BAB I

PENDAHULAN
1.1 Latar Belakang

DNA (Deoxyribonucleic acid) merupakan suatu unit struktural gen

dimana DNA terbentuk dari untaian panjang nukleotida atau yang dikenal dengan
nama polimer nukleotida yang tidiri dari satu gugus fosfat, suatu gula pentosa,
dan satu basa N yang mempunyai ikatan hidrogen pada basa nukleotida kemudian
berubah rantai saling berikatan (Santoso dan Santri, 2016). Dalam forensik DNA
dapat digunakan sebagai sampel untuk dilakukan identifikasi namun sebelum
identifikasi dilakukan DNA perlu di lakukan pengujian. Pengujian tersebut
berupa kadar dan kemurnian atau kuantifikasi DNA yang bertujuan untuk
mengetahui kualitas DNA yang didapat. Melakukan pengujian dengan
menggunakan spektrofotometri (Fatchiyah, 2011).
Spektrofotometri merupakan salah satu metode yang dapat digunakan
untuk mengukur kadar dan kemurnian atau kuantifikasi DNA. Prinsip dasar pada
spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larutan sempurna, tidak ada
partikel koloid apalagi duspensi. Dimana spektrofotometer UV memiliki prinsip
radiasi sinar ultraviolet yang dapat diserap oleh nuklotida DNA dan protein
dalam larutan (Yudianto, 2015).
Spektrofotometer merupakan alat untuk mengukur transmitan atau
absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang, tiap media akan
menyerap cahaya pada panjang gemlombang tertentu dan tergantung pada
senyawa atau warna yang terbentuk (Cairns, 2009). Spektrofotometer adalah alat
yang dapat digunakan untuk mengukur absorban dengan menggunakan cara yaitu
melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu objek kaca
atau kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan di serap dan sisanya akan
dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang di serap sebanding dengan
konsentrasi larutan di dalam kuvet (Sastrohamidjojo, 2007).
Spektrofotometer UV-VIS merupakan pengukuran serapan cahaya di
daerah ultraviolet (200-350nm) dan sinar (350-800nm) oleh sutau senyawa.
Serapan cahaya UV atau VIS (cahya tampak) yang mengakibatkan transisi
elektronik, yaitu promosi elektron-elektron dari oribital keadaan dasar yang
berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi berenergi lebih rendah.
1.2 Rumusan Masalah
1. Apa definisi pada spektrofotometer ?
2. Apa definisi dari DNA ?
3. Apa kegunaan dari spektrofotometer UV-Vis ?
4. Bagaimana prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis ?
5. Bagaimana analisis Sampel Spektroskopi UV/Vis ?
6. Apa hubungan antara spektrofotometri UV-Vis dengan materi fisika listrik,
magnet, gelombang, dan optik ?

1.3 Tujuan
Tujuan dari penyusunan makalah ini adalah :
1. Mengetahui definisi dari spektrofotometer
2. Mengetahui definisi dari DNA
3. Memahami kegunaan dari spektrofotometer UV-Vis
4. Memahami prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis
5. Mengetahui analisis Sampel Spektroskopi UV/Vis
6. Mengetahui hubungan antara spektrofotometer UV-Vis dengan materi fisika
listrik, magnet, gelombang, dan optik.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi DNA

Deoxyribonucleic acid atau DNA adalah suatu unit struktural gen,
dimana DNA ini terbentuk dari untaian panjang nukleotida atau yang dikenal
dengan nama polimer nukleotida yang terdiri dari satu gugus fosfat, satu gula
pentosa, dan satu basa N yang memiliki ikatan hidrogen di antara basa nukleotida
kemudian berubah kedua rantai saling berikatan (Santoso dan Santri, 2016).
Menurut Yudianto (2015) menjelaskan bahwa basa nitrogen DNA terdiri atas
basa Guanin (G) dan Adenin (A) disebut purin, serta Sitosin (C) dan Timin (T)
disebut pirimidin. Dari hal inilah setiap urutan basa nitrogen yang membentuk
DNA yang menjadi pembeda antara individu satu dengan individu lainnya,
disebabkan setiap individu tersebut memiliki susanan basa yang berbeda-beda.
(Yudianto, 2015).
Dalam forensik DNA dapat digunakan sebagai sampel untuk dilakukan
identifikasi namun sebelum identifikasi dilakukan DNA perlu di lakukan
pengujian. Pengujian tersebut berupa mengukur kadar dan kemurnian atau
kuantifikasi DNA yang bertujuan untuk mengetahui kualitas DNA yang didapat.
Melakukan pengujian dengan menggunakan spektrofotometri (Fatchiyah, 2011).
Spektrofotometri merupakan salah satu metode yang dapat digunakan
untuk mengukur kadar dan kemurnian atau kuantifikasi DNA. Prinsip dasar pada
spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larutan sempurna, tidak ada
partikel koloid apalagi duspensi. Dimana spektrofotometer UV memiliki prinsip
radiasi sinar ultraviolet yang dapat diserap oleh nuklotida DNA dan protein
dalam larutan (Yudianto, 2015).
Dalam menguji kadar dan kemurnian DNA dapat menggunakan metode
seperti spektrofotometer UV dimana memiliki prinsip radiasi sinar ultaraviolet
yang diserap oleh nukleotida (DNA) dan protein dalam larutan. Dimana dalam
penyerapannya maksimal oleh DNA pada Panjang gelombang (λ) 260 nm
sedangkan protein pada panjang gelombang (λ) 280 nm.
2.2 Definisi spektrofotometer
 Spektrofotometer adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan
fotometer. Spektrofotometer yang dapat menghasilkan sinar dari spectrum
dengan panjang gelombang tertentu, sedangkan fotometer adalah alat pengukur
intensitas cahaya yang ditransmisikan atau di absorbsi. Sehingga
spektrofotometer dapat digunakan sebagai pengukur energi relatif jika energi
tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemiskan sebagai fungsi panjang
gelombang. Keunggulan dari spektrofotometer adalah panjang gelombang dari
sinar putih yang dapat di deteksi, dan cara ini diperoleh dengan alat pengurai
yaitu prisma, grating atau celah optis. Pada fotometer filter dari berbagai warna
yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek pada panjang gelombang tertentu
(Gandjar, 2007)
Spektrofotometer UV-Vis merupakan teknik spektro yang menggunakan
sumber radiai elektromagnetik ultraviolet dekat (190 nm – 380 nm) dan sinar
tampak (380 nm – 780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer.
Umumnya spektrofotometer UV-Vis bekerja berdasarkan teori dimana
setiap unsur pada tabel periodik adalah unik. Setiap unsur berupa atom atau ion
yang hanya dapat menyerap satu cahaya dengan panjang gelombang tertentu dan
memantulkan yang lainnya, dan hanya pada panjang gelombang elektron dapat
tereksiasi atau berpindah dari orbital satu ke orbital lain.
2.3 Kegunaan dari Spektrofotometer UV-Vis
Spektroskopi UV-Vis merupakan metode penting yang mapan, andal dan
akurat. Dengan menggunakan spektroskopi UV-Vis, substansi tak dikenal dapat
diidentifikasi dan konsentrasi substansi yang dikenal dapat ditentukan. Pelarut
untuk spektroskopi UV harus memiliki sifat pelarut yang baik dan memancarkan
sinar UV dalam rentang UV yang luas. Spektroskopi UV-Vis juga digunakan
untuk cairan berwarna.
Adapun kegunaan lain dari spektrofotometer UV-Vis yaitu alat yang
digunakan untuk mengukur transmitansi, reflektansi dan absorbs dari cuplikan
sebagai fungsi dari Panjang gelombang. Spektrofotometer digunakan untuk
diemisikan sebagai fungsi dari Panjang gelobang. Suatu spektrofotometer
tersusun dari sumber spektrum sinar terlihat yang seimbang dan monokromatis.
Sel pengabsorbi untuk mengukur perbedaan absorbs antara cuplikan dengan
blanko atau pun pembanding.
2.4 Prinsip Kerja Spektrofotometer
 Prinsip kerja spektrofotometer adalah penyerapan cahaya pada Panjang
gelombang tertentu pada bahan yang diperiksa. Setiap zat memiliki absorbansi
pada Panjang gelombang tertentu yang khas. Panjang gelombang dengan
absorbansi tertinggi digunakan untuk mengukur kadar zat yang diperiksa. Dengan
banyaknya cahaya yang diabsorbsi oleh zat berbanding lurus dengan kadar zat.
Spektrum elektromagnetik dibagi dalam beberapa daerah cahaya. Suatu
daerah akan diabsorsi oleh atom atau molekul dan Panjang gelombang dan
cahaya yang diabsorbsi dapat menunjukan struktur senyawa yang lebih teliti.
Spektrum elektromagnetik meliputi suatu daerah dan Panjang gelombang yang
luas dari sinar gamma gelombang pendek berenergi tinggi sampai pada panjang
gelombang mikro (Marzuki Asnah 2012).
Keuntungan utama dari metode spektrofotometer adalah metode yang
memberikan cara sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang sangat kecil.
Selain itu, hasil yang didapatkan cukup akurat, dimana angka yang terbaca
langsung dicatat oleh detector dan tercetak dalam bentuk angka digital ataupun
grafik yang sudah diregresikan (Yahya S, 2013). Secara sederhana instrument
spektrofotometeri yang disebut spektrofotometer terdiri dari :

Gambar 1. Spektrofotometer UV-Vis

Cahaya dari lampu akan dipancarkan lurus kearah sampel, sampel akan
terkesitasi, dan hasil dari eksitasi electron pada sampel akan ditangkap oleh
detector. Hal yang perlu diperhatikan dalam perinsip kerja spektrofotometer UV-
Vis merupakan sampel yang tidak dapat langsung disinari oleh cahaya lampu
namun perlu diwarnai terlebih dahulu yaitu dengan menanbahkan zat aditif yang
bereaksi dengan kation atau anion yang ingin diukur.
Hukum Lambert Beer menyatakan hubungan linier antara absorbansi
dengan konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan.
Dalam hukum Lambert Beer tersebut ada beberapa pembatasan, yaitu :

 Sinar yang digunakan dianggap monokromatis

 Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang
yang sama
 Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung
terhadap yang lain dalam larutan tersebut
 Tidak terjasi fluorensensi atau fosforisensi
 Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan.
Hukum Lambert Beer dinyatakan dalam rumus sebagai berikut :

A=e.b.c
Dimana :
A = absorban
e = absorptivitas molar
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi

Spektrum cahaya yang dapat terlihat oleh mata terentang antara 400 nm
sampai 800 nm. Pada Teknik sptrofometri, cahaya dari sumberr cahaya diuraikan
menggunakan prisma sehingga diperoleh cahaya monokromatis yang diserap oleh
zat yang akan diperiksa. Cahaya monokromatis merupakan cahaya satu warna
dengan satu Panjang gelombang, sehingga cahaya yang diserap oleh larutan
berwarna dapat diukur.
Warna yang dapat diserap oleh suatu senyawa merupakan warna
komplementer dari warna yang telah diamati. Beberapa warna yang terlihat dan
warna komplementernya terdapat pada table berikut :
 Panjang Warna Terlihat Warna
Gelombang Komplementer
< 400 Ultraviolet -
400 – 450 Violet Kuning
450 – 490 Biru Jingga
490 – 550 Hijau Merah
550 – 580 Kuning Ungu
580 – 650 Jingga Biru
650 – 700 Merah Hijau
>700 Inframerah
Tabel 1. Warna terlihat dan warna komplementer

2.5 Analisis Sampel Spektroskopi UV/Vis

Spektrofotometer UV/Vis dapat digunakan untuk analisis kualitatif
maupun analisis kuantitatif.
a. Analisis Kualitatif
Penggunaan alat ini dalam analisis kuantitatif sedikit terbatas sebab
spektrum sinar tampak atau sinar UV menghasilkan puncak-puncak serapan
yang lebar sehingga dapat menyimpulkan bahwa spektrum yang dihasilkan
kurang menunjukan puncak-puncak serapan. Namun, walaupun puncak
yang dihasilkan berbentuk lebar, puncak tersebut masih dapat digunakan
untuk memperoleh keterangan ada atau tidaknya gugus fungsional tertentu
dalam suatu molekul organik.
b. Analisis Kuantitatif
Penggunaan sinar UV dalam analisis kuantitatif memberikan
beberapa keuntungan, diantaranya :
 Dapat digunakan secara luas
 Memiliki kepekaan tinggi
 Keselektifannya cukup baik dan terkadang tinggi
 Ketelitian tinggi dan tidak rumit

Adapun langkah-langkah utama dalam analisis kuantitatif adalah:

 Pembentukan warna (untuk zat yang yang tak berwarna atau
warnanya kurang kuat)
 Penentuan panjang gelombang maksimum
 Pembuatan kurva kalibrasi
  Pengukuran konsentrasi sampel
Panjang gelmbang cahaya UV/Vis jauh lebih pendak, spektrum
sinar tampak terentang dari sekitar 400nm (ungu) sampai 750nm (merah),
sedangkan spektrum ultraviolet terentang dari 100nm sampai 400nm.
Kuantitas energi yang dapat diserap oleh suatu senyawa
berbanding terbalik dengan Panjang gelombang radiasi :

Violet : 400 – 420 nm

Indigo : 420 – 440 nm
Biru : 440 – 490 nm
Hijau : 490 – 570 nm
Kuning : 570 – 585 nm
Oranye : 585 – 620 nm
Merah : 620 – 780 nm
 Gambar 2. Spektrum UV

Analisis ini dapat digunakan yakni dengan penentuan absorbansi

dari larutan sampel yang diukur. Prinsip penentuan spektrofotometer
UV/Vis adalah aplikasi dari Hukum Lambert-Beer, yaitu:

A = - log T = - log It / Io = ε . b . C

Dimana :

A = Absorbansi dari sampel yang akan diukur

T = Transmitansi
I0 = Intensitas sinar masuk
It = Intensitas sinar yang diteruskan
ε = Koefisien ekstingsi
b = Tebal kuvet yang digunakan
c = Konsentrasi dari sampel
2.6 Hubungan antara spektrofotometri UV-VIS dengan materi fisika listrik,
magnet, gelombang, dan optik
Spektrofotometri sebagai salah satu metode dalam kimia analisis yang
digunakan untuk menentukan komposisi atau konsentrasi suatu sampel baik secara
kuantitatif dan kualitatif menggunakan teori dari fisika dasar terutama pada masalah
interaksi antara materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi
elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi, atau dihamburkan,
sehingga dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi, ataupun
spektroskopi emisi.
Radiasi elektromagnetik memiliki sifat ganda yang disebut sebagai sifat
dualistik cahaya yaitu:
1. Sebagai gelombang.
2. Sebagai partikel-partikel energi yang disebut foton.
Karena sifat tersebut, maka beberapa parameter perlu diketahui, misalnya panjang
gelombang, frekuensi, dan energi tiap foton. Panjang gelombang (l) didefinisikan
sebagai jarak antara dua puncak.

Grafik 2.6.1 Hubungan antara Panjang Gelombang dengan Jarak

Hubungan dari ketiga parameter di atas dirumuskan oleh Planck
yang dikenal dengan persamaan Planck. Hubungan antara panjang
gelombang frekuensi dirumuskan sebagai

𝑐=𝜆𝑣

Persamaan Planck merupakan persamaan yang menggambarkan

hubungan antara energi tiap foton dengan frekuensi.
hc
E=h.v=
λ

Dimana:
E = energi tiap foton
h = tetapan Planck (6,626 x 10-32 J . s )

v = frekuensi sinar
c = kecepatan cahaya (3 x 108 m.s-1)

Dari rumus tersebut, dapat diketahui bahwa energi dan frekuensi

suatu foton akan berbanding terbalik dengan panjang gelombang, tetapi
energi yang dimiliki suatu foton akan berbanding lurus dengan
frekuensinya.
Misalnya, energi yang dihasilkan cahaya UV lebih besar daripada
energi yang dihasilkan sinar tampak. Hal ini disebabkan UV memiliki
panjang gelombang (λ) yang lebih pendek (100–400 nm) dibanding
panjang gelombang yang dimiliki sinar tampak (400–800 nm).