop, bakteri Gram positif akan berwarna ungu,

karena dapat menahan kompleks pewarna primer karbol gentian violet iodium
sampai akhir prosedur pewarnaan. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah,

karena kehilangan kompleks warna karbol gentian violetiodium dengan

pembilasan alkohol, lalu terwarnai oleh pewarna tandingan air fuksin (Cappucino,

1987).

Perbedaan reaksi kedua golongan bakferi tersebut terhadap pewarnaan

Gram disebabkan bakteri Gram positif memiliki dinding sel tebal yang akan

menyusut pada saat pembilasan alkohol, sehingga pori-porinya menutup dan

mencegah keluarnya kompleks pewarna primer pada saat pemucatan. Sedangkan

dinding sel bakteri Gram negatif mengandung banyak lipid yang larut dalam

alkohol pada saat pembilasan. Larutnya lipid memperbesar pori-pori dinding sel

dan menyebabkan proses pemucatan berlangsung cepat (Cappucino 19871).

2.3 Bakteri endofit

Bakteri endofit didefinisikan sebagai mikroorganisme yang hidup

mengolonisasi bagian dalam tanaman dan dapat tinggal untuk seluruh

atausebagian dari siklus hidupnya tanpa menyebabkan kerusakan atau penyakit

bagi inangnya (Chebotar dkk, 2015).

Bakteri endofit dapat masuk ke dalam jaringan tanaman umumnya

melalui akar, namun bagian tanaman yang terpapar udara langsung seperti

bunga, batang, daun (melalui stomata) dan kotiledon, juga dapat menjadi jalur

masuk bakteri endofit. Bakteri endofit yang telah masuk ke dalam tanaman dapat

tumbuh hanya di satu titik tertentu atau menyebar ke seluruh tanaman.

Mikroorganisme ini dapat hidup di dalam pembuluh vaskular atau di ruang

intersel (Zinniel dkk, 2002), akar, batang, daun dan buah (Simarmata dkk,

2007; Bacon dan Hinton 2006). Jumlah bakteri endofit di dalam tanaman tidak
dapat ditentukan secara pasti, namun bakteri ini dapat dideteksi dengan

mengisolasi pada media agar (Bacon dkk, 2006).

Bakteri endofit dapat menghasilkan senyawa bioaktif yang dapat

dimanfaatkan sebagai antibakteri, antifungi, antivirus, antikanker, antidiabetes,

antimalaria dan antiimunosupresif (Strobel dan Daisy, 2003). Keuntungan lain

yang diperoleh dari pengembangan bakteri endofit penghasil antibakteri adalah

dapat menjaga kelestarian tumbuhan obat, terutama jenis tumbuhan yang langka,

agar tidak dieksploitasi secara terus menerus yang akhirnya akan mengakibatkan

kepunahan (Prihatiningtias, 2006).

Interaksi bakteri endofit dan tanaman merupakan suatu bentuk

simbiosis. Simbiosis antara tanaman dengan bakteri endofit bersifat netral,

mutualisme atau komensalisme (Bacon dan Hinton 2006). Simbiosis

mutualisme antara bakteri endofit dengan tanaman, dalam hal ini bakteri

endofit mendapatkan nutrisi dari hasil metabolisme tanaman dan melindungi

tanaman dalam melawan patogen, sedangkan tanaman mendapatkan derivat

nutrisi dan senyawa aktif yang diperlukan selama hidupnya (Simarmata dkk,

2007).

Bakteri endofit memberikan kontribusi pada pertumbuhan tanaman inang

dengan memproduksi zat pengatur tumbuh tanaman, meningkatkan induksi

resistensi tanaman inang terhadap patogen dan parasit, membantu fiksasi nitrogen,

dan menghasilkan antibiotik (Bhore dkk, 2010). Endofit dapat melindungi

tanaman dengan melawan patogen melalui mekanisme induksi pertahanan

tanaman, sekresi zat yang bersifat antagonis terhadap patogen atau melalui
kompetisi untuk memperoleh nutrisi dan ruang untuk melakukan kolonisasi

(Hurek dkk, 2011).

Bakteri endofit dapat diisolasi dari bagian bunga, buah, daun, batang, akar,

dan benih dari berbagai spesies tanaman. Umumnya bakteri endofit yang

ditemukan pada berbagai tumbuhan berasal dari genus Pseudomonas, Bacillus,

Enterobacter, dan Agrobacterium (Hallman dkk, 1997). Beberapa spesies bakteri

Pantoea, Enterobacter, Methylobacterium, Agrobacterium, dan Bacillus banyak

dilaporkan sebagai bakteri endofit pada tumbuhan yang dibudidayakan

(Susilowati dkk, 2010).

Bakteri endofit adalah bakteri yang hidup di dalam jaringan tanaman inang

tanpa menyebabkan gejala-gejala penyakit (Bhore dkk, 2010). Bakteri endofit

memberikan kontribusi pada pertumbuhan tanaman inang dengan memproduksi

zat pengatur tumbuh tanaman, meningkatkan induksi resistensi tanaman inang

terhadap patogen dan parasit, membantu fiksasi nitrogen, dan menghasilkan

antibiotik (Bhore dkk, 2010). Endofit menghasilkan hidrolisis ekstraselular

sebagai mekanisme resistensi untuk mengatasi serangan dari tanaman inang atau

untuk mendapatkan nutrisi. Enzim tersebut termasuk pectinases, esterases,

cellulases and lipases, proteinase, á-1,4 glucan lyase and phosphatases (Tan dan

Zou, 2001).

2.4 PCR (Polymerase Chain Reaction).

Kary B. Mullis mengembangkan Polymerase Chain Reaction (PCR)

pada tahun 1983, untuk merevolusi metodologi dari biologi molekuler. PCR

yaitu suatu proses yang didasarkan pada reaksi enzimatik in-vitro dalam

amplifikasi DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA
baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target dengan bantuan

enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler. Nama

PCR berasal dari kata DNA polymerase yang merupakan enzim yang

berperan dalam replikasi DNA di dalam sel, disebut juga reaksi berantai (chain

reaction) karena DNA polymerase akan melakukan replikasi secara terus-

menerus sampai dengan sejuta kopi DNA yang diinginkan (Mader 2001,

dalam Husnaeni 2008).

Dalam uji PCR, terdapat tiga langkah temperatur terkendali yang dapat

dilihat, dan siklus dari proses PCR ini dapat diulang berkisar antara 25─50

siklus. Menurut Bernard (1998) dalam Siregar dkk (2008), PCR merupakan

suatu teknik untuk memperbanyak potongan DNA spesifik.

Dalam proses PCR langkah pertama dari siklus pertama, DNA

template yang asli dibuat menjadi berberkas tunggal dengan meningkatkan

suhu 94oC, dikenal dengan tahap denaturasi. Tahap denaturasi ini biasanya

dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas

DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil sehingga

menjadi tempat bagi primer. Pada langkah kedua, primer menempel pada

DNA template. Hal ini biasanya dilakukan dengan menurunkan suhu

sekitar 35─65oC, tahap ini dikenal dengan tahap annealing. Primer

sebaiknya menempel pada daerah yang spesifik. Semakin panjang primer, maka

semakin harus spesifik daerah yang diamplifikasi. Suhu yang tidak tepat

menyebabkan terjadinya penempelan primer disembarang tempat. Langkah ketiga,

suhu yang dipilih berkisar antara 65oC─72oC. Suhu yang dipakai pada

proses ini tergantung dari jenis DNA polymerase yang dipakai. Langkah ini
dikenal dengan tahap pemanjangan atau elongasi. Produk PCR dari produk

yang berbeda akan menghasilkan panjang sekuen yang berbeda. Hal ini

dapat dideteksi dengan elektroforesis pada gel agarose (Zuhriana, 2010).

2.4.1 Komponen PCR

Beberapa komponen penting yang dibutuhkan dalam reaksi PCR adalah

DNA template, sepasang primer oligonukleotida, DNA polimerase,

deoksinukleosida trifosfat (dNTP) , dan larutan buffer (Muladno, 2010; Gaffar,

2007; Sulistyaningsih, 2007).

1. Templat DNA

Templat DNA adalah molekul DNA untai ganda yang mengandung

sekuen target yang akan diamplifikasi. Ukuran DNA bukan merupakan

faktor utama yang berhasil PCR, berapapun panjangnya jika tidak

mengandung sekuen yang diinginkan maka tidak akan berhasil proses PCR,

namun sebaliknya jika ukuran DNA tidak terlalu panjang tetapi menggunakan

sekuen yang diinginkan maka PCR akan berhasil (Sulistyaningsih, 2007).

Konsentrasi DNA juga dapat mempengaruhi keberhasilan PCR. Jika

konsentrasinya terlalu rendah maka primer mungkin tidak dapat menemukan

target dan jika perlu terlalu tinggi akan meningkatkan kemungkinan

mispriming. Disamping itu perlu diperhatikan kemurnian template karena

akan mempengaruhi hasil reaksi (Sulistyaningsih, 2007).

2. Primer

Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang

memiliki urutan komplemen dengan DNA template yang akan diperbanyak.

Panjang primer antara 20-30 basa. Untuk menentukan urutan primer, perlu
 diketahui urutan nukleotida pada awal dan akhir DNA target. primer

oligonukleotida disintesis menggunakan alat yang disebut DNA synthesizer

(Gaffar, 2007). Konsentrasi primer biasanya optimal pada 0,1-0,5 µM.

Konsentrasi primer yang terlalu tinggi akan menyebabkan mispriming

(penempelan pada tempat yang tidak spesifik) dan akumulasi produk non

spesifik serta meningkatkan kemungkinan terbentuk primer-dimer, sebaliknya

bila konsentrasi primer terlalu sedikit PCR menjadi tidak efisien sehingga

hasilnya rendah (Sulistyaningsih, 2007).

3. Enzim DNA Polimerase

DNA polimerase adalah enzim yang mengkatalisis polimerisasi DNA.

Biasanya digunakan Taq polimerase yang stabil pada suhu tinggi karena

enzim ini terisolasi dari Thermus aquaticus yang hidup pada sumber air

panas. Konsentrasi enzim yang dibutuhkan untuk PCR biasanya 0,5-2,5 unit.

Kelebihan jumlah enzim mengakibatkan akumulasi produk non spesifik,

sedangkan jika terlalu rendah maka dihasilkan produk yang diinginkan

(Sulistyaningsih, 2007).

4. Deoxynucleotide Triphosphate (dNTP)

Deoxynucleotide Triphosphate merupakan material utama untuk

sintesis DNA dalam proses PCR yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP, dan

dTTP. Konsentrasi dNTP masing-masing sebesar 20-200 µM dapat

menghasilkan keseimbangan optimal antara hasil, spesifitas dan ketepatan

PCR. Konsentrasi masing-masing dNTP harus seimbang untuk

meminimalkan kesalahan penggabungan. Deoymucleotide Triphosphate akan

menurunkan Mg2+ bebas sehingga mempengaruhi aktivitas polimerase dan

 menurunkan annealing primer. Konsentrasi dNTP yang rendah akan

meminimalkan mispriming pada daerah non target dan menurunkan

kemungkinan perpanjangan nukleotida yang salah. Oleh karena itu spesifitas

dan ketepatan PCR meningkat pada konsentrasi dNTP yang lebih rendah

(Sulistyaningsih, 2007).

5. Larutan Buffer

Larutan buffer yang biasa digunakan untuk reaksi PCR mengandung

10 mM Tris-HCL pH 8,3, 50 mM KCI, dan 1,5 mM Mg2Cl2. Optimalisasi

konsentrasi ion Mg2+ merupakan hal yang penting. Konsentrasi ion ini

mempengaruhi beberapa hal yaitu annealing primer, suhu pemisahan untai

template dan produk PCR, spesifitas produk, pembentukan primer-dimer serta

aktivitas dan ketepatan enzim Taq polimerase. PCR harus mengandung 0,5-

2,5 µM Mg2+ dari total konsentrasi dNTP. Konsentrasi yang lebih tinggi akan

meningkatkan produk PCR tetapi menurunkan spesifitasnya. Konsentrasi ion

ini tergantung pada konsentrasi bahan- bahan yang mengikatnya seperti

dNTP, EDTA, dan fosfat (Sulistyaningsih, 2007).

2.4.2 Tahapan PCR

Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam

30-40 siklus dan berlangsung dengan cepat (Zuhriana, 2010) :

1. Denaturasi

Di dalam proses PCR, denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq

polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan

proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya
berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA

terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap

mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi)

secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu

denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase.

Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5

menit masing-masing pada suhu 92,5 ; 95 dan 97,5oC.

2. Annealing (penempelan primer)

Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalah

bahwa primer sebaiknya berukuran 18–25 basa, mengandung 50–60 % G+C dan

untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens DNA dalam masing-

masing primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling berkomplemen, karena hal

ini akan mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan

mengurangi efisiensi PCR. Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR

adalah 30 – 45 detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi

temperaturnya. Kisaran temperatur penempelan yang digunakan adalah antara

36oC sampai dengan 72oC, namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50

– 60oC.

3. Pemanjangan Primer

Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA

primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada

suhu 72oC diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH,

konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR

dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk
tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang

digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk

PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda.

Reaksi-reaksi tersebut di atas diulangi lagi dari 25 – 30 kali (siklus)

sehingga pada akhir siklus akan diperoleh molekul-molekul DNA rantai ganda

yang baru yang merupakan hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak

dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus

amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target dalam campuran reaksi.

Produk PCR dapat diidentifikasi melalui ukurannya dengan menggunakan

elektroforesis gel agarosa. Metode ini terdiri atas menginjeksi DNA ke dalam gel

agarosa dan menyatukan gel tersebut dengan listrik. Hasilnya untai DNA kecil

pindah dengan cepat dan untai yang besar diantara gel menunjukkan hasil positif.

Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi. Hal ini didasarkan atas

spesifitas, efisiensi dan keakuratannya. Spesifitas PCR terletak pada

kemampuannya mengamplifikasi sehingga menghasilkan produk melalui

sejumlah siklus. Keakuratan yang tinggi karena DNA polymerase mampu

menghindari kesalahan pada amplifikasi produk. Masalah yang berkenaan dengan

PCR yaitu biaya PCR yang masih tergolong tinggi. Selain itu kelebihan lain

metode PCR dapat diperoleh pelipatgandaan suatu fragmen DNA (110 bp,5x10-9

mol) sebasar 200.00 kali setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit.

Reaksi ini dilakukan dengan menggunakan komponen dalam jumlah sangat

sedikit, DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5 ug oligonukleotida yang

diperlukan hanya sekitar 1 mM dari reaski ini biasa dilakukan dalam volume 50-

100 ul. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu
sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu sekuen

DNA dalam genom bakteri hanya dengan mencampukan kultur bakteri di dalam

tabung PCR.

2.5 Uji Aktivitas Antibakteri

Penentuan kepekaan bakteri patogen terhadap antimikrobia dapat

dilakukan dengan salah satu dari dua metode pokok yakni dilusi atau difusi

(Jawetz dkk., 2005).

a. Metode Dilusi

Metode ini menggunakan antimikrobia dengan kadar yang menurun secara

bertahap, baik dengan medium cair atau padat. Kemudian medium diinokulasi

bakteri uji dan dieramkan (Jawetz dkk., 2005). Tahap akhir metode ini, dilarutkan

antimikrobia dengan kadar yang menghambat atau mematikan. Uji kepekaan cara

dilusi cair dengan menggunakan tabung reaksi, tidak praktis dan jarang dipakai,

namun kini ada cara yang lebih sederhana dan banyak dipakai, yakni

menggunakan microdilution plate (Jawetz dkk., 2005). Keuntungan uji

mikrodilusi cair adalah bahwa uji ini memberi hasil kuantitatif yang menunjukkan

jumlah antimikroba yang dibutuhkan untuk mematikan bakteri (Jawetz dkk.,

2005).

b. Metode Difusi

Metode yang paling sering digunakan adalah metode difusi agar. Cakram

kertas saring berisi sejumlah tertentu obat ditempatkan pada medium padat yang

sebelumnya telah diinokulasi bakteri uji pada permukaannya. Setelah diinkubasi,

diameter zona hambat sekitar cakram dipergunakan untuk mengukur kekuatan

hambatan obat terhadap organisme uji (Jawetz dkk., 2005). Metode ini
dipengaruhi beberapa faktor fisik dan kimia, selain faktor antara obat dan

organisme (misalnya sifat medium dan kemampuan difusi, ukuran molekular dan

stabilitas obat). Meskipun demikian, standardisasi faktor-faktor tersebut

memungkinkan melakukan uji kepekaan dengan baik (Jawetz dkk., 2005).

Penggunaan cakram tunggal pada setiap antibiotik dengan standardisasi

yang baik, bisa menentukan apakah bakteri peka atau resisten dengan cara

membandingkan zona hambatan standar bagi obat yang sama. Daerah hambatan

sekitar cakram yang berisi sejumlah tertentu antimikrobia tidak mencerminkan

kepekaan pada obat dengan konsentrasi yang sama per millimeter medium, darah

atau urin (Jawetz dkk., 2005).

Menurut Jawetz dkk. (2005), ada beberapa cara pada metode difusi ini,

yaitu:

1. Kirby-Bauer

Cara Kirby-Bauer merupakan suatu metode uji sensitivitas bakteri yang

dilakukan dengan membuat suspensi bakteri pada medium Brain Heart Infusion

(BHI) cair dari koloni pertumbuhan kuman 24 jam, selanjutnya disuspensikan

dalam 0,5 ml BHI cair (diinkubasi 4-8 jam pada suhu 37°C) (Jawetz dkk., 2005).

Hasil inkubasi bakteri diencerkan sampai sesuai dengan standar konsentrasi

kuman. Suspensi bakteri diuji sensitivitas dengan meratakan suspensi bakteri

tersebut pada permukaan medium agar. Piringan antibiotik diletakkan di atas

medium tersebut dan kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 19-24 jam

(Jawetz dkk., 2005).

Dibaca hasilnya sebagai:

a. Zona radical
 Suatu daerah di sekitar piringan yang sama sekali tidak ditemukan

adanya pertumbuhan bakteri. Potensi antibiotik diukur dengan mengukur diameter

dari zona radical.

b. Zona iradical

Suatu daerah di sekitar piringan yang menunjukkan pertumbuhan bakteri

dihambat oleh antibiotik tersebut, tapi tidak dimatikan. Disini akan terlihat adanya

pertumbuhan yang kurang subur atau lebih jarang dibanding dengan daerah di luar

pengaruh antibiotik tersebut (Jawetz dkk., 2005).

2. Cara sumuran

Suspensi bakteri diratakan pada medium agar, kemudian agar tersebut

dibuat sumuran dengan garis tengah tertentu menurut kebutuhan. Larutan

antibiotik yang digunakan diteteskan ke dalam sumuran. Diinkubasi pada suhu

37°C selama 18-24 jam. Dibaca hasilnya, seperti pada cara Kirby-Bauer (Jawetz

dkk., 2005).

3. Cara Pour Plate

Setelah dibuat suspensi kuman dengan larutan BHI sampai konsentrasi

standar, lalu diambil satu mata ose dan dimasukkan ke dalam 4 ml agar base 1,5%

dengan suhur 50oC (Jawetz dkk., 2005). Suspensi kuman tersebut dibuat homogen

dan dituang pada medium agar Mueller Hinton. Setelah beku, kemudian dipasang

disk antibiotik (diinkubasi 15-20 jam pada suhu 37oC) dibaca dan disesuaikan

dengan standar masing-masing antibiotik (Jawetz dkk., 2005).

Berdasarkan sifat selektif toksisitasnya, terdapat antibakteri yang bersifat

menghambat dan membunuh bakteri. Kadar minimal yang diperlukan untuk

menghambat pertumbuhan mikroba atau membunuhnya, masing-masing dikenal

sebagai kadar hambat minimum (KHM) dan kadar bunuh minimum (KBM).

Davis Stout (1971) mengemukakan bahwa ketentuan kekuatan antibakteri

adalah sebagai berikut: diameter hambatan 20 mm atau lebih berarti sangat kuat,

diameter hambatan 10-20 mm berarti kuat, 5-10 mm berarti sedang dan diameter

hambatan 5 mm atau kurang berarti lemah.

2.6 Elektroforesis

Elekroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau

pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja

dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif

(anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode),

sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju

kutub negatif (anode). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil

amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya pita

yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-

potongan jumlah pasangan basanya (Klug dan Cummings, 1994).

Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel.

Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor

seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat

medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan

atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan

kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak

melalui matriks tersebut (Brown, 1992). Elektroforesis dalam bidang genetika,

digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu

sekuen DNA tertentu (Klug dan Cummings 1994).

Pengamatan pergerakkan molekul DNA pada gel agarose dilihat dengan

pewarnaan (staining) dengan Loading dye. Uji kuantitatif DNA dan RNA dengan

spektofotometri UV-Vis merupakan salah satu spektofotometri UV-Vis yang

mempunyai teknologi nano (Fatchiyah dkk, 2011).

Visualisasi molekul DNA dapat dilakuakan dengan metode pewarnaan.

Cara yang paling mudah untuk melihat hasil dari gel elektroforesis adalah

mewarnai gel dengan komponen yang dapat membuat DNA terlihat. Etidium

bromida (EtBr) dapat digunakan untuk mewarnai gel agarose. Pita dengan posisi

yang berbeda berdasarkan ukuran fragmen DNA dapat dengan jelas terliha

dibawah radiasi sinar UV setelah pewarnaan dengan EtBr (Brown, 2006).

Pengamatan jumlah DNA melalui spektrofotometer didasarkan pada

prinsip iradiasi sinar ultra violet yang di serap oleh nukleotida dan protein dalam

larutan. Iradiasi sinar ultra violet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam

larutan. Penyerapan iradiasi sinar UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada

panjang gelombang 260 nm, sedangkan penyerapan maksimal oleh protein dicapai

pada panjang gelombang 280 nm (Muladno, 2002).

2.7 Sequensing DNA

Sekuensing DNA atau pengurutan basa DNA merupakan teknik kunci

dalam perkembangan ilmu pengetahuan, di antaranya genetika, bioteknologi,

biologi molekuler, dan genomika (Franca dkk. 2002). Sekuensing DNA bertujuan

untuk menentukan urutan basa nitrogen (adenin, guanin, sitosin, dan timin) suatu

sampel DNA. Salah satu contoh aplikasi ambisius teknologi sekuensing DNA
yaitu pengurutan genom manusia melalui proyek yang dikenal Human Genome

Project. Dalam ilmu pengobatan sekuensing DNA digunakan untuk

mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan pengobatan penyakit

genetik. Tahun 1970 merupakan awal pengembangan sekuensing DNA dengan

metode kromatografi. Selanjutnya diperkenalkan metode sekuensing DNA dengan

menggunakan metode dye-based sequencing (Olsvik dkk, 1993).

Metode sekuensing DNA yang pertama kali digunakan adalah metode

Sanger (Sanger dideoxy sequencing). Metode ini menggunakan DNA templat dan

memerlukan primer spesifik untuk reaksi sekuensing. Teknologi sekuensing

Sanger dan modifikasinya mendominasi metode sekuensing selama 30 tahun

(Sanger dkk. 1997).

Sekuensing dapat dilakukan dengan metode yang berbeda:

1. Maxam - Gilbert sequencing

Metode ini membutuhkan pelabelan radioaktif di satu ujung dan pemurnian

fragmen DNA untuk diurutkan. Perlakuan kimia menghasilkan jeda pada proporsi

kecil satu atau dua dari empat nukleotida berdasarkan masing-masing dari empat

reaksi (G, A + G, C, C + T). Demikian serangkaian fragmen berlabel dihasilkan,

dari ujung radiolabelled ke situs 'cut' pertama di masing-masing molekul.

Fragmen dalam empat reaksi disusun berdampingan dalam elektroforesis gel

untuk pemisahan ukuran. Untuk memvisualisasikan fragmen, digunakan sinar-X

film untuk autoradiografi (Bisht & Panda, 2013).

2. Metode pemutusan rantai

Metode terminator rantai lebih efisien dan menggunakan lebih sedikit bahan

kimia beracun dan lebih rendah jumlah radioaktivitas dari pada metode Maxam
dan Gilbert. Prinsip utama dari metode Sanger adalah penggunaan trifosfat

dideoxynucleotide (ddNTPs) sebagai terminator rantai DNA. Metode terminasi

rantai membutuhkan cetakan DNA beruntai tunggal, primer DNA, DNA nuklease

polimerase, berlabel radioaktif atau berfluoresensi, dan nukleotida termodifikasi

itu mengakhiri perpanjangan untai DNA (Bisht & Panda, 2013).

3. dye terminator

Cara lain pelabelan primer adalah dengan melabel pemutus rantainya, lazim

disebut metode sekuensing dye terminator. Keunggulan cara ini adalah bahwa

seluruh proses sekuensing dapat dilakukan dalam satu reaksi, dibandingkan

dengan empat reaksi terpisah yang diperlukan pada penggunaan primerberlabel.

Pada cara tersebut masing-masing dideoksinukleotida pemutus rantai ditandai

dengan pewarna fluoresens. Cara ini lebih mudah dan lebih cepat dibandingkan

penggunaan primer berwarna, namun dapat menimbulkan ketidaksamaan tinggi

kurva atau puncak (peak) yang disebabkan oleh ketidaksamaan penggabungan

pemutus rantai berwarna berukuran besar pada pertumbuhan DNA

(ketidaksamaan tersebut bergantung pada DNA cetakan). Metode ini kini

digunakan pada sebagian besar usaha reaksi sekuensing karena lebih sederhana

dan lebih murah (Bisht & Panda, 2013).

4. Otomatisasi dan persiapan sampel

Mesin sekuensing DNA automatis modern mampu mengurutkan 384 sampel

berlabel fluoresens sekaligus dalam sekali batch (elektroforesis) yang dapat

dilakukan sampai 24 kali sehari. Hal tersebut hanya mencakup proses pemisahan

dan proses pembacaan kurva; reaksi sekuensing, pembersihan, dan pelarutan

ulang dalam larutan penyangga yang sesuai harus dilakukan secara terpisah (Bisht

& Panda, 2013).

Dalam metode ini dilakukan berturut-turut penempelan primer (primer

annealing), ekstensi oleh polimerase DNA, dan denaturasi (peleburan atau

melting) untai-untai DNA cetakan secara berulang-ulang (25–40 putaran).

Kelebihan utama sekuensing daur adalah lebih efisiennya penggunaan pereaksi

sekuensing yang mahal dan mampunya mengurutkan templat dengan struktur

sekunder tertentu seperti hairpin loop atau daerah kaya-GC (Bisht & Panda,

2013).

5. Strategi sekuensing skala besar

Pengurutan skala besar bertujuan untuk mengurutkan potongan DNA yang

sangat panjang, seperti keseluruhan kromosom. Ini terdiri dari pemotongan

(dengan enzim restriksi) atau dengan mekanik Pasukan fragmen DNA besar

menjadi fragmen DNA pendek. DNA yang terfragmentasi dikloning menjadi

vektor DNA, dan diamplifikasi dalam E.coli. Fragmen DNA pendek dimurnikan

dari individu koloni bakteri secara individual diurutkan dan dirakit secara

elektronik menjadi satu panjang, urutan yang berdekatan. Metode ini tidak

memerlukan informasi yang sudah ada sebelumnya tentang urutan DNA dan

dirujuk sebagai urutan de novo (Bisht & Panda, 2013).

6. Metode sekuensing baru.

c. Pyrosequencing

Pyrosequencing adalah teknik pemetaan DNA yang berdasarkan deteksi

terhadap pirofosfat yang dilepaskan selama sintesis DNA. Teknik ini

memanfaatkan reaksi enzimatik yang dikatalis oleh ATP sulfurilase dan luciferase

untuk pirofosfat inorganic yang dilepaskan selama penambahan nukleotida.

d. Illumina (Solexa)

Metode sekuensing ini ditemukan oleh perusahaan Illumina. Sekuensing

Illumina menggunakan primer yang akan berkomplemen dengan adaptor yang

telah disediakan oleh perusahaan pada sebuah plat. Proses sekuensing ini

menggunakan teknik bridge PCR, yaitu terbentuknya jembatan pada saat elongasi.

Nukleotida penghenti akan diberikan dan pendaranan fluoresens akan direkam

oleh kamera.

e. Analisis sequen DNA dengan Blast

Analisa DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting

dalam mengungkap rahasia genetik di balik kehidupan. Banyak sekali penelitian

life science yang melibatkan analisa ini. Pencapaian terbesar teknologi DNA

sequencing saat ini adalah terungkapnya urutan basa nukleotida yang menyusun

genom manusia. Para peneliti yang menggunakan tools ini seringkali menghadapi

masalah dalam melakukan analisa, output yang dihasilkan seringkali tidak

memuaskan. DNA sequencing menggunakan elektrophoresis kapiler merupakan

teknologi kunci pada laboratorium-laboratorium life science (Bisht & Panda,

2013).
 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan di Laboratorium Mikrobilogi STIFI Yayasan

Perintis Padang dan Laboratorium Bioteknologi dan Pemuliaan Tanaman Fakultas

Pertanian, Universitas Andalas, Padang, pada bulan Januari 2019 sampai Maret

2020.
3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Masker, sarung tangan,erlenmeyer, gelas ukur, tabung reaksi, rak tabung

reaksi, beaker glass, batang pengaduk, pipet tetes, timbangan analitik,

pisau,cawan petri, jarum ose, pinset, lampu spritus, lemari pendingin, laminar air

flow, autoklaf, oven, mikrotube, pipet mikro, tip, jangka sorong, kertas

label,kertas koran, kompor, tabung eppendrof, spin column,colection

tube,thermoblock,plastik wrap, aluminium foil, tisu,kapas, kasa, mikroskop

cahaya, kacaobjek,seperangkat alat PCR dan seperangkat alat elektroforesis.

3.2.2 Bahan

Sampel akar papaya, bakteri uji Escherichia coli sebagai gram negatifdan

Staphylococcus aureus sebagai gram positif, aquadest, alkohol 96%, etanol

70%,NaCl 0.9%, larutan BaCl22H2O 1,175%,Larutan H2SO4 1%, nistatin,

Natrium hipoklorit 5.25 %, iodin, fuksin, media Nutrient Agar, media Nutrient

Broth, larutan kristal violet, disk amoxsisilin, lugol 2%, larutan safranin,minyak

emersi, KAPA 2G Fast Ready Mix + Dye, Genomic DNA Mini Kit (Geneaid),

primer forward 16s rRNA (5’CCAGCAGCCGCGGTAATACG -3’) dan primer

reverse 16s rRNA (5’-ATCGG(C/T)TACCTTGTTACGACTTC3’),serbuk

agarosa,TAE Buffer, dan Ethidium Bromida.

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Pengambilan dan Identifikasi Sampel
Sampel Tanaman akar pepaya diperolehdi daerah Lubuk Buaya
Kecamatan Koto Tangah, Padang, Sumatra Barat. Diambil seluruh bagian
tanaman pepaya kemudian sampel akar tanaman pepaya diidentifikasi di
Herbarium ANDA Jurusan biologi Fakultas MIPA Universitas Andalas Padang.
3.3.2 Sterilisasi Alat dan Pembuatan media
a. Sterilisasi alat
Alat yang di gunakan terlebih dahulu di cuci bersih dan di keringkan

sebelum disterilkan. Cawan petri di bungkus dengan koran,tabung reaksi dan pipet

tetes di tutup mulutnya dengan kapas lalu di bungkus satu persatu dengan kertas

koran. Semua alat disterilkan dalam oven pada suhu 160oC selama 1 jam. Mulut

Erlenmeyer dan gelas ukur ditutup dengan kapas dan di bungkus satu persatu

dengan kertas koran lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15

menit tekanan 15 lbs. Pinset, jarum ose, dan kaca objek disterilkan dengan cara

dibakar menggunakan lampu spritus.

b. Pembuatan nutrien agar

Medium Nutrient Agar dibuat dengan cara melarutkan 42 gr Nutrient Agar

kedalam 1500 ml aquadest steril dalam erlenmeyer. Larutan ini selanjutnya

dipanaskan diatas kompor sambil diaduk-aduk selama 10-15 menit, selanjutnya

disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit (Retnowati, 2011).

c. Pembuatan Nutrient Broth

Medium Nutrient Broth dibuat dengan cara melarutkan 9,6 gr Nutrient

Broth kedalam 1200 ml aquadest steril dalam erlenmeyer. Larutan ini selanjutnya

di panaskan diatas kompor sambil diaduk-aduk selama 10-15 menit selanjutnya

disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit(Retnowati, 2011).

Prosedur kerja

3.3.3 Isolasi dan Pemurnian Bakteri Endofit Akar Pepaya

Sampel dicuci dengan air mengalirhingga bersih, kemudian dipotong

masingmasing sekitar 1-3 cm. Potongan sampel tersebutdilakukan sterilisasi

permukaan secara bertahap Potongan sampel direndam etanol 96% selama1

menit, dilanjutkan ke dalam Na-hipoklorit5.25% selama 5 menit, kemudian

dibilas lagi kedalam etanol 96% sebanyak tiga kali. Sampelyang telah disterilisasi

lalu ditanam pada mediaisolasi Nutrient Agar (NA) yang mengandungnistatin

(0.01% b/v) kemudian diinkubasidi ruang gelap dan diamati sampai

adanyapertumbuhan koloni. Pemurnian koloni bakteridilakukan dengan

memindahkan 1 ose kolonike dalam cawan Petri yang berisi media NA.Setelah

diperoleh biakan murni, bakteri endofitdipindahkan ke agar miring NA

(modifikasiKusumawati et al. 2014). Isolat bakteri endofi yang telah murni

diidentifiasi secara morfologi berdasarkan warna koloni, bentuk tepian koloni,

elevasi koloni dan konsistensi koloni serta kecepatan pertumbuhan koloni

(Modifiasi Desriani dkk. 2013).

3.3.4 Identifikasi Morfologi Isolat Bakteri Endofit

a. Morfologi

Bentuk koloni (dilihat dari atas) : berupa titik-titik, bulat, berbenang, tak

teratur, serupa akar, serupa kumparan. Permukaan koloni (dilihat dari samping) :

rata, timbul-datar, mencembung, melengkung, membukit, serupa kawah. Tepi

koloni (dilihat dari atas) : utuh, berombak, berbelah, bergerigi, berbenang,

keriting. Warna koloni (pigmentasi) : Beberapa bakteri menghasilkan pigmen

ketika mereka tumbuh di media misalnya : pigmen hijau, merah, coklat, kuning,

putih, orange, ungu, dan krem (Dwidjoseputro., 1989).

b. Biokimia

Prosedur pewarnaan gram menurut (Radji, 2010) terdiri atas beberapa

langkah sebagai berikut:

1. Bakteri endofit diambil sedikit dengan jarum ose secara aseptis dan

disuspensikan dengan aquadest yang ada diatas gelas objek.

2. Preparat difukasi di atas api bunsen sampai kering.

3. Preparat ditetesi dengan larutan kristal ungu dan didiamkan selama 1

menit.

4. Zat kristal ungu tersebut kemudian dicuci dengan air mengalir dan

dikeringkan.

5. Preparat ditetesi dengan larutan iodin dan didiamkan selama 1 menit,

dicuci dengan air mengair dan dikeringkan.

6. Preparat ditetesi dengan larutan alkohol 96% sampai warna ungu

hilang.

7. Preparat ditetesi dengan larutan safranin dan didiamkan selama 30

detik, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.

8. Preparat ditetesi fuksin selama 1-2 menit, dicuci dengan air mengalir

dan di keringkan.

9. Preparat dicuci dan dikeringkan lalu diamati dibawah mikroskop.

Zat warna karbol kristal ungu dan larutan lugol akan membentuk

senyawa komplek yang berwarna ungu. Setelah pencucian dengan alkohol

96%, beberapa bakteri dapat melepaskan zat warna ungu dengan mudah,

sedangkan kelompok lain dapat mempertahankan zat warna ungu tersebut.

Bakteri yang tidak mempertahankan zat warna ungu pada pencucian dengn

alkohol 96% maka merupakan bakteri gram negatif, sedangkan kelompok

bakteri yang mempertahankan zat warna ungu tersebut merupakan bakteri

 gram positif. Dengan pewarnaan zat warna merah air fuksin dan safranin

maka bakteri gram negatif ditandai dengan warna merah (Radji, 2010).

3.3.5 Uji Aktivitas Antibakteri Bakteri Endofit

a. Pembuatan Larutan Mac Farland 0,5

Larutan H2SO4 1% sebanyak 9,95 mL dicampurkan dengan larutan

BaCl22H2O 1,175% sebanyak 0,05 mL dalam erlenmeyer. Kemudian dikocok

sampai terbentuk larutan yang keruh. Kekeruhan ini dipakai sebagai standar

kekeruhan suspensi bakteri uji (Whitman dkk., 2010).

b. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji

Bakteri uji yaitu Escherichia coli merupakan gram negatif dan

Staphylococcus aureus yang merupakan gram positif yang telah diinokulasi

diambil ± 1 ose (0,5-1 ml) kemudian disuspensikan ke dalam tabung yang berisi 5

mL larutan NaCL 0,9% sehingga diperoleh kekeruhan yang sama dengan standar

kekeruhan larutan Mac farland 0,5. Suspensi bakteri tersebut dipipet sebanyak

200 μL dan dituangkan ke media pembenihan.

c. Penyiapan Bakteri Endofit

isolat bakteri endofit diambil dengan jarum ose kemudian masing-masing

diinokulasikan ke dalam 5 mL media cair Nutrient Broth dan diinkubasi selama

24 jam pada suhu 27oC – 29oC.

d. Pengujian Aktivitas Antibakteri

Suspensi bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli diambil

200 µl dan diratakan pada permukaan Natrient agar. Permukaan media diberi 3

buah kertas cakram yang ditetesi dengan suspensi bakteri endofit dari akar bagian
paling dalam, tengah dan dekat kulit batan dan disk amoxisisilin sebagai kontrol

positif, kemudian diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 37 oC selama 24 jam.

e. Pengamatan dan Pengukuran Zona Hambat

Pengamatan dilakukan setelah 24 jam masa inkubasi. Zona bening yang

terbentuk di sekitar kertas cakram diamati. Diameter zona hambat ini kemudian

diukur dengan menggunakan jangka sorong. Diameter zona hambat yang terukur

dikategorikan kekuatan daya antibakterinya berdasarkan penggolongan (Davis and

Stout, 1971).

Davis Stout (1971) mengemukakan bahwa ketentuan kekuatan antibakteri

adalah sebagai berikut: diameter hambatan 20 mm atau lebih berarti sangat kuat,

diameter hambatan 10-20 mm berarti kuat, 5-10 mm berarti sedang dan diameter

hambatan 5 mm atau kurang berarti lemah.

3.3.6 Identifikasi Bakteri Endofit Terpilih Secara Molekuler

a. Isolasi DNA

Isolasi DNA dari kultur bakteri di lakukan dengan Master mix kit

(Qiagen). Sampel bakteri endofit di media miring diambil mengunakan pipet

mikro dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorfyang telah berisi buffer GP1

sebanyak 400 μL dimana buffer GP1 bekerja pada saat prosses lisis

(penghancuran membran dan dinding sel), kemudian divortex. Selanjutnya sampel

dalam tabung eppendorf dimasukkan ke dalam thermoblock pada suhu 60oC

selama 15 menit. Tabung kemudian disentrifugasi (ultrasentrifugasi). Sampel

kemudian dimasukkan buffer GP2 sebanyak 100 μL, dimana buffer GP2 berfungsi

sebagai buffer penetral, dan didinginkan dalam freezer selama 1 menit,

disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Supernatan

dipindahkan ke dalam tabung spin column dan ditambahkan buffer GP3 sebanyak

750 μL dimana buffer GP3 berfungsi untuk mengikat DNA kebuffer serta spin

column.Sebagian dari supernatan dipindahkan pada colection tube beserta spin

column lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit.

Ditambahkan sisa supernatan yang ada dengan buffer GP3. Selanjutnya

disentrifugasi 10.000 rpm selama 1 menit, filtrat dibuang. Ditambahkan buffer W1

sebanyak 400 μL ke dalam tabung spin column disentrifugasi pada kecepatan

10.000 rpm selama 1 menit, dimanabuffer W1 berfungsi untuk menghilangkan

sisa-sisa protein yang menempel pada DNA) . Setelah itu filtrat dibuang lalu

dilakukan pencucian kedua dengan mencampurkan wash buffer sebanyak 600 μL

sentrifugasi kecepatan 15.000 rpm selama 1 menit dimana fungsi Wash buffer

adalah mencuci garam-garam buffer sebelumnya. Sementara itu elution buffer

dipanaskan pada thermoblock pada suhu 60℃. Setelah sentrifugasi selesai,

membran dengan DNA dipindahkan ke dalam tabung eppendorf baru dan

dikering-anginkan selama 2 menit. Membran ditambahkan elution buffer

sebanyak 100 μL ke dalam tabung collection tube dan spin column, dimana fungsi

elution buffer adalah untuk melepas DNA dari membran. Selanjutnya sentrifugasi

dilakukan dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit.

b. Amplifikasi Gen 16S rRNA dengan PCR

Komponen-komponen dan campuran yang digunakan untuk primer 16S

rRNA:

Tabel 1. Komponen dan campuran untuk primer 16S rRNA dan DNA sampel

Pereaksi Jumlah pereaksi (µL)

 Template DNA 5 µL

Go Taq mastermix 12,5 µL

Primer forward 1 µL

Primer reverse 1 µL

Nuclease free water 5 µL

Volume total 25 µL

Tabel 2. Keterangan Primer

Kode Sekuen

16S rRNA Forward 5’ CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’

16S rRNA Reverse 5’-ATCGG(C/T)TACCTTGTTACGACTTC3’

Tiap-tiap komponen dimasukkan kedalam tube PCR, untuk DNA bakteri

dimasukkan terakhir agar tidak terkontaminasi. Lalu dihomogenkan dan

dimasukkan ke mesin PCR.

Tabel 3. Siklus PCR untuk optimasi gen bakteri dan primer

Jumlah siklus Temperatur Waktu

1 95oC 3 menit

35 Denaturasi 95oC 10 detik

Annealing 55oC 10 detik

Extensi 72oC 15 detik

1 Post extending 72oC 1 menit

1 Cooling Sampai selesai

c. Elektroforesis Gel Agarosa dan Visualisasi

 Bubuk agarose 0,8 % ditimbang 0,5 gr dilarutkan dalam 50 ml TBE buffer

dalam Erlenmeyer, kemudian dicampur dan dididihkan dengan microwave selama

1-2 menit sampai larut hingga berwarna jernih, lalu tuangkan dalam cetakan

casting tray beserta sisirnya. Sampel sebanyak 7 µl amplikon produk pcr + 3µl

loading dye dimasukkan kedalam sumur gel dalam chamber elektroforesisis.

Pada sumur pertama digunakan DNA ladder 1 Kbp 6 µl. Power supply dinyalakan

selama 60 menit, 100 volt. Visualisasi dilakukan dengan sinar UV pada UV-

transiluminator. Hasil dideteksi didokumentasi (Mayangsari, 2012).

d. Sekuensing Gen 16S rRNA

Proses sekuensing dilakukan dengan mengirim data ke PT. Genetika. Hasil

sekuensing DNA dianalisis menggunakan metode BLAST secara online pada

website (http//www.ncbi.nlm.nig.gov) untuk dicocokkan dengan data spesies pada

Gen Bank untuk mencari kesamaan urutan nukleotida gen 16S rRNA dalam

menentukan spesies isolat bakteri endofit dari akar pepaya yang memiliki daya

antibakteri.

3.4 Teknik Pengolahan Dan Analisa Data

Analisis dilakukan dengan menggunakan analisis eksperimen dan

deskriptif antara lain dengan melihat hasil dari isolasi dan identifikasi bakteri

teknik molekuler berbasis rRNA yaitu dengan metode PCR, dimana seluruh data

diperoleh dari isolasi dan pengamatan yang telah dilakukan selama proses kerja,

yaitu dengan pengumpulan data, pengamatan secara langsung, dan dokumentasi

untuk dijadikan bukti hasil penelitian.

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
4.1.1 Hasil Pemeriksaan Identifikasi Akar Papaya (Carica papaya L.)
Hasil pemerikasaan identifikasi tumbuhan Akar pepaya ( Carica papaya
L.) yang diperoleh di Lubuk Minturun, Kecamatan Koto Tangah, Kota Padang
dilakukan đi Herbarum ANDA dengan No Identifikasi : 095/K-ID/ANDA/II/2020
(Lampiran 1)

4.1.2 Hasil Isolasi dan Purifikasi Bakteri Endofit Daun Pepaya

Hasıl yang didapatkanan pada isolasi sebanyak 3 isolat murni bakteni
endofit yang telah di isolasi dari tanaman Akar pepaya pada media Natrium agar
dengan cara penanaman yang telah steril pada suhu 37°C. Ketiga isolat diberi
simbol A 1 (Akar luar ), A 2 (Akar tengah), dan A 3 (Akar dalam). Ketiga isolat
merupakan koloni muni bakteri endofit (Lampiran 2)

4.1.3 Identifikasi secara morfologi koloni isolat bakteri endofit dari akar
tanaman pepaya.
Pengamatan morfologi dilakukan dengan memperhatikan perbedaan ketiga
isolat bakteri. Berdasarkan hasil pengamatan morfologi koloni bakteri endofit
didapatkan banyak isolat yang menunjukkann isolat yang berbeda-beda.
semuanya memiliki bentuk koloni bulat dengan pingiran utuh, tekstur permukaan
halus dan warna. Di katakan bakteri endofit jika warna pada permukaan koloni
yaitu puih kekuningan, atau putih kental seperti susu. Selain itu bakteri endofit
dicirikan dengan bentuk sel individu yang batang, serta bentuk koloni yang bulat,
oval atau tidak beraturan (Pelezar, 1986).

Tabel 1. Morfologi koloni bakteriendofit dari akar tanaman pepaya.

Kode Bentuk Elevasi Pinggiran Warna Tekstur

isolat
1 Bulat Melengkung Utuh Putih susu Halus
2 Bulat Mencembung Utuh Putih susu Halus
3 Bulat Melengkung Utuh Putih susu Halus

Gambar 1. Morfologi koloni bakteri endofit dari akar tanaman pepaya dari
medium agar.
 Akar 1 Akar 2 Akar 3

4.1.4Identifikasi bakteri secara mikroskopis dilakukan dengan metode

pewarnaan Gram.
Hasil pengamatan secara mikroskopis dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Identifikasi bakteri uji dilakukan melalui pewarnaan gram dan

dilihat dari perbesaran mikroskop 40X.

Akar 1 Akar 2 Akar 3

Hasil pewarnaan Gram diketahui bahwa seluruh bakteri endofit yang
diisolasi dari akar tumbuhan pepaya merupakan Gram positif. Secara mikroskopis
juga diketahui bahwa bakteri endofit yang diisolasi dari akar tumbuhan Pepaya
memiliki bentuk basil dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Identifikasi bakteri pewarnaan gram.
NO Tanaman Warna Bentuk
1 Akar 1 Merah Basil
2 Akar 2 Merah Basil
3 Akar3 Merah Basil
Identifikasi bakteri melalui pewarnaan Gram dilakukan untuk memastikan
kebenaran bakteri yang diujikan dan memastikan bahwa bakteri yang akan diuji
tidak terkontaminasi mikroorganisme lain.
4.1.5 Uji Aktivitas Antibakteri Bakteri Endofit
Gambar 3. Hasil uji aktivitas bakteri tehadap bakteri Escherichia colisecara
swap.
Gambar 4. Hasil uji aktivitas bakteri tehadap bakteri Staphylococcus aureus
secara swap.

Hasil penelitian menunjukkan sebanyak 3 isolat bakteri endofi dan kontrol

positif mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli, kemudian 3 isolat
dan kontrol positif tidak mampu menghambat pertumbuhan Staphylococcu
aureus, Dari hasil perhitungan rata-rata diameter zona hambat yang dihasilkan
isolat bakteri endofit lebih besar menghambat pertumbuhan bakteri Gram negatif
Escherichia coli.
4.1.6 Amplifikasi DNA dengan Metode PCR
Hasil Pengamatan pada Amplifikasi DNA dengan Metode
PCRBerdasarkan Gen 16S rRNA dengan Primer 63F dan 1387R sebagai berikut :

Gambar 5.Amplifikasi DNA dengan Metode PCR

 Isolat Akar 3 Marker

1300

Hasil visualisasi dengan elektroforesis pada Gambar 4 terdapat pita DNA

hasil ekstraksi DNA. Pada sampel Akar 3 pita yang terbentuk garis tebal, hal ini
menunjukkan bahwa DNA hasil ekstraksi memiliki konsentrasi DNA yang tinggi
dengan pita tebal dan terang, dan visualisasi pada elektroforesis tampak tebal.
hasil amplifikasi divisualisasikan pada elektroforesis dan dihasilkan pita DNA
yang sejajar dengan marker 1300 bp.PCR yang telah dilakukan, akan dilihat
hasilnya pada elektroforesis. Dari hasil elektroforesis ini maka akan diketahui
maksimal atau tidak proses amplifikasi tersebut. Dilihat dari hasil elektroforesis,
tampak adanya perpindahan DNA dari kutub negatif ke kutub positif. Dan hasil
elektroforesis dari isolat Akar3 tersebut diketahui terdapat pita yang teseparasi
dan sejajar dengan marker sekitar 1.300 bp. Hal ini mengindikasikan bahwa
fragmen gen yang terimplikasi dengan ukuran ± 1.300 bp, sehingga dapat
disimpulkan proses amplifikasi isolat Akar 3 berhasil dilakukan.
4.1.7 Hasil Sekuensing
a. Gambar 6. Elektroforegram, Sekuensing.

b. Gambar 7. Hasil Blast

 c. Penentuan spesies dari hasil blast.
Berdasarkan hasil analisis BLAST yang diperoleh dari sekuens DNA
isolat akar tanaman pepaya, diketahui bahwa isolat akar tanaman pepaya dengan
nilai score 1,1146, query coverage 99%, maximum identity 99,21%, dan
merupakan Spesies: Bacillus cereus strain CCM 2010 16S ribosomal RNA, partial
sequence.
4.2 Pembahasan
Bakteri endofit diisolasi dari tumbuhan akar pepaya melalui sterilisasi
permukaan. Hallman et al (1997) mendefinisikan bakteri endofit adalah bakteri
yang hidup dalam jaringan tanaman yang dapat diisolasi melalui sterilisasi
permukaan jaringan. Purwanto et al. (2014) menyatakan bahwa jalur masuk
bakteri endofit umumnya melalui akar serta bagian tanaman yang terpapar udara
langsung seperti bunga, daun (melalui stomata), dan kotiledon. Zinniel et al.
(2002) menyatakan jumlah bakteri endofit banyak terdapat di akar dan sedikit
pada daun dan batang.

Menurut Bhore dan Sathisha (2010) menyatakan bahwa bakteri endofit

pada satu tanaman inang umumnya terdiri atas beberapa genus dan spesies.
Keragaman bakteri endofit dalam suatu tanaman dipengaruhi oleh kondisi
pertumbuhan tanaman, khususnya kondisi tanah. Pada beberapa kasus, tanaman
dengan jenis atau spesies yang sama memiliki bakteri endofit yang tidak selalu
sama. Pada masa inkubasi, bakteri telah menunjukkan pertumbuhan pada 1x24
jam, namun pada potongan akar pepaya yang ditanam ke media NA diinkubasi
selama 2x24 jam karena untuk memastikan bahwa bakteri yang dihasilkan adalah
bakteri endofit. Hal ini mengacu pada Zinniel et al (2002), yang menyatakan
bahwa waktu pemilihan inkubasi selama minimal 2 hari bertujuan untuk
memastikan bahwa bakteri yang tumbuh merupakan bakteri endofit, bukan bakteri
kontaminan. Selain itu, penambahan nistatin (antifungi) pada media juga
bertujuan untuk mengoptimalkan hasil isolasi (Kumala dan Siswanto 2007).
Penelitan isolasi bakteri endofit ini betujuan untuk melihat bakteri endofit
yang terkandung dalam akar tanaman pepaya. bakteri endofit diisolasi dari akar
tanaman papaya, akar diambil dalam tiga bagian, bagian pertama yaitu akar pada
bagian luar, akar pada bagian tengah dan akar pada bagian dalam. Akar papaya
dipilih karena bakteri endofit banyak terdapat di akar hal ini sesai dengan
pernyataan Hartmann, et al. (2008) berhasil mengamati bahwa mikroorganisme
lebih berlimpah di tanah sekitar akar (rizosfer). Menurut Grayston et al. (1998),
akar tanaman memancarkan banyak senyawa organik yang merangsang
pertumbuhan mikroba rizosfer. Sesuai dengan pernyataan Bacon dan Hinton
(2006) yang menyatakan bahwa jumlah bakteri endofi di dalam tanaman tidak
dapat ditentukan secara pasti, namun bakteri ini dapat dideteksi dengan
mengisolasi pada media agar. Media agar yang digunakan untuk mengisolasi
bakteri endofi pada penelitian ini adalah media nutrient agar (NA). Media ini
merupakan media kaya yang terdiri atas yeast extract, pepton, NaCl dan agar.
Bakteri endofi dapat hidup pada media NA dikarenakan sifat media yang
kompleks dan kemungkinan besar media tersebut memiliki komposisi yang mirip
seperti kondisi di dalam tanaman.
 Bakteri yang dihasillkan kemudian di uji aktivitas antibakterinya dengan
bakteri Staphylococus aureus dan Escherichia coli pada pengujian ini
terbentuknya daerah bening di sekitar koloni isolat bakteri endofi yang diuji
denganEscherichia coli. Menurut Radji (2005), karena perbedaan struktur dinding
sel kedua jenis bakteri tersebut. Dinding sel bakteri Gram positif terdiri atas
beberapa lapisan peptidoglikan yang membentuk struktur yang tebal dan kaku
serta mengandung substansi dinding sel yang disebut asam teikoat, sedangkan
dinding sel bakteri Gram negatif terdiri atas satu atau lebih lapisan peptidoglikan
yang tipis dan membran di bagian luar lapisan peptidoglikan. Karena hanya
mengandung sedikit lapisan peptidoglikan dan tidak mengandung asam teikoat,
maka dinding sel bakteri Gram negatif lebih rentan terhadap guncangan fisik,
seperti pemberian antibiotik atau bahan antibakteri lainnya. Selain itu, perbedaan
struktur dinding sel inilah yang menyebabkan kedua jenis bakteri tersebut
memberikan respon terhadap pewarnaan Gram menunjukkan bakteri simbion
endofit Akar 3 memiliki nilai perhitungan rata-rata diameter zona hambat yang
lebih besar dibanding isolat bakteri endofit Akar 1 dan Akar 2 terhadap bakeri
Escherichia coli. Dan tidak dapat menghambat bakteri staphylococus
aureus.Berdasarkan penggolongan kekuatan daya antibakteri menurut Davis dan
Stout (1971), maka diameter rata-rata daya antibakteri bakteri endofit dari akar
tanaman pepaya terhadap bakteri Escherichia coli yaitu: Akar 1 ( 4.35 mm) , Akar
2 ( 4.4 mm), Akar 3 (4.15 mm) tergolong kategori lemah, dan sebagai kontrol
positif tergolong kategori kuat dengan daya antibakteri dari Amoxsisilin (11,5
mm). Sehingga isolat bakteri endofit Akar 3 dilanjutkan untuk identifikasi
molekuler dengan menggunakan gen 16S rRNA, untuk mengetahui jenis bakteri
tersebut.
Sebelum tahap amplifikasi dilakukan terlebih dahulu dilakukan tahap
Identifikasi isolat Akar 3 secara molekuler dengan gen 16S rRNA yaitu dengan
cara isolat bakteri akar 3 diekstraksi menggunakan Master mix kit (Qiagen). Hasil
ekstraksi DNA diamplifikasi dengan metode PCR menggunakan primer universal
gen 16S rRNA yaitu primer Forward 63F (5’CAGGCCTAACACATGCAAGTC-
3’) dan primer Reserve 1387R (5’- GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’), PCR
yang telah dilakukan, akan dilihat hasilnya pada elektroforesis. Dari hasil
elektroforesis ini maka akan diketahui maksimal atau tidak proses amplifikasi
tersebut. Dilihat dari hasil elektroforesis, Pada sampel Akar 3 pita yang terbentuk
garis tebal, hal ini menunjukkan bahwa DNA hasil ekstraksi memiliki konsentrasi
DNA yang sedang dengan pita tidak terlalu tebal dan tidak terlalu terang. Noer
dan Gustiananda (2007), melaporkan bahwa semakin besar konsentrasi templat
akan semakin terang dan tebal pita DNA yang dihasilkan, namun konsentrasi
templat yang terlalu tinggi juga akan mengakibatkan terbentuknya pita yang
smear, sebaliknya konsentrasi templat terlalu rendah akan menyebabkan
terbentuknya pita yang terlalu tipis untuk dapat dideteksi dengan cara
elektroforesis gel agarosa.
Berdasarkan hasil visualisasi elektroforesis pada Gambar 5 menunjukkan
bahwa primer yang digunakan dapat teramplifikasi sekitar 1300 bp pada sampel
Akar 3. Dari Gambar 5 di atas terlihat bahwa pola pita DNA hasil amplifikasi
PCR yang terbentuk dengan menggunakan primer berupa pita tunggal. Hal ini
menunjukkan DNA sampel Akar 3 yang teramplifikasi memiliki konsentrasi yang
cukup untuk mengindikasikan bahwa pada sampel Akar 3 mengalami amplifikasi
DNA menggunakan primer 63F dan 1387R. Keberhasilan teknik PCR ini didasari
dengan kecocokan primer dengan isolat yang akan digunakan serta optimasi
selama proses PCR. Hal ini sesuai dengan pendapat Aris, et al (2013), yang
menyatakan bahwa Keberhasilan teknik PCR ini lebih didasarkan kepada
kesesuaian primer dan efisiensi dan optimasi proses PCR. Primer yang tidak
spesifik dapat menyebabkan teramplifikasinya daerah lain dalam genom yang
tidak dijadikan sasaran atau sebaliknya tidak ada daerah genom yang
teramplifikasi. Optimasi PCR juga diperlukan untuk menghasilkan karakter yang
diinginkan. Optimasi ini menyangkut suhu annealing DNA dalam mesin PCR.
Isolat Akar 3 teramplifikasi menggunakan primer 63F dan 1387R menunjukkan
pita yang bergpola sedang dan tidak terlalu terang, sampel yang positif
teramplifikasi yang akan dilanjutkan ketahap berikutnya. Tebal atau tipisnya pita
DNA berpengaruh terhadap proses pengurutan nukleotida (sekuensing).
Sekuensing DNA dilakukan untuk memastikan fragmen DNA yang teramplifikasi
pada proses PCR sehingga DNA pengkode 16S rRNA dapat digunakan sebagai
penanda molekuler untuk menentukan genus dan strain bakteri karena molekul ini
ada pada setiap organisme dengan fungsi yang identik pada seluruh organisme.
Terdapat grafik eloktrophoregram yang berwana-warni untuk membedakan jenis
basa nitrogen (nukleotida). Hal ini sesuai dengan pernyataan Miller et al (1990),
yang menyatakan Hasil sekuensing berupa grafi elektrophoregram dengan peak-
peak yang berwarna-warni untuk membedakan jenis basa nitrogen (nukleotida)
yang dicirikannya. Nukleotida A (Adenin) berwarna hijau, nukleotida G (Guanin)
berwarna hitam, C (Citosin) nukleotida berwarna biru dan nukleotida T (Timin)
berwarna merah sedangkan lambang N yang merupakan lambang untuk simbol A,
G, C, dan T yang muncul tidak banyak.
Sekuens yang diperoleh di Bank Gen bertujuan untuk mengkonfirmasi
spesies atau bakteri apa yang memiliki kesamaan dengan urutan DNA sehingga
dapat digunakan untuk identifikasi bakteri. Hal ini dibenarkan oleh Miller et
al.,(1990), yang menyatakan bahwa Analisis hasil BLAST tersebut memberikan
informasi dan memverifikasi mengenai organisme atau bakteri apa yang
mempunyai kesamaan dengan urutan DNA sampel sehingga dapat digunakan
untuk identifikasi bakteri. Informasi dari hasil BLAST tersebut berupa Query
Coverage dan Maximum identity. Sekuen yang diperoleh dari bank gen berupa
Pasangan Basa dalam bentuk FASTA, Sekuen tersebut merupakan akses untuk
menampilkan skala yang menunjukkan tingkat kesamaan sekuens yang
dibandingkan pada BLAST. Setelah memasukkan akses berupa pasangan basa
pada BLAST maka akan tampil hasil sekuen dari isloat.
Setelah sekuens sampel Akar 3 dicocokkan dengan sekuens database pada
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) yang diakses secara online melalui
website NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). maka diperoleh hasil
bahwa isolat Akar yaitu Bacillus cereus strain CCM 2010 16S ribosomal RNA, Di
mana isolat Akar 3 memiliki tingkat kesamaan panjang nukleotida pada database
di BLAST mencapai 99% dan memiliki kecocokan sekuens mencapai 99,21 %
dengan hal ini Bacillus cereus strain CCM 2010 16S ribosomal RNA
menunjukkan bahwa isolat Akar 3 yang merupakan bakteri Bacillus cereus strain
CCM 2010 16S ribosomal RNA. Analisis hasil BLAST tersebut memberikan
informasi dan memverifikasi mengenai organisme atau bakteri apa yang
mempunyai kesamaan dengan urutan DNA sampel sehingga dapat digunakan
untuk identifikasi bakteri. Informasi dari hasil BLAST tersebut berupa Query
Coverage dan Maximum identity. Query coverage adalah persentasi dari panjang
nukleotida yang selaras dengan database yang terdapat pada BLAST. Max
identity adalah nilai tertinggi dari persentasi identitas atau kecocokan antara
sekuen query dengan sekuen database yang tersejajarkan.
Berdasarkan Temuan penelitianini maka ditemukan bakteriBacillus
cereus strain. Bacillus cereus strain adalah bakteri Gram positif dan berbentuk
basil. Bakteri Bacillus cereus merupakan salah satu kelompok besar spesies
Bacillus sp. Bakteri ini termasuk golongan bakteri gram positif, aerob fakultatif,
dan dapat membentuk spora. SporaBacillus cereus strain lebih tahan pada panas
kering daripada panas lembab dan dapat bertahan lama pada produk yang kering
Sifat-sifat dan karakteristik-karakteristik lainnya, termasuk sifat-sifat biokimia,
digunakan untuk membedakan dan menentukan keberadaanBacillus cereus strain
(Novitasari, 2004).
 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 KESIMPULAN
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa:
1. Tiga isolat bakteri endofit yang diisolasi dari Akar tanaman pepaya
mampu menghambat pertumbuhan denganEscherichia coli dengan
katagori lemah dan bersifat resisten dengan Staphylococus aureus.
2. Isolat bakteri yang memiliki indeks penghambatan tertinggi setelah
diidentifikasi secara molekuler menggunakan gen 16S rRNA,
alignment analysis, dan phylogenetic analysis memiliki kesamaan
dengan Bacilluscereus strain.
5.2 SARAN
Perlu dilakukan penelitian lebihlanjut untuk identifikasi dan
purifikasisenyawa bioaktif yang dihasilkan olehbakteri Akar tanaman pepaya,
serta pengujian aktivitasantibakteri dengan menggunakanbakteri uji yang berbeda.
 DAFTAR PUSTAKA

Aris, M., Sukenda, Harris E, dan Sukadi M.F. 2013. Identifikasi Molekular
Bakteri Patogen Dan Desain Primer PCR. Budidaya Perairan. Vol. 1(3) :
43-50.Bacon CW, Hinton DM. 2006. Bacterial endophytes : the endophytic
niche, its occupants, and its utility. Di dalam Gnanamanickam SS,
editor. Plant-Associated Bacteria. Netherland: Springer.
Bhore, S.J., dan Sathisha G. 2010. Screening of Endophytic Colonizing Bacteria
for Cytokinin-Like Compounds: Crude Cell-FreeBroth of Endophytic
Colonizing Bacteria Is Unsuitable in Cucumber Cotyledon Bioassay.
World Journal of Agricultural Sciences. Vol 6 (4). Hal 345-352.
Bhore, S., R. Nithya, & C. Y. Loh. 2010. Screening of endophytic bacteria
isolated from leaves of Sambung Nyawa [Gynura procumbens (Lour.)
Merr] for cytokinin-like campound. Bioinformation 5: 191–197.
Bisht, S. S., & Panda, A. K (2013). DNA sequensing: Methods and applications In
Advancein Biotechnologi (Vol. 9788132215547)
Brown, T. (2006). Gene Cloning and DNA Analysis an Introduction, 5th edition.
Australia: Blackwell Publishing Asia Pty Ltd.
Brown, D.A., dan Rose, J.K., 1992, Sorting of GPI- Anchored Proteins to
Glycolipid- Enriched Membrane Subdomain During Transport to the
Apical Cell Surface. Jurnal of medicine, 68(3): 533-44.
Cappuccino, J and Sherman, N. 1987. Microbiology: A Laboratory Manual. Fourt
Edition. New York: Addison-Wesley Publishing Company. P. 60,
139,186,471.
Chebotar, V. K., N. V. Malfanova, a. V. Shcherbakov, G. a. Ahtemova,a. Y.
Borisov, B. Lugtenberg, and I. a. Tikhonovich. 2015. “Endophytic
Bacteria in Microbial Preparations That Improve Plant Development
(Review).” Applied Biochemistry and Microbiology 51 (3): 271–77.
 doi: 10.1134/S0003683815030059.
Davis, W. W. Dan Stout, T. R. 1971. Disc Plate Methods of Microbiological
Antibiotic Assay. Microbiology. 22(4): 659-665.
Departemen Kesehatan dan Kesejahteraan Sosial RI. 2000. Inventaris Tanaman
Obat Indonesia (I). Jakarta.
Desriani, Kusumawati DE, Rivai A, Hasanah N, Amrinola W, Triratna L, Sukma
A. 2013. Potential endophytic bacteria for increasing paddy var rojolele
productivity. Int. J. on Adv. Sci., Eng. and Information Tech. 3 (1) : 76-78.
Doughari JH, Elmahmood AM, Manzara S. Studies on the
antibacterial activity of roots extracts of Carica papaya L. AJMR. 2007.
Diunduh dari: http://www.academicjournals.org/ajmr.
Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Halaman 53.
Fatchiyah, Arumingtyas, E.L., Widyarti, S., dan Rahayu, S. 2011. Biologi
Molekular:Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Penerbit Erlangga.
Franca, L.T.C., E. Carrilho, and T.B.L. Kist. 2002. A review of DNA sequencin
techniques. Quaterly Reviews of Biophysics 35: 169–200.
Gaffar, S. (2007). Buku Ajar Bioteknologi molekul. Bandung: Jurusan Kimia,
FMIPA UNPAD.
Hallmann, J., Quadt- Hallmann, Q. A., Mahaffee, W. F., and Kloepper, J. W.
1997. Bacterial endophytes in agricultural crops. Can J Microbiol.
43:895–914.
Huang, W.,Y., Cai, Y., Z., Hyde, K.,D.,Corke, H., Sun M., 2008. Biodiversity of
endophytic fungi associated with 29 tradisional Chinese medicinal plants,
Fungal Diversity, 36: 61-75.
Hurek, B. R. & T. Hurek. 2011. Living inside plants: Bacterial Endophytes.
Current Opinion in Plant Pathology 14: 435–443.
Husnaeni A. 2008. Variasi genetik jati pada hutan tanaman di Jawa berdasarkan
penanda RAPD (Random Ampliflied Polymorphic DNA) [skripsi]. Bogor:
Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan. Institut Pertanian Bogor.
Jawezt, E., Melnick., Adelberg’s., Brooks, G. F., Carrol, K. C., Butel, J. S.,
Morse, S. A., Mietzner, T. A. 2013. Medical Microbiology 26th Editon.
New York :McGraw-Hill Companies, Inc.
Jawetz, M., & Adelberg's. (2005). Mikrobiologi Kedokteran (23 ed.). (H.
Hartanto, Trans.) Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran ECG
Jawetz, M. (2010). Microbiologi Kedokteran (23rd ed.). Penerbit Buku
Kedokteran: EGC.
Kattar, M.M., Chavez, J.F., Limaye, A.P., Rassoulian-Barrett, S.L.,
Carlson,
L.C. 2000. Application of 16S rRNA gene sequencing to identify
Bordetella hinzii astheCausative Agent of Fatal Septicemia. Journal of
ClinicalMicrobiol. 38: 789-794.
Klug, W.S., dan Cummings, M.R., 1994, Concepts of Genetics 4th Edition,
Prentice hall, Englewood Cliffs.
Kumala S, Siswanto EB. 2007. Isolation and Screening of Endophytic Microbes
from Morinda citrifolia and their Ability to Produce Anti-Microbial
Substances. Microbiol. Indones. 1 (3) : 145-148
Kusumawati DE, Fachriyan HP, Maria B. 2014.Aktivitas antibakteri isolate
bakteri endofit dari tanaman miana (Coleus scutellariodes L. Benth.)
terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Journal Current
Biochemistry. 1(1): 45-50.
Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Raja Grafindo
Persada.
Mayangsari, Y. 2012. Elektrophoresis. Departement of Food and Agricultural
Products Processing Technology Faculty of Agricultural technology
Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Miller, G.A., Baeckwith R, Fellbaum C, Gross D dan Miller K. 1990.
IntroductionTo Wordnet: An On-Line Lexical Database. International
Journal ofLexicography. Vol. 3: 235-312.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda.
Bogor.
Noer, A.S dan M. Gustiananda. 2007. PCR Tanpa Isolasi DNA dari Sel Epitel
Rongga Mulut. JMS. Vol. 2(1): 35-45.
Noverita, Fitria, D., Sinaga, E. 2009. Isolasi dan Uji Aktivitas Antibakteri Jamur
Endofit dari Daun dan Rimpang Zingiber ottensii Val. Jurnal Farmasi
Indonesia. 4(4): 171-176.
Novitasari, Vetty. 2014. Uji Ekstrak Minyak Atsiri Lada Putih (Piper nigrum linn)
Sebagai Antibakteri. Skripsi. Universitas Bengkulu.
Olsvik, O., J. Whalberg, B. Petterson, M. Uhlen, T. Popovic, I.K. Wachmuth, and
P.I. Fields. 1993. Use of automated sequencing of polymerase chain
reaction-generated amplicons to indentify three types of cholera toxin
subunit B in Vibrio cholerae O1 strains. Journal of Clinical Microbiology
31: 22–25.
Pelezar, M. J. Dan Chan, E. S. C. 1984. Dasar-Dasar Mikrobiologi Edisi I. UI-
press, Jakarta.
Pratiwi, ST. 2008. Mikrobiology Farmasi. Yogyakarta: Penerbit Erlangga
Prihatiningtiyas, W. & M. S. H. Wahyuningsih. (2011). Prospek Mikroba
Endofit Sebagai Sumber Senyawa Bioaktif.
Artikel.http://mot.farmasi.ugm.ac.id/artikel-55-prospek-mikroba-
endofitsebagaisumber-senyawa-bioaktif. html.
Radji, M., 2005. Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit Dalam
Pengembangan Obat Herbal, Majalah Ilmu Kefarmasian, 2(3):113-126.
Radji, M. 2010. Buku Ajar Mikrobiologi. Jakarta : Buku Kedokteran
Rahayu D. A. Dan Nugroho, E. D. 2015. Biologi Molekuler dalam Perspektif
Konservasi. Plataxia, Yogyakarta.
Retnowati, Y,. Bialangi, N., & Posangi, N. W. (2011). Pertumbuhan Bakteri
Staphylococcus aureus pada media yang diekspos dengan Infus Daun
Sambiloto (Andrographis paniculata). Saintek, 6 (2) : 397-405).
Sanger, F., S. Nicklen, and A.R. Coulson. 1997. DNA sequencing with chain-
terminating inhibitors. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467.
doi:10.1073/pnas.74.12.5463s
Singleton, P. P., S. (1981). Introduction to Bacteria (J. W. & S. Ltd, ed.). New
York.
Simarmata R, Lekatompessy S, Sukiman H. 2007. Isolasi mikroba endofitik
dari tanaman obat sambung nyawa (Gymura procumbens) dan
analisis potensinya sebagai antimikroba. Berk Penel Hayati 13 : 85-90.
Siregar IZ, Yunanto T, Pamoengkas P. 2008. Implikasi genetik metode pembiakan
tanaman Shorea joharensis Foxw pada sistem silvikultur Tebang Pilih
Tanam Jalur (TPTJ). Jurnal Biodiversitas 9 (4): 250─254.
Son R & Cheah YK. 2002. Preliminary Screening of Endophytic Fungi from
Medical Plants in Malaysia for Antimicrobial and Antitumor Activity.
Malaysian Journal of Medical Sciences 9(2): 23–33
Stackebrandt, E.dan Goebel, B. 1995. A place for DNA-DNA reassociation
and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in
bacteriology. International Journal of Systematic Bacteriology. 44:
846-849.
Strobel GA., and B. Daisy (2003), Bioprospecting for Microbial Endophytes and
Their Natural Products. Microbiol. and Mol. Biology Rev. 67(4):491-502.
Susilowati, D.N., N. Hidayatun, Tasliah, & K. Muiya. (2010). Keragaman Bakteri
Endofitik Diisolasi dari empat Varietas Padi dengan Metode ARDRA.
Berita Biologi.10 (2): 241-248.
Sulistyaningsih,Erma. 2007. Polymerase Chain Reaction (PCR): Era Baru
Diagnosis dan Manajemen Penyakit Infeksi. Biomedis, Vol. 1.
Tan, R.X., Zou, W.X., 2001. Endophytes: arich source of functional metabolites,
Nat. Prod. Rep., 18:448-459.
Tan, RX and WX Zou., (2001) Endophytes : a rich source of functional
metabolites. Nat Prod. Rep. 18 : 448-459.
Purwanto UMS, Fachriyan HP, Maria B. 2014. Isolasi Bakteri endofit dari
tanaman sirih hijau (Piper betle L.) dan potensinya sebagai penghasil
senyawa antibakteri. Journal Current Biochemistry. 1(1): 51-57
Wesley A. Volk, M. F. W. (1993). Microbiology Dasar (Soenarto Adisoemarto,
ed.). Jakarta: Erlangga.
Whitman, K.A and MacNair, N.G. 2010. Finfish and Shellfish Bacteriology
Manual: Techniques and Procedures. (Online).
http://books.google.co.id/books?id
 =hlk04vjlam0C&printsec=frontcoer&dg=Finfish+and+Shellfish+Bacteriol
ogy+Manual:+Techniques+and+Procedures&hl=id&ei=5_zsTYvpK4_2tg
P4ulngDQ&sa=X&oi= book_result&ct=result&resnum=1& ved=0CCcQ6
AEwAA#v=onepage&q&f=false. [Diakses 18 Maret 2018. Pukul
09.01WITA]
Wijayakusuma, H., Dalimartha, S. 2000. Ramuan Tradisional Untuk
Pengobatan Darah Tinggi. Cetakan VI. Jakarta: Penerbit Penebar
Swadaya
Zinniel DK et al. 2002. Isolation and characterization of endophytic colonizing
bacteria from agronomic crops and prairie plant. Appl. Environ.
Microbiol. 68 (5) : 2198–2208.
Zinnieal, D.K., P. Lambrech., N.B. Harris., Z. Feng., D. Kuczmarsi., P. Higley.,
C.A. Ishimaru., A. Arunakumari., R. G. Barletta and A. K. Vidaver. 2002.
Isolation And Characterization of Endophytic Colonizing Bacteri from
Agronoric Cropss and Primitive Plants. Appliedand Environmental
Microbiology.
Zuhriana K. Yusuf. 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek Vol 5,
No 6, Tahun 2010.