31

BAB IV

METODE PENELITIAN

A. Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan pendekatan cross sectional untuk mengetahui

pengaruh SLCO1B1 terhadap miopati di Laboratorium Klinik Fakultas

Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma Surabaya pada Tahun 2017.

B. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Klinik Fakultas Kedokteran Universitas

Wijaya Kusuma Surabaya pada bulan Agustus–September 2017.

C. Populasi Penelitian

Populai terjangkau dari penelitian ini adalah penderita rawat jalan di RSUD

dr.Suetomo surabaya dan RS Anwar medika sidoarjo selama bulan Agustus–

September 2017.

D. Sampel Penelitian

Sampel penelitian ini adalah penderita hiperkolesterolemia yang telah

mendapatkan terapi simvastatin setidaknya selama 3 bulan dan bukan

penderita hiperkolesterolemia familial di RSUD dr.suetomo surabaya, dan

RS Anwar medika, memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi serta bersedia

mengikuti penelitian.

E. Cara Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel penelitian dilakukan secara purposive ssampling

yaitu setiap penderita yang memenuhi kriteria penelitian dimasukkan

 32

dalam subjek penelitian sampai memenuhi jumlah besar sampel yang

ditentukan.

F. Kriteria Inklusi dan Eksklusi

1. Kriteria Inklusi

Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah penderita

hiperkolesterolemia kecuali penderita hiperkolesterolemia fimilial yang

telah mendapatkan terapi simvastatin setidaknya selama 3 bulan di RSUD

dr.Suetomo surabaya dan RS Anwar medika sidoarjo selama periode

Agustus-September 2017 dan bersedia ikut dalam penelitian serta

mendapatkan informed consent.

2. Kriteria Eksklusi

- Penderita dengan riwayat penyakit jantung koronis berdasarkan

anamneis, elektrokardiografi, dan ekokardiografi

- Penderita penyakit ginjal kronis

- Penderita dengan hipertensi tidak terkontrol

- Penderita diabetes melitus

- Penderita kanker atau autoimun

- Penderita penyakit kronis seperti tuberkolosis,heepatitis atau HIV

G. Variabel Penelitian

Variabel Independen : Gen SLCO1B1

Variabel Dependen : Gejala miopati

H. Definisi Operasional Variabel

1. Miopati =

 Pengertian :
 33

Gejala berupa nyeri otot pada ekstremitas yang dikeluhkan

oleh pasien

 Cara mengukur : Dengan anamnesis pasien

 Skala pengukuran : Nominal

2. Gen SLCO1B1 =

 Pengertian :

Penyandi OATP1B1 yang terletak di kromosom 12 yang biasanya

ada di dalam hepatosit.

 Cara mengukur:Enzim restriksi TaqI 0,5 µL, 10x Buffer TaqI 1,0µ

 Skala pengukuran : Nominal

3. Terapi simvatatin =.

 Pengertian :

Obat golongan statin yang berfungsi menurunkan kadar

kolesterol dalam darah.

 Satuan : mg/dl

 Skala pengukuran : Ordinal

I. Alat dan Bahan

Alat : Mesin polymerase chain reaction (PCR)

Vial/Cap Label Contents/function

1. Putih Penyangga lisis jaringan - 20 ml

- [4 m urea,200 mM Tris,20
mM,20 mM NaCl,200 mM
EDTA,Ph 7,4(+25°C)]
2. hijau Penyangga yang mengikat
- 20 ml
 34

- [6 M guanidine-HCL,10 mM
urea,10 mM Tris-HCL,20%
Triton X-100(v/v), Ph 4,4
3. Pink Proteinase K, recombinasi (+25°C)]
PCR grade
- Lyophilizate

- Untuk sampel lisis dan in

4a. Hitam Penghambat-penghambat activasi DNA endogen
inhibitor
- 30 ml, menambahkan 20 ml
etanol

- [5 M guanidine-HCl, 20 Mm
tris-HCl, pH 6,6 (+25°C)
Kosentrasi terakhir setelah
4. biru Cuci penyangga penambahan etanol]

- 20 ml, menambahkan 80 ml
etanol

- [20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl,

pH 7,5 (+25°C) kosentrasi
terakhir setelah penambahan
5. tanpa a. penyangga elusi etanol]
warna
- 40 ml

- [10 mM Tris-HCl, pH 8,5

b. Tabung saringan murni (+25°C)]
yang tinggi
- 2 kantong dengan 50 tabung
polypropylene dengan 2 lapis
bulu serat kaca, untuk
penggunaan sampai 700 µL
c. Tabung koleksi volume sampel

- 8 kantong dengan 50 tabung

polypropylene (2ml)

J. Prosedur penelitian

Populasi terjangkau dengan penggunaan

terapi simvastatin minimal 3 bulan
 35

Consecutive sampling
dengan memperhatikan
kriteria inklusi dan
eksklusi

Sampel

Pengumpulan data

Penelitian uji gen

SLCO1B1

Hasil

K. Proses Pengambilan Sampel

 Isolasi DNA dari sampel

a. Bahan : Air Mineral, Stok Proteinase K (100 μg/mL), PrestoTM Buccal

Swab gDNA Extraction Kit (Geneaid), 10x Tris-Acetate-EDTA

(TAE) Buffer (Vivantis), Aquades, ethanol absolute

 36

b. Cara kerja : Proses ekstraksi DNA dari sampel mulut sebagai berikut:

1. Tahap S2 Buffer Preparation a. Siapkan tabung mikrosentrifuge

sejumlah sampel. Isi 500 μL Buffer S2 dan 1 μL Carrier RNA Solution,

Vortex sebentar.

2. Tahap Sampel Preparation

a. Ambil tabung mikrosentrifuge yang baru, isi dengan 500 μL Buffer

S1 dan 20 μL Proteinase K, masukkan cytobrush dan potong dengan

tang potong mendekati brush. Sentrifugasi selama 1 menit dengan

kecepatan 13.000 x g

b. Selanjutnya keluarkan cytobrush, tuangkan seluruh cairan kedalam

rangkaian GD Collumn dengan tabung mikrosentrifuge dan

sentrifugasi kembali 1 menit dengan kecepatan 13.000 x g.

Perhatikan tidak terdapt lagi serabut brush pada tabung

mikrosentrifuge.

c. Jika masih ada ulangi langkah diatas. Selanjutnya buang GD

Collumn dan inkubasi tabung mikrosentrifuge tersebut selama 10

menit pada suhu 60°C.

3. Tahap Lysis

a. Tambahkan 500 μL Buffer S2 (dari tahap S2 Buffer Preparation),

segera Vortex dan inkubasi kembali selama 10 menit pada suhu

60°C (Vortex sebentar setiap 5 menit).

 37

b. Selama inkubasi siapkan Elution Buffer secukupnya (25 – 50 μL/

sampel) dan masukkan kedalam tabung mikrosentrifuge dan diberi

label EB. c. Inkubasi EB tersebut pada suhu 60°C hingga digunakan.

4. Tahap DNA Binding

a. Tambahkan ethanol absolute ke lysate/ sampel dan langsung goncang

tabung dengan kuat selama 10 detik. Jika ada gumpalan, larutkan

dengan menggunakan pipet

b. Rangkaikan (pasangkan) GD Collumn dengan Collection tube dan

pindahkan 750 μL campuran diatas kedalam GD Collumn tersebut.

c. Sentrifugasi pada kecepatan 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit dan

buang isi Collection tube dan rangkaikan kembali.

d. Pindahkan sisa cairan di tabung mikrosentrifuge kedalm GD

Collumn dan sentrifugasi kembali pada kecepatan 14.000 – 16.000 x

g selama 1 menit. Lihat pada GD Collumn, jika masih ada cairan

dapat disentrifugasi sesuai langkah diatas sampai cairan tidak

terdapat lagi pada GD Collumn.

e. Buang Collection tube dan pindahkan GD Collumn kedalam

Collection tube yang baru.

5. Tahap Wash
 38

a. Tambahkan 400 μL Buffer W1 kedalam GD Collumn dan

sentrifugasi pad kecepatan 14.000 – 16.000 x g selama 30 detik,

buang cairan yang ada di dalam Collection tube

b. Letakkan GD Collumn kedalam Collection tube kembali dan

tambahkan 600 μL Wash Buffer (pastikan Ethanol absolute telah

ditambahkan) kedalam GD Collumn dan sentrifugasi pada kecepatan

14.000 – 16.000 rpm selama 30 detik, buang cairan yang berada

didalam Collection tube

c. Letakkan kembali GD Collumn pada Collection tube dan sentrifugasi

kembali pada kecepatan 14.000 – 16.000 x g selama 3 menit untuk

mengeringkan GD Collumn

6. Tahap Elution

a. Pindahkan GD Collumn kedalam tabung mikrosentrifuge yang bersih

dan tambahkan Elution Buffer sebanyak 25 – 50 μL (sesuaikan

dengan jumlah sampel/ kebutuhan) yang telah dipanaskan

sebelumnya ke TENGAH – TENGAH (bagian Tengah) matriks GD

Collumn. Biarkan selama minimal 3 menit untuk diserap oleh

Collumn.

b. Sentrifugasi pada kecepatan 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit

untuk memindahkan DNA dari Collumn kedalam tabung.

7. Simpan sampel DNA dilemari pendingin pada suhu dibawah 0°C.

 39

8. Untuk memastikan konsentrasi dan kemurnian DNA, sangat dianjurkan

pengukurannya melalui Nanophotometer.

9. Konsentrasi DNA pada pengukuran dengan nanophotometer diharapkan

pada kisaran 80 – 120 ng/µL.

 Prosedur PCR RFLP GEN PPAR⍺

a. Alat : Sarung tangan, masker, microtube PCR, tip kuning, tip putih,

mesin PCR/ Thermal cycler, Microwave, Template agarose,

inkubator, Timbangan digital, Alluminium Foil, Parafilm, Gel

Casting Tray, Gel Comb

b. Bahan : GoTaq(R) Green Master Mix (Promega, USA) Master Mix,

PPARα Intron 7; forward primer 5’-ACA ATC ACT CCT

TAA ATA TGG TGG-3’ dan reverse primer 5’-AAG TAG

GGA CAG ACA GGA CCA GTA-3’, Enzim Restriksi TaqI,

10x Buffer TaqI (with BSA), Nucleus Free Water, serbuk

Agarose (Bioline), Hyperladder/ Marker DNA 25bp (Bioline),

DNA yang sudah diisolasi, 10x Tris-AcetateEDTA (TAE)

Buffer (Vivantis), Ethidium Bromida.

c. Cara kerja : Metode PCR-RFLP digunakan untuk menentukan

polimorfisme pada intron 7.

1. Lakukan pengenceran primer sesuai dengan instruksi pada label dan

disimpan di lemari pendingin hingga digunakan.

 40

2. Siapkan tabung microtube PCR sesuai jumlah sampel dan diberi

penomoran.

3. Lakukan perhitungan sebagai berikut:

1 sampel Total jumlah sampel

Master Mix 12,5 µL Jlh sampel x 12,5 µL

Forward Primer 1,0 µL Jlh sampel x 1,0 µL

Reverse primer 1,0 µL Jlh sampel x 1,0 µL

Nucleus Free Water 8,5 µL Jlh sampel x 1,0 µL

Volume DNA 2,0 µL 2,0 µL setiap microtube

PCR

Ket : Volume DNA dan Volume Nucleus Free Water dapat

berbeda setiap microtube PCR sampel sesuai dengan

Konsentrasi DNA setiap sampel melalui

Nanophotometer.

4. Setiap tabung microtube PCR dimasukkan Master Mix 12,5 µL,

Forwar Primer 1,0 µL, Reverse Primer 1,0 µL, Volume Nucleus Free

Water dan Volume DNA sesuai dengan perhitungan konsentrasi

DNA melalui nanophotometer

5. Inkubasi di lemari pendingin selama 10 menit.

6. Hidupkan mesin PCR/ Thermal Cycler, atur protokol PCR gen

PPARα:
 41

a. Tahap Denaturation: 95ºC selama 2 menit diikuti 30 siklus

denaturation selama 30 detik

b. Tahap Annealing : 56ºC selama 30 detik

c. Tahap Extension : 72ºC selama 30 detik d. Final Extension : 72ºC

selama 5 menit

7. Seluruh sampel dimasukkan kedalam mesin PCR/ Thermal Cycler

pada template PCR dan tekan tombo “Run”. Waktu yang diperlukan

sekitar 1 Jam, 10 menit.

8. Setelah selesai, mesin PCR dimatikan/ di non-aktifkan dan seluruh

sampel (Produk PCR) dikeluarkan dan disimpan didalam lemari

pendingin hingga siap untuk digunakan untuk tahap RFLP.

9. Siapkan microtube PCR sesuai jumlah sampel dan diberi penomoran

10. Lakukan perhitungan sebagai berikut:

1 sampel Jumlah total sampel

10x Buffer TaqI (with BSA) 1,0 µL Jumlah total sampel x 1,0 µL

Enzim restriksi TaqI 0,5 µL Jumlah total sampel x 0,5 µL

Nucleus free Water 3,5 µL Jumlah total sampel x 3,5 µL

Produk PCR 5,0 µL Setiap microtube PCR

 42

11. Setiap mikrotube PCR dimasukkan 10x Buffer TaqI 1,0 µL,

Enzim restriksi TaqI 0,5 µL, Nucleus Free Water 3,5 µL dan

produk PCR 5,0 µL.

12. Hidupkan waterbath dan atur suhu air pada 65ºC

13. Selanjutnya seluruh mikrotube PCR di lapisi Parafil bagian

tutupnya (untuk mencegah penguapan saat diinkubasi pada

waterbath)

14. Setelah suhu air pada waterbath 65ºC, masukkan seluruh produk

PCR ke template (Gabus). Tunggu hingga 3 jam

15. Setelah 3 jam berlalu, siapkan larutan agarose dengan

konsentrasi 3% dengan perhitungan sebagai berikut:

a. Untuk Gel Casting tray yang besar : 3% x 130 mL (TAE

Buffer 10x pengenceran). Sehingga didapatkan jumlah

serbuk agarose yang diperlukan adalah 3,9 gr

b. Untuk Gel Casting tray yang kecil : 3% x 35 mL (TAE Buffer

10x pengenceran). Sehingga didapatkan jumlah serbuk

agarose yang diperlukan adalah 1,05 gr

c. Lakukan pengenceran TAE Buffer 10x dengan perhitungan

adalah 100 mL TAE Buffer 1x ditambah 900 mL Aquadest.

Hingga volume total nya adalah 1000 mL.

 43

16. Ambil 3,9 gr serbuk agarose dan larutkan dengan TAE Buffer

10x sebanyak 130 ml atau 1,05 gr serbuk agarose dan larutkan

dengan TAE Buffer 10x sebanyak 35 mL kedalam gelas beaker.

17. Masukkan campuran serbuk agarose tersebut dengan TAE Buffer

10 x kedalam Microwave. Atur microwave dengan power 630

dengan waktu 3 menit. Perhatikan larutan saat dipanaskan,

jangan sampai tumpah. Jika larutan sudah jernih keluarkan dari

microwave. Jika belum jernih, ulangi langkah tersebut sampai

larutan jernih.

18. Setelah larutan jernih, tambahkan ethidium Bromide 1,0 µL

(untuk pewarnaan). Goncangkan pelan – pelan (agar homogen)

19. Siapkan Gel Comb pada Gel Casting Tray sesuai kebutuhan

(yang besar atau yang kecil)

20. Selanjutnya tuangkan seluruh larutan agarose secara pelan –

pelan kedalam Gel Casting Tray (pastikan tidak ada gelembung

udara). Tunggu sekitar 15 menit hingga membeku.

21. Setelah membeku, cabut Gel Comb secara pelan – pelan hingga

tampak sumur – sumur/ Comb tempat produk PCR-RFLP

22. Selanjutnya masukkan seluruh produk RFLP-PCR kedalam

masing – masing sumur/ Comb dengan urutan sebagai berikut;

0 na. Comb pertama : Marker DNA (hyperladder 25 bp): 4 µL

 44

b. Comb kedua : Uncut (produk PCR tanpa enzim restriksi

TaqI) : 5 µL

c. Comb ketiga : Produk RFLP-PCR sampel 1 : habiskan

seluruhnya produk RFLP-PCR

d. Dan seterusnya hingga seluruh sampel

23. Atur mesin elektroforesis dengan voltage 80 Volt dengan waktu

90 menit

24. Setelah waktu yang ditentukan selesai, gel agarose tersebut

dimasukkan kedalam UV reader untuk diinterpretasi.

L. Analisis Data

Penelitian ini menggunakan analisis statistik yaitu uji deskriptif untuk

mengetahui variasi genetik yang terdapat pada pasien .

Pengaruh gen SLCO1B1 terhadap miopati dapat dilihat dari analisis SPSS

uji korelasi pearson menggunakan data sekunder yang telah diperoleh (gejala

miopati ).