PRODUKSI ASIATIKOSIDA DAN SENYAWA SEKERABAT DENGAN KULTUR SUSPENSI

SEL Centella asiatica (L.) URBAN

ASIATICOSIDE AND ITS DERIVATIVE PRODUCTION BY CELL SUSPENSION CULTURES

OF Centella asiatica (L.) URBAN

C.J.Soegihardjo dan Koensoemardiyah

Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi UGM,
Yogyakarta

ABSTRAK
Tanaman Centella asiatica (L.) Urban atau lebih dikenal dengan nama pegagan mempunyai banyak
kegunaan, misalnya sebagai anti radang, diuretika, mempercepat penyembuhan luka, antihipertensi, tonikum,
memperlancar peredaran darah perifer (otak), obat penyakit lepra, tbc, dan jerawat; bahkan di Cina dipercaya dapat
memanjangkan umur (longefity) dan digunakan sebagai obat geriatrik. Di samping sebagai obat tradisional, ekstrak
herba pegagan yang terstandar (Titrated Extract of Centella asiatica = TECA ) diimpor dari Perancis dan digunakan
sebagai obat modern dengan nama Madecassol® dalam bentuk tablet, krim, dan serbuk tabur; dengan indikasi
mempercepat menyembuhan luka dan mencegah timbulnya keloid.
Penelitian ini dilakukan untuk menetapkan produksi asiatikosida dan senayawa sekerabat melalui kultur
suspensi sel C. asiatica. Penelitian terdiri dari tiga tahapan, yaitu penumbuhan kalus dan subkultur kalus, budidaya
suspensi sel, dan produksi asiatikosida dan senyawa sekerabat dengan sistem sekali unduh (batch cultures). Pada tahap
produksi metabolit sekunder dilakukan manipulasi media RT (Revised Tobacco Medium), yaitu manipulasi kadar
nitrogen (sebagai kalium nitrat dan ammonium nitrat), kadar fosfat (sebagai kalium dihidrogenfosfat), kadar sumber
karbon (sebagai sukrosa); serta dilakukan elisitasi dengan menggunakan ekstrak khamir (yeast extract) dan
penambahan prazat (precursor) dengan menggunakan kolesterol.
Hasil penelitian ternyata produksi asiatikosida meningkat hampir dua kali lipat dalam media RT dengan
kadar nitrogen dan sukrosa masing-masing sebesar 150%. Produksi asiatikosida meningkat tajam pada media RT
dengan penambahan ekstrak khamir (0,2%), yaitu sekitar tiga kali lipat dari media RT normal, sedangkan penambahan
prazat kolesterol 12,5 mg% menunjukkan produksi asam madekasat tertinggi.

Kata kunci: Produksi metabolit sekunder, kultur suspensi sel, Centella asiatica, manipulasi media

ABSTRACT
Pennywort herbs (C. asiatica (L.) Urban component which is often used in traditional treatment, especially as
antiinflamation, diuretics, tonic, antihypertension, periphery vasodilatation, drug for leprosy, tuberculosis, faster wound
healing, and acne healing; even in China is believed that herbs can promotes longevity. Beside for traditional medicine,
namely Madecassol® which is consist Titrated Extract of Centella asiatica have been imported from France and used
modern treatment for preventing khelloid forming and quickening wound healing in dosage form as tablet, cream, and
spread powder. The extract contains asiaticosida, asiatic acid, and madecassic acid.
The study was conducted to evaluate asiaticoside and its derivative production by cell suspension cultures of
C. asiatica. In the investigation were performed in three steps, that are callus initiation and subcultures, cell suspension
initiation and subcultures, and transferring biomass to manipulated production media with variation nitrogen,
phosphate, and sucrose concentration; elicitation (with yeast extract) and precursor (with cholesterol) for enhancing
metabolite secondary production.
The highest asiaticoside production were reached by biomass cultured in RT medium enriched with 0.2%
yeast extract and highest madecassic acid production were reached in RT medium enriched with 12.5 mg% cholesterol.
Biomass were cultured in manipulated media, the highest yield of asiaticoside was reached in 150% nitrogen, 100%
phosphate, and 150% sucrose.

Keywords: Secondary metabolites production, cell suspension culture, Centella asiatica, media manipulation

PENDAHULUAN
Dalam rangka memproduksi metabolit
sekunder dengan teknik kultur jaringan
tanaman, ternyata suspensi sel merupakan
teknik alternatif produksi yang dapat
ditingkatkan menjadi skala industri, karena
memiliki kemiripan dengan kultur sel
mikrobia dalam produksi antibiotika atau
bahan kimia lain. Walaupun demikian, sistem
kultur suspensi sel sering menghadapi banyak
masalah, utamanya yang menyangkut
“dinamika sel”, yaitu bahwa sel yang berada
dalam perubahan bentuk maupun lingkungan
akan mengakibatkan biosintesis metabolit
sekunder akan meningkat atau menurun
(Staba,1980). Kini di Jepang metode kultur
suspensi sel telah digunakan dengan berhasil
dalam memproduksi sikonin dari kultur
suspensi sel Lithospermum erythrorhizon
secara komersial.
Herba pegagan (C. asiatica) dipilih
sebagai bahan utama karena termasuk salah
satu tanaman unggulan menurut Badan POM.
Di samping itu, herba pegagan sering dijumpai
dalam ramuan jamu, serta memiliki prospek
yang menjanjikan dalam upaya memelihara
kesehatan, utamanya pada lansia. Tumbuhan
ini sampai sekarang jarang dibudidaya
(Anonim,1977) dan pengumpulan yang
berlebihan akan mengakibatkan tumbuhan ini
terancam kelangkaan (Agil, dkk.,1992).
Kandungan kimia herba pegagan
antara lain glikosida triterpenoid, utamanya
asiatikosida dan asam asiatikat
(Anonim,1977). Menurut Chassaud (1971)
Gambar 1. Tanaman pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) var. Mayor
dan Perry (1980), herba pegagan mengandung
asiatikosida, madekasosida, asam asiatikat,
asam madekasat, brahmosida, takunosida,
isotakunosida; tiga senyawa yang disebut
terakhir ini belum sepenuhnya diketahui
strukturnya. Di samping itu, juga dilaporkan
pegagan mengandung alkaloid hidrokotilina
(Sastrapraja,1978; Suhartatik,1989).
Kegunaan herba pegagan antara lain,
daunnya sangat baik untuk menyembuhkan
luka kecil, sebagai peluruh air kemih yang
lembut, peluruh keringat pada penderita
keracunan jengkol, juga dapat sebagai peluruh
demam, peluruh getah empedu, wasir,
keputihan, batu ginjal, sariawan, dan
sebagainya (Perry,1980). Dilaporkan oleh
Suwono dkk. (1992), bahwa infusa herba
pegagan mempunyai efek antihipertensi pada
anjing. Melihat kenyataan tersebut, dipandang
bahwa kandungan kimia dalam herba pegagan
sangat potensial digunakan sebagai obat.
Menurut Adirukmi dan Saleh (1994)
tumbuhan pegagan di Malaysia ada lima
varietas, termasuk dua varietas yang tumbuh
di Jawa, yaitu varitas minor dan mayor.
Dilaporkan pula, terdapat pula daun dan
taruknya bewarna ungu. Dalam penelitian ini
dipilih tumbuhan pegagan varitas mayor
(Gambar 1).
Analisis kualitatif KLT ekstrak herba
pegagan pernah dilaporkan oleh Pramono
(1992), sedangkan analisis kuantitatifnya
hingga kini belum pernah dilaporkan.
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui
produksi asiatikosida dan senyawa sekerabat
dengan teknik kultur suspensi sel C. asiatica
Bahan
Bahan tumbuhan berupa daun C. asiatica
(fam. Apiaceae atau Umbelliferae)
dikumpulkan dari daerah Sleman dan Salatiga.
Tumbuhan tersebut ditanam di pot dalam
rumah kaca dan setiap dua hari disiram air.
Bahan kimia yang digunakan berderajat p.a
BDH (Poole, Inggris) atau E.Merck (Jerman),
berkualitas “Analar” atau “pro analysis”,
kecuali disebut lain. Bahan kimia untuk media
MS (Murashige&Skoog) dan media RT
(Revised Tobacco), asam 2,4-
diklorofenoksiasetat (2,4-D), kinetin, Yeast
extract (E.Merck), colesterol (Sigma), etanol
95% (PG. Madukismo, Jogjakarta), Bayclin®
(PT. Bayer-Indonesia), Tween-20; bahan
untuk analisis: Silikagel GF254 , asam klorida
pekat, n-butanol, petroleum eter, eter,
etilasetat, kloroform, isopropanol, metanol,
timbal (II) asetat, dinatrium fosfat, natrium
sulfat anhidrat, asam asetat glasial, asam sulfat
pekat, asam ftalat, dan anilina. Kertas
aluminium (“Reynold”, AS), plastik “cling
warp” (“Four roses”, Indonesia), dan air
dwisuling.
Alat.
Almari “laminar air flow cabinet” (LAF
buatan Indonesia), penggojog berpusing
(orbital shaker) dengan dua platform (buatan
Fakultas Biologi UGM), otoklaf (Sakura,
Jepang), almari pengering (Memmert,
Perancis), almari pendingin (Hitachi,
Indonesia), rak dalam ruang inkubator yang
dilengkapi dengan pencahayaan dan AC. Alat
untuk analisis: seperangkat alat klt , “TLC
Scanner” (Shimadzu, model CS-930, Jepang),
lampu ultraviolet 254 dan 366 nm (Shimadzu,
Jepang), semprit mikro (Hamilton) 10µl.
Jalan Penelitian
Pemilihan dan pembuatan media
Media yang ditapis adalah media MS,
RT, MSK, dan RTK dengan komposisi
terlampir yang ditambah (K), yaitu dengan air
kelapa 10%. Untuk mencari media terbaik
untuk penumbuhan kalus dilakukan
penambahan zat pengatur tumbuh, yaitu
kombinasi 2,4-D dan kinetin dengan kadar 0,
1, 2, dan 5 ppm sehingga diperoleh 16
kombinasi, jadi semuanya menjadi 64 macam
media. Setelah diperoleh media yang cocok
untuk kultur kalus, kemudian dibuat pula
media cair dengan komposisi yang tanpa
penambahan agar dan kadar zat pengatur
tumbuh sepersepuluhnya untuk kultur suspensi
sel.
Dalam upaya meningkatkan
biosintesis metabolit sekunder dibuat media
cair yang dimanipulasi, yaitu kadar sumber
nitrogen, sukrosa, dan fosfat masing-masing
(50,100, 150, dan 200%); elisitasi dengan
ekstrak khamir (Yeast extract, E. Merck)
0,2%; penambahan prazat dengan kolesterol
(12,5, 25, 50, dan 100mg%).
Inisiasi kalus dan subkultur
Sebagai bahan eksplan digunakan
daun C. asiatica, yaitu helaian daun dan
tangkai daun (stipula). Daun beserta
tangkainya diambil yang telah dewasa. Daun
dicuci dengan air mengalir selama 30 menit,
setelah itu disteril dalam larutan Bayclin® (1:4)
yang ditambah Tween-20 sebanyak dua tetes
selama 10 - 15 menit sambil digoyang.
Selanjutnya, pengerjaan secara aseptis dalam
LAF, yaitu membilas sebanyak tiga kali
berturut-turut selama 3, 5, dan 15 menit.
Tangkai daun dipotong-potong sepanjang 1
cm sebagai eksplan, lalu ditanam pada media
padat (media pertumbuhan) pada posisi
horizontal atau vertical. Selanjutnya, eksplan
pada media diinkubasi dalam ruang inkubasi
pada suhu (25±3)° C dengan periode
pencahayaan lunak 16 jam terang (lampu TL
40 wat jarak 50 cm dari dasar rak) dan 8 jam
gelap. Subkultur dilakukan setelah kalus
berumur 4-5 minggu, dengan memindahkan
kalus pada media segar secara aseptis dalam
wadah yang lebih besar.
Inisiasi, kultur, dan subkultur suspensi sel
Setelah diperoleh kalus yang cukup
dan kalus menjadi meremah (friable), kalus ini
digunakan sebagai bahan awal dalam inisiasi
kultur suspensi sel. Sebanyak 2-3 g kalus
dipindahkan dalam media cair yang cocok
sebanyak 20 ml dalam labu Erlenmeyer 100
ml. Pengerjaan ini dilakukan dalam LAF.
Selanjutnya, media cair dan kalus digojog
pada penggojog berpusing dengan kecepatan
100 rpm dalam ruang inkubasi, dengan suhu
dan pencahayaan yang sama dengan pada
kultur kalus. Setelah biomasa berumur 10 - 14
hari dilakukan subkultur.
Penanaman dalam media produksi dan
pemanenan biomasa
Biomasa hasil kultur suspensi sel,
sejumlah sekitar 5 g bobot segar dipindahkan
dalam media cair yang dimanipulasi, sebanyak
60 ml dalam labu Erlenmeyer 300 ml.
Perlakuan waktu diinkubasi sama dengan
perlakuan pada waktu kultur suspensi sel.
Pemanenan biomasa dalam media produksi
dilakukan setelah berumur tiga minggu.
Biomasa segar, yang dipisahkan dari media
cair dengan menyaring dengan kertas saring
yang ditara, kemudian ditimbang maka
diperoleh bobot segar (fresh weight),
kemudian biomasa segar dikeringkan dalam
almari pengering pada suhu 40-60° C sampai
berat tetap, maka diperoleh bobot kering (dry
weight).
Analisis kualitatif dan kuantitatif
asiatikosida dan senyawa sekerabat
Eksraksi glikosida triterpenoid.
Sebanyak 500,0 mg simplisia dan biomasa
kering dimaserasi tiga kali 24 jam dengan
metanol 70%. Disaring, hasil penyaringan
dicampur, lalu dipekatkan. Ekstrak berair ini
dipucatkan dengan norit dipanaskan, disaring
panas. Filtrat didinginkan, diawalemakkan
dengan petroleum eter dengan menggunakan
corong pisah, sampai lapisan petroleum eter
hampir tak berwarna. Lapisan berair dipartisi
dengan etilasetat, sampai lapisan etilasetat
hampir tak berwarna. Lapisan berair dipartisi
dengan n-butanol sampai lapisan n-butanol
hampir tak berwarna. Sari n-butanol dicampur
diuapkan sampai kering, lalu dilarutkan dalam
metanol sebanyak 1 ml. Untuk ekstraksi
biomasa, tahap penghilangan pigmen tidak
dikerjakan, karena biomasa tidak mengandung
pigmen.
Analisis kualitatif triterpenoid secara
KLT. Sistem KLT yang digunakan adalah
sebagai berikut. Fase diam yang digunakan
adalah silikagel GF254 dan fase gerak adalah
n-butanol-asam asetat glacial-air (3:1:1,v/v).
Sebagai pembanding digunakan TECA
(Titrated Extract Centella asiatica) (PT.Corsa
Pharmaceutical Industries, Jakarta yang
diimpor dari Syntex Lab.,Perancis) yang
mengandung asiatikosida 41,4%, serta asam
asiatikat dan asam madekasat sebanyak
58,5%. Untuk deteksi bercak digunakan
pereaksi semprot asam sulfat 5% dalam
metanol; dipanaskan pada suhu 110° C selama
10 menit.
Analisis kuantitatif triterpenoid secara
spektrodensitometri in situ. Pembuatan kurva
baku asiatikosida dan asam madekasat
dilakukan dengan menimbang 20,0 mg TECA
dilarutkan ke dalam metanol sebanyak 10,0 ml
dalam labu takar. Larutan induk ini dipipet
sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 7,0; dan 10,0 µl,
masing-masing ditotolkan pada lempeng.
Selanjutnya dikembangkan dengan fase gerak
n-butanol-asam asetat glasial-air (3:1:1,v/v)
sampai jarak rambat sepanjang 12 cm. Deteksi
dengan asam sulfat 5% dalam metanol,
dipanaskan pada suhu 110° C selama 10
menit. Bercak yang terjadi diukur
intensitasnya pada panjang gelombang 605 nm
dengan “TLC Scanner”. Kurva baku dibuat
dengan menghitung kadar asiatikosida dengan
intensitas. Selanjutnya, dilakukan penetapan
kadar asiatikosida dalam biomasa hasil
pemanenan dari kultur suspensi sel dalam
media produksi.
Pembuktian senyawa asiatikosida dan
madekasoida
Hidrolisis asiatikosida dan
madekasoida dilakukan menurut Mabry et al.
(1970) sebagai berikut. Sejumlah isolate dan
TECA (10 mg) dilarutkan air sampai 10 ml.
Larutan dipipet 5 ml dan dimasukkan ke
dalam tabung reaksi yang dilengkapi dengan
“cold finger”, lalu ditambah asam klorida 6%
sebanyak 5 ml. Selanjutnya, campuran
direfluks di tangas air selama 60 menit.
Setelah dingin, difraksinasi dengan eter
sebanyak tiga kali 5 ml. Fraksi eter dicampur,
lalu dibebaskan dari tapak-tapak air dengan
natrium sulfat anhidrat. Eter diuapkan sampai
kering lalu ditambah kloroform sebanyak 0,5
ml (larutan aglikon, yaitu asam asiatikat dan
asam madekasat).
Pemeriksaan asam asiatikat dilakukan
dengan KLT dengan fase diam silikagel GF254
dan fase gerak kloroform-metanol-air
(13:7:2,v/v), sedangkan deteksi dengan
pereaksi semprot asam sulfat 5% dalam
metanol. Bercak yang terbentuk dibandingkan
dengan TECA asli dan hasil hidrolisis TECA
yang ditotolkan dalam satu lempeng (yang
terdiri dari asiatikosida dan asam asiatikat).
Pemeriksaan gula dilakukan dengan
menetralkan fraksi air pada proses hidrolisis
dengan natrium bikarbonat, lalu dipekatkan.
Hasil pemekatan ditotolkan pada lempeng
selulosa sebagai fase diam dan campuran etil
asetat-piridina-air (12:5:4,v/v) sebagai fase
gerak. Sebagai pembanding digunakan
glukosa, fruktosa, dan ramnosa. Setelah
dilakukan pengembangan, dikeringkan, lalu
disemprot dengan pereaksi semprot aniline-
ftalat (terdiri dari 1,66 g asam ftalat, 0,9 ml
aniline, dilarutkan ke dalam n-butanol yang
jenuh air sampai 100 ml) lalu dipanaskan 80 -
130° C selama 20-30 menit (Jork et al.,1989).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemilihan eksplan dan media yang
cocok untuk penumbuhan kalus adalah sebagai
berikut. Pada media MS, MSK, RT, dan RTK
dengan eksplan daun dan tangkai daun,
ternyata media yang terbaik untuk
penumbuhan kalus adalah media RTK dengan
tambahan 2,4-D (1 ppm) dan kinetin (2 ppm),
dengan eksplan tangkai daun. Jadi penggunaan
helaian daun sebagai eksplan kurang
memuaskan karena pertumbuhan kalus sangat
lambat. Kalus yang dihasilkan bewarna krem
tua, setelah tiga kali subkultur kalus tersebut
cukup meremah. Kalus tersebut digunakan
sebagai bahan awal untuk membuat kultur
suspensi sel.
Pada kultur suspensi sel dilakukan
dengan penaburan kalus ke dalam media RTK
cair dengan penambahan 2,4-D (0,1 ppm) dan
kinetin (0,2 ppm), selanjutnya disebut media
RTKP dan digojog dengan kecepatan 100 rpm.
Ternyata kalus sukar meremah
semuanya,sehingga masih ada kalus yang
tertinggal. Berdasarkan Williams et al. (1988),
dilakukan penghancuran kalus dengan cara
kalus yang masih tertinggal digilas hati-hati
dengan batang pengaduk di atas kasa 60 mesh
(penyaring biomasa dari Sigma, AS), sel-sel
yang lolos diterima ke dalam media RTK cair
tersebut. Pekerjaan ini dilakukan secara
aseptis dalam LAF.
Hasil pemanenan biomasa dalam berbagai
media produksi dengan berbagai variasi kadar
sumber nitrogen, fosfat, dan karbon (Tabel I),
sedangkan hasil pemanenan biomasa dalam
media RTKP dengan elisitasi dan penambahan
prazat (Tabel II).

Tabel I. Hasil bobot segar dan bobot kering biomasa dari kultur suspensi sel dalam media produksi

Kadar Bobot segar * Bobot kering *

sumber nitrogen (mg/360 ml) (mg/360 ml)
50 9100 870
100 11420 1210
150 9630 980
200 8450 920
Kadar Bobot segar Bobot kering
Sumber fosfat (mg/360 ml) (mg/360 ml)
50 7200 760
100 10530 1160
150 11070 1180
200 11250 1290
Kadar Bobot segar Bobot kering
Sumber karbon (mg/360 ml) (mg/360 ml)
50 8230 790
100 9280 900
150 8740 730
200 6350 680
Keterangan: * Hasil biomasa dari 6 wadah suspensi sel @ 60 ml dijadikan satu
Tabel II. Hasil bobot segar dan bobot kering biomasa dari kultur suspensi sel dalam media produksi (360 ml)
dengan elisitor dan prazat
 Elisitasi dengan ekstrak Bobot segar** Bobot kering**
khamir (mg/360 ml) (mg/360 ml)
200 mg% 8720 790
Penambahan prazat Bobot segar Bobot kering
Kolesterol (mg%) (mg/360 ml) (mg/360 ml)
12,5 7230 730
25 6950 710
50 6730 720
100 6080 670

D N1 N2 N3 N4 P1 P2 P3 P4 S1 S2 S3 S4 E Z1 Z2 Z3 Z4 CAS

Gambar 2. Kromatogram lapis tipis senyawa triterpenoid dalam biomasa

Keterangan: D. isolat daun
T. isolat tangkai daun
K. isolat kalus
CAS. TECA
Z. penambahan prazat (kolesterol)
N. variasi kadar sumber nitrogen
P. variasi kadar sumber fosfat
S. variasi kadar sukrosa
E. elisitasi dengan ekstrak khamir

Hasil analisis kualitatif asiatikosida dan
senyawa sekerabat terlihat dalam
kromatogram lapis (Gambar 2).
Kromatogram lapis tipis TECA ada tiga
bercak, yaitu asiatikosida (Rf = 0,46), asam
asiatikat (Rf = 0,50) , dan asam madekasat
(Rf = 0,82). Kromatogram untuk biomasa
dari media produksi ternyata terdiri dari
lebih enam bercak, tiga bercak diantaranya
merupakan asiatikosida, asam asiatikat, dan
asam madekasat.
Hasil KLT yang diperoleh dari
berbagai cuplikan ditetapkan kadar senyawa
terpilih secara spektrodensitometri in-situ.
Hasil analisis kuantitatif asiatikosida dan
asam madekasat dalam biomasa. Hasil
pembuatan kurva baku asiatikosida
berdasarkan densitogram diperoleh
persamaan garis: Y=2194,7 X + 8097,0 (Y=
luas daerah di bawah kurva; X= kadar
asiatikosida dalam µg) (Gambar 3). Untuk
kurva baku asam madekasat diperoleh
persamaan garis: Y=4142,6 X + 12581
(Gambar 4). Untuk kadar asiatikosida dan
asam madekasat dalam biomasa kering
(Tabel III dan Tabel IV) diperoleh dari
perhitungan berdasarkan kurva baku dan
densitogram (Gambar 5).
 Gambar 3. Kromatogram lapis tipis berbagai ekstrak C. asiatica
Keterangan:
D = daun; T= tangkai daun K = kalus
N = kss (kultur suspensi sel) manipulasi sumber nitrogen
P = kss manipulasi sumber fosfat
S = kss manipulasi sumber sukrosa
E = kss ditambah ekstrak khamir
Z = kss ditambah kolesterol
CAS = TECA (Titrated Extract of Centella asiatica)

Gambar 4 . Densitogram bercak asiatikosida dari kultur suspensi sel C. asiatica dengan berbagai kadar komponen
makronutrien serta perlakuan
Keterangan: Urutan nomor sesuai dengan Gambar 3.
 Pada manipulasi nutrient, produksi
asiatikosida dalam kultur suspensi sel (kss)
hasil perlakuan dengan manipulasi kadar
sumber nitrogen, ternyata pada kadar 50 dan
150% kadarnya lebih tinggi dari pada normal
(100%). Untuk perlakuan lain, yaitu
manipulasi kadar fosfat ternyata kadar
asiatikosida lebih rendah dari pada kadar
normal, sedangkan perlakuan dengan
manipulasi kadar sukrosa pada kadar 150 dan
200%, produksi asiatikosida sedikit meningkat
dibandingkan dengan normal.
Pada perlakuan dengan penambahan prazat
(kolesterol), pada kadar 12,5 mg% ternyata
produksi asiatikosida lebih rendah dari pada
normal. Hal ini terjadi kemungkinan ternyata
kolesterol bukan prazat dalam biosintesis
triterpenoid.
Gambar 5. Densitogram asam madekasat dari kultur suspensi sel Centella asiatica dengan berbagai kadar komponen
Keterangan: Urutan nomor puncak sesuai dengan Gambar 3.
Dari hasil percobaan dapat ditarik
kesimpulan sementara, yaitu bahwa
manipulasi secara individual atau hanya satu
komponen dalam media saja dapat
menghasilkan hal-hal di luar prediksi. Jadi
perlu pendalaman segi biosintesis metabolit
sekunder memang harus menjadi
pengetahuan dasar dalam upaya
meningkatkan produksi metabolit sekunder.
Pemberian prazat berupa larutan
atau suspensi kolesterol tidak begitu
menguntungkan, karena kelarutan dalam
Tabel III. Kadar asiatikosida dalam biomasa kering dalam berbagai media perlakuan
Kadar Sumber nitrogen (%) Luas Daerah Di bawah Kurva (LDDK)
Pada elisitasi, yaitu dengan
penambahan ekstrak khamir (yeast extract),
menunjukkan produksi asiatikosida berlipat
hingga lebih dari tiga kali lipat.
Pola untuk produksi asam madekasat,
setiap jenis perlakuan menunjukkan hal yang
berbeda. Pada perlakuan manipulasi sumber
nitrogen, ternyata kadarnya lebih tinggi pada
setiap perlakuan. Pada manipulasi sumber
fosfat, ternyata hanya kadar 200% saja yang
meningkatkan produksinya, sedangkan pada
manipulasi sumber karbon, ternyata hanya
kadar 150% yang sedikit meningkatkan
produksinya.
Pada elisitasi tidak meningkatkan
produksi asam madekasat, sedangkan dengan
pemberian prazat (kolesterol 12,5%),
produksinya meningkat hampir tiga lipat.
media berair sangat terbatas. Dari hasil
percobaan ternyata kadar 12,5% merupakan
kadar yang optimal dalam penelitian ini.
Manipulasi kadar sumber nitrogen ternyata
cukup baik untuk meningkatkan produksi
metabolit sekunder, baik pada kadar di
bawah normal maupun di atas normal akan
meningkatkan produksi metabolit sekunder.
Hal ini diduga terjadi stres terhadap sel
tanaman, karena nitrogen merupakan nutrisi
yang penting bagi tumbuhan.
Kadar asiatikosida
 (µg/g bobot kering)
50 (N1) 46076,63 2167,8
100 (N2) 31738,93 1459,5
150 (N3) 49845,75 2354,0
200 (N4) 30331,5 1390,0
Kadar Sumber fosfat (%)
50 (P1) 37067,08 1722,7
100 (P2) 39562,09 1846,0
150 (P3) 21693,1 963,2
200 (P4) 35730 1656,7
Kadar Sumber karbon (%)
50 (S1) 14234,61 594,8
100 (S2) 22774,59 1016,7
150 (S3) 26998,82 1225,3
200 (S4) 24787,22 1116,1
Kadar ekstrak khamir (%)
0,2 (E) 91778,7 4425,6
Kadar kolesterol (mg%)
12,5 (Z1) 18492,77 805,1
25 (Z2) 10324,64 401,6
50 (Z3) 4873,97 132,4
100 (Z4) tt tt
tt. tidak terdeteksi

Tabel IV. Kadar asam madekasat dalam biomasa kering dalam berbagai media perlakuan
Kadar sumber nitrogen Luas Daerah Di bawah Kurva (LDDK) Kadar asam madekasat
(µg/g bobot kering)
50 (N1) 7947,82 121,0
100 (N2) 4838,19 22,1
150 (N3) 8824,04 148,9
200 (N4) 6523,79 75,7
Kadar sumber fosfat
50 (P1) 15748,16 369,0
100 (P2) 18314,93 450,6
150 (P3) 11733,36 241,4
200 (P4) 21055,14 537,7

Kadar sumber karbon

50 (S1) 7689,64 112,8
100 (S2) 11621,05 237,8
150 (S3) 12565,87 267,8
200 (S4) 2988,90 36,7
Kadar ekstrak khamir
0,2% (E) 7280,26 99,8
Kadar kolesterol mg%
12,5 (Z1) 25638,48 683,5
25 (Z2) 5740,93 50,8
50 (Z3) tt tt
100 (Z4) tt tt

Manipulasi kadar sumber fosfat, hasilnya
tidak konsisten dalam meningkatkan produksi
senyawa triterpenoid tersebut, karena hanya
pada kadar 200% yang dapat meningkatkan
produksi senyawa golongan triterpenoid
tersebut.
Pada Tabel III nampak bahwa biosintesis
asiatikosida pada perlakuan variasi kadar
sumber nitrogen, ternyata bahwa pada kadar
50% dan 150% lebih tinggi dari normal
(100%). Pada perlakuan variasi kadar sumber
fosfat kesemuanya lebih rendah dari normal,
sedangkan pada perlakuan variasi kadar
sumber karbon pada kadar 150 dan 200%,
biosintesis asiatikosida meningkat, walaupun
tidak besar. Pada elisitasi dengan ekstrak
khamir (0,2%) ternyata meningkat hampir
tiga kali lipat, sedangkan pada penambahan
prazat (kolesterol), kadar asiatikosida tertinggi
dicapai pada kadar kolesterol 12,5 mg%.
Pada Tabel IV nampak bahwa
biosintesis asam madekasat meningkat
walaupun tidak tinggi, yaitu pada penambahan
elisitor dan prazat (12,5 dan 25 mg%).
 Produksi metabolit sekunder, yaitu
asiatikosida dan asam madekasat, pada media
normal terjadi fluktuasi, hal ini dapat terjadi
kemungkinan diakibatkan ketidakseragaman
populasi sel dalam sistem kultur suspensi yang
dibuat.
Berdasarkan hasil kromatogram lapis
tipis (Gambar 2), ternyata baik helaian daun
maupun tangkai daun tidak menunjukkan
adanya asiatikosida maupun asam madekasat,
hal ini kemungkinan helaian daun dan tangkai
daun masih muda sehingga belum terbentuk
kedua senyawa tersebut. Jelas dalam
kromatogram tersebut untuk daun dan tangkai
daun tidak terdapat bercak yang memiliki Rf
yang sama dengan kromatogram pembanding
TECA.
Untuk penelitian selanjutnya perlu
diteliti senyawa yang terdapat dalam tangkai
daun (stipula) yang digunakan sebagai
eksplan.
Pemberian prazat berupa larutan atau
suspensi kolesterol tidak begitu
menguntungkan, karena kelarutan kolesterol
dalam media berair sangat terbatas. Dari hasil
percobaan ternyata kadar 12,5% merupakan
kadar yang optimal dalam penelitian ini.
Dari berbagai penelitian ternyata tidak
belum ditemukan percobaan yang
menggabungkan kadar-kadar yang optimal
setiap komponen dalam media, apakah
percobaan semacam itu dapat dilakukan,
sehingga hasil yang diharapkan akan tercapai,
yaitu meningkatkan produksi metabolit
sekunder dalam kultur suspensi sel. Namun
demikian, penggabungan kadar sumber nutrisi
individual optimal diperkirakan sangat
berbeda dengan kombinasi penggabungannya
dipandang dari segi produksi metabolit
sekunder.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat
ditarik kesimpulan sebagai berikut.
1. Senyawa asiatikosida dan
madekasoida dapat diproduksi dengan
kultur suspensi sel Centella asiatica.
2. Dengan manipulasi kadar sumber
nitrogen, fosfat, karbon secara
individual dapat diperoleh kadar
masing-masing komponen nutrisi
yang optimal.
3. Elisitasi dengan ekstrak khamir (ragi)
dapat meningkatkan produksi
asiatikosida.
4. Penambahan prazat (prekursor)
kolesterol juga dapat meningkatkan
produksi asiatikosida.
UCAPAN TERIMAKASIH
Terima kasih yang setulusnya kami ucapkan
kepada Direktorat Pembinaan Penelitian dan
Pengabdian pada Masyarakat, Dirjen DIKTI,
Departemenen Pendidikan dan Kebudayaan
yang telah menyetujui dan mendanai
penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Adirukmi,N.S. dan Saleh,M.N., 1994, Beberapa
Varietas Langka Tumbuhan Obat
Tradisional di Malaysia, Simposium
Penelitian Bahan Obat Alami VIII dan
Muktamar Perhipba VI, Bogor.
Agil, M., Prayoga,B., Sutarjadi, 1992, Pegagan,
Herba Multimanfaat yang Hampir
Terlupakan, Warta Tumbuhan Obat
Indonesia, Vol.I, no.2, 44-45.
Anonim, 1977, Materia Medika Indonesia, Jilid I,
34-39, Departemen Kesehatan RI,
Jakarta.
Chasseaud,L.F., Fry,B.J., Hawkins,D.R.,
Lewis,J.D., Sword,J.P., Taylor,T.,
Haihway,D.E., 1971, The Metabolism of
Asiaticoside, Madecassic Acid, and
Asiatic Acid in the Rat, J. Arzneim-
Forsch., 1479-1484.
Jork, H, Funk, W., Fischer, W., Winner, H. 1994.
Thin Layer Chromatography ; Reagents
and Detection Methods. Vol. I 6. VCH
Verlaggsell schaff m6H. Weinheim,
Germany.
Perry, L.M., 1980, Medicinal Plants of East and
Southeast Asia, Martinus Nijjhoff
Publisher, Dordrecht-Boston-Lancaster.
Pramono,S., 1992, Profil Kromatogram Ekstrak
Herba Pegagan yang Berefek
Antihipertensi, Warta Tumbuhan Obat
Indonesia, Vol.I, no.2, 37-39.
Sastrapradja, S., 1982, Tumbuh-tumbuhan Obat,
26, Lembaga Biologi Nasional - LIPI,
Bogor.
Suhartatik,,S.E., 1989, Pengaruh Infusa Daun
Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban. )
terhadap Daya Larut Batu Ginjal
 Kalsium, Skripsi, Fakultas Farmasi
UGM, Yogyakarta.
Suwono, 1992, Pengaruh Hipotensif Akut Hernba
Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.)
pada Anjing yang Dianestesi, Warta
Tumbuhan Obat Indonesia, Vol.I, no.2,
40-43.
Staba,E.J., 1980, Plant Tissue Culture as a Source
of Biochemicals, CRC Press Inc., Boca
Raton, Florida.
Willian, P.D., Wilkiinson, A.K., Lewis, J.A.,
Black, G.M., Mavituna, F. 1988. A
Method for the Rapid Production of Fine
Plant Cell Suspension Cultures, Plant
Cell Res. 7. 459-462.