Nama : Lenvi Irvannanda

Nim : 181910012

Matkul : Bioteknologi

Dosen Pengampuh : Siska ayu wulandari, M.Si

SOUTHERN

Pengertian

Southern merupakan sebuah metode yang sering digunakan dalam bidang biologi molekuler untuk
menguji keberadaan dari suatu sekuen DNA dalam suatu sampel DNA.

Prinsip Kerja

Mengkombinasikan elektroforesis gel agarosa untuk memisahkan DNA berdasarkan ukurannya dan
kemudian ditransfer ke membran filter untuk selanjutnya dilakukan hibridisasi dengan probe.

Untuk mengidentifikasi ataupun melacak suatu fragmen DNA spesifik, diperlukan suatu pelacak
(probe).DNA dipisahkan terlebih dahulu dengan elektroforesis.

Probe yang dilabel akan hibridisasi pada pita-pita DNA untuk mengetahui apakah DNA tersebut
mengandung gen yang diinginkan.

Southern mendeteksi DNA rantai tunggal dengan menggunakan DNA sebagai pelacak. Selain Blot
Southern, metode lain yang mirip dan dikembangkan dari Blot Southern adalah Blot Western, Blot
Northern, dan Blot Southwestern yang memiliki prinsip yang sama, namun molekul yang akan dideteksi
dan pelacak yang digunakan berbeda.

Kegunaan dari Blot Southern adalah untuk menganalisis keberadaan mutan yang ada pada suatu
organisme dan dapat diketahui ukuran dari gen yang menjadi mutan pada organisme tersebut.
Tahapan

Tahap awal dari metode Blot Southern adalah pendigestian DNA dengan enzim restriksi
endonuklease sehingga terbentuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil. Kemudian DNA
dipisahkan sesuai ukuran dengan elektroforesis agarosa. Setelah DNA terpisah, dilakukan
pemindahan DNA ke membran nitroselulosa, tahap ini disebut dengan tahap blotting.

Membran nitroselulosa diletakkan pada bagian atas dari gel agarosa. Pada teknik blotting
dengan menggunakan vakum, membran diletakkan pada bagian bawah gel. Tekanan diberikan
secara merata pada gel untuk memastikan terjadi kontak antara gel dengan membran.

Proses transfer berlangsung dengan memanfaatkan daya kapilaritas. setelah DNA ditransfer ke
gel, membran nitroselulosa dipanaskan dengan suhu tinggi (60oC-100oC) kemudian membran
diberi radiasi UV agar terbentuk ikatan kovalen dan permanen antara pita-pita DNA dengan
membran. Lalu, membran dicampur dengan probe (pelacak) yang telah dilabel radioaktif, tetapi
dapat juga digunakan label nonradioaktif yang dapat berpendar. Probe yang digunakan adalah
DNA utas tunggal yang memiliki sekuen yang akan dideteksi. Probe diinkubasi dengan
membran agar dapat berhibridisasi dengan DNA yang ada pada membran.

Setelah proses hibridisasi, probe yang tidak terikat dicuci dari membran sehingga yang tinggal
hanya probe yang hibrid dengan DNA di membran.[4] Pola hibridisasi kemudian dideteksi dengan
visualisasi pada film X-ray melalui autoradiografi.

Kelebihan

 Kelebihan dari metode ini adalah dapat mengetahui pola integrasi gen sisipan di dalam
genom
 Teknik ini dapat diketahui panjang gen yang ada di dalam suatu organisme, dapat
digunakan untuk kajian keragaman molekuler, seperti RLFP dan RAPD.

Kekurangan
memerlukan waktu yang lama, memerlukan DNA dalam jumlah banyak, dan diperlukan keterampilan
khusus dalam penggunaannya. Kelebihan dari metode ini adalah dapat mengetahui pola integrasi gen
sisipan di dalam genom.

NORTHERN

Pengertian

Arah mata angin yang mengarah ke Utara.

Prinsip Kerja

Prinsip Northern Blot adalah memisahkan RNA berdasarkan ukuran dan terdteksi pada
membrane menggunakan probe hibridisasi dengan urutan basa komplementer untuk semua, atau
sebagian dari urutan mRNA target

Prinsip Northern Blot adalah memisahkan RNA berdasarkan ukuran dan terdteksi pada
membrane menggunakan probe hibridisasi dengan urutan basa komplementer untuk semua, atau
sebagian dari urutan mRNA target
Komponen Utama yang digunakan
1. Membrane digunakan sebagai tempat hasil jiplakan fragmen RNA dari gel agarosa
formaldehid. Membrane yang digunakan yaitu nilon
2. Probe atau RNA Probe adalah fragmen yang digunakan untuk hibridisasi asam nukleat
Probe dilengkapi semua atau sebagian urutan basa komplementer dari urutan mRNA
target
Tahap Northern Bloot
1. Isolasi DNA dan Pemotongan DNA
Tahap untuk memperoleh DNA yang dideteksi. Pemotongan DNA yang ingin diperoleh
dilakukan dengan menggunakan enzim retriksi yang bersifat spesifik terhadap dna
2. Fragmentasi DNA dengan elektrolisis gel
Merupakan tahap dimana fragmen-fragmen DNA akan terpisah berdasarkan ukuran berat
molekulnya. Berdasarkan prinsip elektroforesis fragmen dna yang ukurannya berat
molekulnya lebih kecil akan lebih cepat bergerak dari kutub negative ke kutub positif
dibandingkan dengan fragmen DNA dengan berat molekul lebih besar.
 Denaturasi DNA
Proses ini dilakukan dengan merendam gel
dalam larutan denatiran (NaOH). NaOH bersifat
basa sehingga dapat menyebabkan rusaknya
ikatan hydrogen antar untai DNA. Ikatan
tersebut yang putus menyebabkan DNA
menjadi single strand
3. Transfer DNA ke Membran Nitroselulosa
DNA yang diperoleh kemudian ditransfer ke
membrane nitroselulosa. Tahap inilah yang
dinamakan blotting
4. Hibridisasi DNA
Merupakan proses pembentukan molekul
double helix dari single strand DNA probe dan
strand DNA target. Tahap ini terjadi ketika
membrane nitroselulosa direndam dalam larutan
yang berisi probe DNA Ss
5. Deteksi DNA
Merupakan tahap lanjutan dari proses hibridisasi DNA yang menggunakanpelacak/probe.
Probe biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas
spesifikradionukletida. Pada tahap deteksi DNA digunakan Autoradiogram untuk melihat
lokasisinyal DNA
Kelebihan
 Kemampuan mendeteksi berbagai ukuran RNA dan pengamatan produk Splicing RNA
Kekurangan
 Sensitivitas rendah dan memerlukan sejumlah besar total RNA sampel.

ELISA

Pengertian :
ELISA adalah suatu metodeyang di kerjakan sebagai sarana ukur kadar antigen atau
antibodi dalam suatu medium cair, sepertiserum atau organ yang telah dicairkan /
dilarutkan. Metode ELISA yangdilakukan dalam praktikum ini merupakan metode untuk
ukur kadarIL-10 dalam serum tikus. Prinsipnya adalah adanya ikatan antigen-
antibodi yang akan dibaca dengan reaksi enzimatis yang dapatmengakibatkan
perubahan intensitas warna pada larutan.Intensitas warna ini kemudian akan diukur pada
ELISA reader

Prinsip kerja :
ELISA itu pada reaksi semutara semutigen danantibodi secara spesifik, dengan
menggunakan enzim sebagaipenanda reaksi. Metode yang dipakai adalah metode
ELISASandwich Indirdll ( doubel antibodi ). Kelebihan darsaya metode iniadalah
sampel tidak harus dimurnikan sebelum dianalisis, dantesternya bisa sangat
sensitifitas.

Kelebihan :
indirect ELISA yaitu memiliki sensitifitas tinggi dan sinyal amplifikasi yang tinggi.

Kekurangan :
indirect ELISA yaitu membutuhkan waktu yang lama dan terjadi reaksi silang.

Tahapan ;
Prosedur Kerja Praktikum yang dilakukan menggunakan teknik Sandwich Tidak Langsung
ELISA. Adapun prosedur kerja yang dilakukansaat praktikum adalah sebagaiberikut:
1. Semua reagen, larutan standart dan contoh persiapan sesuai intruksi.
2. Disiapkan pengenceran standart dan wash bufferSebuah. Pengenceran standar
(diencerkan 120 µl Standar Larutan ke dalam120 µl Pengencer Standar ).b. Mencuci
Penyangga (diencerkan WAbu Penyangga Konsentrasi 15 ml ke dalamdeionisasi
atau aquades dan di tambahkan 300 ml).
3. Ditambahkan 50 µl standart ke masing-masing well plate.
4. Ditambahkan 40 µl sampel ke baik piring dan 10 µl antibodi anti -IL-10,kemudian
tambahkan 50 μl streptavidin-HRP ke baik piring sampel danstandar baik (Bukan
kontrol kosong dengan baik).
5. Diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37 ° C (juga ditutup dengan sealer).
6. Sealer dibuka, dan sebanyak 3 kali dengan wash buffer
7. Ditambahkan 50 µl Solusi Substrat SEBUAH ke masing-masing baik,kemudian
ditambah 50 µl Larutan Substrat B
8. Di nkubasi selama 10 menit pada suhu 37 ° C.
9. Ditambahkan 50 µl berhenti larutan ke masing-masing baik (warna biru akanberubah
menjadi kuning).
10. Ditentukan Optik Massa jenis (OD), dan dibaca dengan Elisa Pembaca padapanjang
gelombang 450 nm, dalam 30 menit setelah penambahan BerhentiSolusi .
11. dibuat kurva standar (software MS Excel curve fitting

WESTHERN
Pengertian
Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette dan dinamai Western blot untuk mengikuti
teknik Southern blot yang pertama kali ditemukan. Western blot adalah proses pemindahan
protein dari gel hasil elektroforesis ke membran. Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel
daripada gel sehingga protein yang terblot pada membran dapat dideteksi dengan cara visual
maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada organisme dilakukan dengan prinsip
imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder. Setelah pemberian antibodi
sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan pemberian kromogen atau secara fluoresensi.
Pada deteksi secara fluoresensi, reaksi antara antibodi primer dengan antibodi sekunder akan
memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya akan membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan
di kamar gelap.
Prinsip Kerja
Western blot adalah teknik untuk mengidentifikasi antibodi spesifik pada protein yang telah
dipisahkan antara satu dengan yang lain menurut ukurannya melalui elektroforesis gel. Blot
merupakan sebuah membran, biasanya berbahan dasar nitroselulose atau PVDF
(Polyvynilidine fluoride). Gel diletakkan diatas membran dan aliran listrik akan menginduksi
protein pada gel untuk berpindah pada membran. Membran tersebut akan menjadi replika dari
pola protein pada gel yang kemudian diwarnai secara sekuensial dengan antibodi.
Tahapan
 Proses dari western blot diawali dengan mengekstraksi protein yang akan digunakan. Cell
lysate merupakan bentuk sampel yang sering digunakan dalam western blot. Ekstraksi
protein dilakukan untuk mengumpulkan seluruh protein dalam sitosol sel. Hal ini harus
dilakukan dalam suhu yang rendah dengan bantuan protease inhibitors untuk mencegah
terjadinya denaturasi protein.48 Tahap selanjutnya adalah memisahkan sampel protein
yang digunakan berdasarkan ukuran menggunakan sodium dodecylsulphate-
polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). SDS-PAGE menggunakan dua tipe gel
berbeda: stacking dan separating. Gel stacking memiliki tingkat keasaman lebih tinggi
(pH 5,8) dan konsentrasi acrylamide yang lebih rendah. Sedangkan separating gel (pH
8,8) memiliki kandungan tinggi polyacrylamide, menyebabkan porus gel yang terjadi
lebih sempit.
 Setelah pemisahan protein, protein dari gel dipindahkan ke membran nitroselulosa lewat
transfer elektris lalu berikan antibodi utama ke dalam membran. Setelah pemberian
antibodi utama, berikan antibodi kedua yang harus berupa antibody-enzyme conjugate,
contohnya horseradish peroxidase (HRP).
 Tahap terakhir adalah menggunakan ECL dan membaca hasil.
Keuntungan
 Dapat mendeteksi protein secara semikuantifikasi
 Dapat mendeteksi target tunggal dari ribuan protein target secara spesifik
 Dapat memberikan informasi berat molekul dari protein tersebut.
Kekurangan
  Membutuhkan antibody spesifik untuk menargetkan suatu protein, sehingga banyak
protein target yang tidak dapat diteliti karena kurangnya antibodi yang tersedia.

ESTHERN

Pengertian
Eastern Blot merupakan teknik yang ditemukan oleh Reinhard dan Malamud (1982), adalah
proses transfer bidirectional dengan menggunakan aliran pelarut protein dari gel ke NC
berdasarkan titik isoelektrik. adalah teknik biokimia yang digunakan untuk menganalisis protein
modifikasi pasca-translasi termasuk penambahan lipid, fosfat, dan glycoconjugates. Ini paling
sering digunakan untuk mendeteksi epitop karbohidrat .
Manfaat
1. Untuk mendeteksi modifikasi pasca translasi protein
2. Untuk merujuk pada metode yang mendeteksi target mereka melalui interaksi psesifik
dari PTM dan probe, membedakan mereka dari noda Far – standar Barat
 DAFTAR PUSTAKA

Ausubel, F.M., R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith &K. Struhl. 2003.
Protokol Saat Ini dalam MolekulerBiologi .John Wiley & Sons,Inc., AS.
Azwar, IG M. 1985. Kemungkinan Penggunaan Tertaut dengan enzim ImunosorbenAssay
(ELISA) Dalam Diagnosa Serologis Brucellosis . IPB: Bogor.
Tukang roti, GB, S. Dunn & SEBUAH. Latja. 2007. Buku Pegangan dari
neurokimia danmolekuler neurobiologi: Praktis nerochemistry metode , vol. 6.
PeloncatScience, New York.
Berg, J. M. 2002. Tidak langsung ELISA dan Sandwich ELISA. (On line).https: //
www.ncbi.nlm.nih.gov / books / NBK22420 / diakses 9 Oktober 2018.
Elisa, 2017. Panduan Dasar Elisa . Groub Ilmu Hayati, Kanada
Miller D. C. 2006. Mekanisme dari ditingkatkan vaskular sel Menanggapi polimerbiomaterial
dengan permukaan berstruktur nano fitur . ProQuestInformasi danPerusahaan
Pembelajaran, Ann Punjung.

Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M, Losick R. 2004. Molecular Biology of The
Gene 5th ed. San Fransisco: Benjamin Cummings. Hal. 77-85.

Zuppaedo AB, Siebeling RJ. 1998. An Epimerase Gene Essential for Capsule Synthesis in Vibrio
vulnificus. Infect Immun 66(6): 2601–2606.

Southern EM. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel
electrophoresis. J Mol Biol 98:503-517.