Minnesota State University, Mankato

Cornerstone: Sebuah Koleksi Ilmiah

dan Kreatif Pekerjaan untuk
Minnesota State University,
Mankato
Semua Theses, Disertasi, dan Proyek Capstone Lain
Tesis, Disertasi, dan Proyek Capstone Lain

2017

Kuantifikasi Brain-Daerah Perubahan khusus pada

Insulin-Like Growth Factor-1 Ekspresi Selama Developmental
Hypothyroidism
Cari Lee Graber-Feesl
Minnesota State University, Mankato

Ikuti ini dan karya tambahan di: https://cornerstone.lib.mnsu.edu/etds

Bagian dari Endokrinologi Commons , Dan Neuroscience dan Neurobiologi Commons

Direkomendasikan Citation
Graber-Feesl, Cari Lee, "Kuantifikasi Brain-Daerah Perubahan khusus pada Insulin-Like Growth Factor-1 Ekspresi Selama Developmental Hypothyroidism"
(2017). Semua Theses, Disertasi, dan Proyek Capstone lain. 742.
https://cornerstone.lib.mnsu.edu/etds/742

Tesis ini dibawa ke anda untuk akses bebas dan terbuka oleh Theses, Disertasi, dan Proyek Capstone lain di Cornerstone: A Collection of ilmiah dan Pekerjaan Kreatif untuk

Minnesota State University, Mankato. Telah diterima untuk dimasukkan dalam Semua Theses, Disertasi, dan Proyek Capstone lain oleh administrator resmi dari Cornerstone: A

Collection of ilmiah dan Pekerjaan Kreatif untuk Minnesota State University, Mankato.
Kuantifikasi Brain-Daerah Perubahan spesifik di

Insulin-Like Growth Factor-1 Ekspresi Selama

Hypothyroidism perkembangan

Oleh

Cari Graber-Feesl

Sebuah Skripsi Dikirim di Pemenuhan parsial dari

Persyaratan untuk Gelar

Master of Science

di

ilmu biologi

Minnesota State University, Mankato

Mankato, Minnesota

Desember 2017
13 Okt th, 2017

Kuantifikasi Brain-Daerah Perubahan khusus pada Insulin-Like Growth Factor-1 Ekspresi Selama
Developmental Hypothyroidism

Cari Graber-Feesl

Tesis ini telah diperiksa dan disetujui oleh anggota berikut komite siswa.

________________ David Sharlin

Advisor

________________ Rachel Cohen

Anggota Komite

_______________ Michael Bentley

Anggota Komite
 Abstrak

hormon tiroid tidak memadai (TH) selama hasil pembangunan di permanen

defisit neurologis. defisit ini adalah hasil dari otak TH-dimediasi terganggu

pengembangan. Menariknya, tidak cukup insulin-like growth factor 1 (IGF-1) selama

hasil pembangunan defisit neurologis yang mirip dengan yang dilaporkan untuk

hipotiroidisme perkembangan. Pengamatan ini menunjukkan bahwa defisit terkait

dengan TH rendah selama pengembangan mungkin hasil dari diubah IGF-1 ekspresi di

mengembangkan otak. Untuk menguji ini, tikus waktunya hamil diobati dengan kelenjar tiroid

inhibitor dari hari kehamilan 16 (GD16) sampai hari postnatal 21 (P21) untuk menginduksi

negara hipotiroid. Satu set paralel tikus waktunya hamil tidak diobati digunakan sebagai

kontrol. Otak dari terkena dan kontrol anak anjing dikumpulkan pada P7, P14, P21, dan

P42 dan diproses untuk mendeteksi IGF-1 mRNA dengan isolasi RNA dan reverse

transcriptase kuantitatif real-time PCR. darah batang dikumpulkan untuk mengukur

serum tiroksin (T4) dengan ELISA. bobot tubuh dan jumlah bobot otak basah juga

diukur. Perkembangan tikus hipotiroid ditimbang secara signifikan kurang pada semua umur.

bobot otak basah secara signifikan lebih kecil pada tikus hipotiroid pada P7, P21, dan

P42. tingkat mRNA IGF-1 tidak berbeda secara signifikan di korteks dibandingkan dengan

kontrol eutiroid. Namun, tingkat IGF-1 mRNA secara signifikan menurun di

hippocampus pada P7, dan otak kecil di P14. Menariknya, tingkat IGF-1 mRNA

meningkat pada tikus hipotiroid di P42 di hippocampus. Karena pengobatan

goitrogens berhenti di P21, perbedaan terlihat di P42 adalah hasil dari TH permanen

Defisit selama pengembangan awal. Sejak hasil ini tidak tercermin dalam penurunan Igf-

1 ekspresi di P42 di kawasan manapun, dapat diasumsikan bahwa TH memiliki lebih kompleks
tindakan mekanistik dari sekedar mengatur IGF-1 ekspresi gen. Hal ini juga aman mengusulkan

IGF-1 otak ekspresi mRNA dipengaruhi oleh TH serum rendah; namun cara IGF-1 gen

ekspresi terganggu adalah regional dan temporal tertentu. Temuan ini mengidentifikasi

novel, sebelumnya unconsidered, mekanisme yang hormon tiroid

insufisiensi selama hasil pembangunan di defisit neurologis.

 Daftar Isi

pengantar 1

literatur 2

Hipotalamus-hipofisis-Thyroid Gland Axis 2

GHRH-GH-IGF Axis 4

Situs Tiroid Hormon dan IGF-1 Tindakan 5

TH dan IGF-1 Cross Bicara 8

Material dan metode 10

Perawatan hewan 10

Pengobatan hewan 10

Pengorbanan dan Diseksi 11

Analisis serum 11

Microdissection untuk Cortex dan Hippocampal Daerah 11

RNA Isolasi 13

Sintesis cDNA menggunakan transkripsi terbalik 14

Pengujian primer 14

Real Time QRT-PCR 15

Analisis statistik 15

hasil 17

RNA Pengujian Kualitas ... 17

Efisiensi primer 17

Tubuh dan Otak Berat 19

Beredar Tingkat T4 21

IGF-1 Ekspresi Sepanjang perkembangan saraf 21

Relatif IGF-1 mRNA Ekspresi ... 22

Diskusi 25

Perkembangan Hypothyroidism dan IGF-1 ... 27

kesimpulan 31

Referensi 33
 1

pengantar

Bawaan hipotiroidisme (CH) adalah suatu kondisi di mana seorang individu dilahirkan

dengan kurangnya sebagian atau lengkap dari fungsi kelenjar tiroid (Brent, 1999). Ini defisit

hormon tiroid (TH) terjadi pada sekitar 1 di 3500 kelahiran, dan jika tidak diobati, bisa

menyebabkan defisit neurologis permanen seperti IQ rendah (McMorris et al., 1986).

Beberapa baris bukti menunjukkan bahwa defisit neurologis permanen adalah

Hasil penurunan jumlah TH selama perkembangan otak pasca-natal janin dan awal

(Zoeller dan Rovet, 2004). Menariknya, penurunan produksi lokal insulin-seperti

faktor pertumbuhan 1 (IGF-1) di otak selama pengembangan dilaporkan untuk menghasilkan

defisit neurologis yang mirip dengan CH (Beck et al, 1995;.. Dyer et al, 2016).

Oleh karena itu masuk akal untuk menyarankan bahwa terganggu IGF-1 signaling, sebagai akibat penerbangan

hormon tiroid selama pengembangan, mungkin bertanggung jawab untuk beberapa permanen

defisit kognitif terkait di CH.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menganalisis IGF-1 ekspresi mRNA menggunakan kuantitatif

real-time reverse-transcription PCR dalam tiga sasaran terkenal aksi TH di

mengembangkan otak - korteks, hipokampus, dan otak kecil - dari hipotiroid dan eutiroid

tikus. Hipotesis kerja adalah bahwa: TH rendah selama pengembangan perinatal mengurangi

ekspresi temporal IGF-1 mRNA di korteks, hipokampus, dan otak kecil di

tikus hipotiroid bila dibandingkan dengan tikus wildtype . Hipotesis wajar adalah bahwa

pengurangan hipotiroidisme yang diinduksi di otak IGF-1 hasil mRNA di permanen

defisit neurologis diamati dalam CH.

 2

literatur

Hipotalamus-hipofisis-Thyroid Gland Axis

1. Ikhtisar

produksi hormon tiroid dikontrol oleh hipotalamus-hipofisis

kelenjar tiroid (HPT) axis (Zoeller et al., 2007). The HPT sumbu dilestarikan sepanjang

vertebrata dan didefinisikan dengan baik dalam model manusia dan murine. periventrikular yang

inti dari hipotalamus melepaskan hormon thyrotropin-releasing (TRH) ke dalam

sistem portal hypophyseal. Thyrotropes dari kelenjar hipofisis anterior menanggapi TRH

dengan melepaskan thyroid-stimulating hormone (TSH) ke dalam aliran darah. TSH bekerja pada

kelenjar tiroid merangsang produksi dan pelepasan TH. Tingkat sirkulasi

tingkat TH dalam serum secara ketat dikontrol oleh TH bertindak melalui umpan balik negatif pada

tingkat kelenjar hipofisis anterior dan hipotalamus.

Kelenjar tiroid mensekresi terutama dua bentuk TH: reseptor ligan aktif

triiodothyronine (T3) dan prohormon tidak aktif tiroksin (T4) (Zoeller et al., 2007).

Perbedaan antara aktif (T3) dan tidak aktif (T4) bentuk adalah jumlah iodida

(I-) anion konjugasi molekul tirosin, dengan empat I- di T4 dan tiga I- di T3. Semua

bentuk TH adalah hidrofobik, tetapi memerlukan transporter protein untuk bepergian di seluruh sel

membran. TH memasuki sel target di mana enzim deiodinase dapat memetabolisme TH ke

T3 aktif atau metabolit tidak aktif.

reseptor hormon tiroid (TRS) yang ligan diatur faktor transkripsi yang

kontrol ekspresi gen. Dua TRs ada di genom mamalia: hormon tiroid

reseptor-alfa (Thra, TRα) dan hormon tiroid reseptor-beta (Thrb, TRβ). TRS mengikat
 3

ke daerah-daerah DNA yang disebut elemen respon tiroid (tres). Juga terikat pada TRE adalah

reseptor lain, menciptakan baik heterodimer atau homodimer a. Sebuah homodimerization

akan dua TRs dari jenis yang sama. Sebuah heterodimerisasi akan baik dua yang berbeda

TRs, atau satu TR dan reseptor pelengkap lain seperti reseptor retinoic X (RXR)

atau vitamin D3 reseptor (VD3R). Selanjutnya, dikomplekskan kofaktor reseptor bergantung

pada negara TRS liganded dan dapat baik mengaktifkan (Co-A) atau menekan (Co-R) gen

transkripsi dengan adanya atau tidak adanya TH, masing-masing (Zoeller et al., 2007).

2. Peraturan deiodinase

Ketersediaan TH untuk mengatur ekspresi gen dikendalikan secara lokal di sel

oleh enzim deiodinase yang berbeda. Deiodinase 2 (DIO2) mengkonversi T4 tidak aktif menjadi aktif

T3 dengan menghapus iodida (I-) anion melalui lingkar luar 5'-deiodinasi (Zoeller et al.,

2007; Ng et al., 2013). Di otak, DIO2 yang didominasi dinyatakan dalam astrosit dan

tanycytes (Guadano-Ferraz et al., 1997). Deiodinase 3 (DIO3) fungsi untuk menonaktifkan

TH dengan menghapus anion I- benar dari T4, kemudian mengkonversi T4 untuk membalikkan-T3 (rT3)

dan T3 ke T2 (3,5-diiodo-L-thyronine). DIO3 terutama dinyatakan dalam neuron (Tu et

al., 1999). Dengan langsung mengatur jumlah T3, deiodinases bertindak parakrin sebuah

mode untuk secara tidak langsung mengatur TH gen responsif, yang telah ditunjukkan dalam beberapa

model hewan (Freitas et al., 2010).

4. Peraturan Receptor

Dikodekan oleh gen thra dan Thrb, TRs yang homolog selular dari virus

onkogen v-erb-Sebuah produk protein (Weinberger et al., 1986). thra mentranskripsi untuk

reseptor TRα1 dan TRα2, dan Thrb mentranskripsi TRβ1 dan TRβ2. TRα1, TRβ1, dan
 4

TRβ2 yang ligan mengikat faktor transkripsi yang berperan sebagai regulator langsung TH

ekspresi. TRα2 adalah non-ligan mengikat, yang berarti tidak dapat mengikat ligan yang diperlukan

subunit untuk mengatur ekspresi TH. TRs ditemukan di seluruh SSP di daerah tersebut

sebagai korteks, hipotalamus, hipokampus, striatum, dan otak kecil (Bradley et al.,

1992). Secara khusus TRα1 dinyatakan dalam mengembangkan dan neuron dewasa serta

mengembangkan sel-sel Purkinje dan tanycytes di otak kecil (Wallis et al., 2010). TRα1

mencakup semua T3 mengikat selama perkembangan otak janin sementara TRβ1 dan TRβ2 acara

ekspresi minimal dalam perkembangan otak janin (Bradley et al, 1992;. Yen, 2001). TRβ

meningkatkan empat puluh kali lipat dari lahir sampai dua minggu setelah lahir, dan tetap tinggi sepanjang

hidup (Yen, 2001). TRβ1 dan -β2 dapat ditemukan di neuron yang umpan balik pada HPT

sumbu untuk mengatur pelepasan TH sistemik (Flamant et al., 2006).

GHRH-GH-IGF Axis

1. Ikhtisar

Hormon pertumbuhan hipotalamus melepaskan releasing hormone (GHRH) ke

sistem hypophyseal portal, yang mengikat reseptor GHRH pada somatotropes dari

kelenjar hipofisis anterior. Sebagai tanggapan, kelenjar hipofisis anterior kemudian melepaskan pertumbuhan

hormone (GH), yang bekerja pada hati untuk memproduksi faktor pertumbuhan insulin-seperti 1 (IGF-1).

protein IGF adalah peptida kecil yang berbagi homologi terhadap insulin dan memiliki dua

isoform: IGF-1 dan IGF-2. faktor pertumbuhan seperti insulin beredar di plasma terpasang

untuk IGF mengikat protein (IGFBPs) dan harus dibebaskan dari IGFBP mengikat untuk sinyal.

IGFs Gratis mengikat reseptor IGF terletak di sel target untuk memperoleh tanggapan. Serum IGF-1

dikendalikan, di bagian, melalui umpan balik negatif pada tingkat hipotalamus,

 5

menghambat GHRH rilis. IGF-1 dan IGF-2 yang baik diperlukan untuk normal dalam rahim pertumbuhan,

tetapi hanya IGF-1 yang dibutuhkan untuk pengembangan postnatal (D'Ercole et al., 2002).

2. IGF-1 Reseptor

reseptor IGF-1 reseptor kinase tirosin mirip dengan struktur insulin

reseptor. Ada dua jenis reseptor IGF: IGF-1R dan IGF-2R. IGF-1R mengikat kedua

IGF-1 dan IGF-2, namun memiliki afinitas yang lebih tinggi untuk IGF-1, sedangkan IGF-2R hanya mengikat IGF-2. IGF-1R

menginduksi sel sinyal melalui jalur PI3K-Akt dan jalur Wnt untuk menginduksi

proliferasi sel (Wang et al., 2010). IGF-1R mencapai ekspresi puncak selama akhir

tahap embrio dan menurun ke tingkat basal segera setelah lahir (Feldman et al., 1997).

ekspresi IGF-1R adalah mirip dengan IGF-1 dengan ekspresi yang dijelaskan dalam korteks,

cerebellum, hippocampus, pleksus koroid, dan penciuman lampu (Feldman et al., 1997).

3. Protein IGF Binding

IGF-1 perjalanan ke seluruh tubuh terikat ke operator atau protein yang mengikat (IGFBPs).

Protein mengikat memberikan reservoir plasma protein IGF dan memperlambat

degradasi IGFs, yang pada gilirannya meningkatkan IGF-1 paruh. Ada enam BPs yang memiliki

afinitas mengikat tinggi untuk IGF-1: IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5,

dan IGFBP-6. Protein IGFBP ini, IGFBP-2 dan IGFBP-4 adalah yang paling melimpah

dalam sistem saraf pusat (Dyer et al., 2016). IGFBP-2 dan IGFBP-4 ekspresi puncak

selama perkembangan otak (Dyer et al., 2016), menunjukkan pentingnya kontrol ketat

IGF-1 tindakan selama waktu itu.

Situs Tiroid Hormon dan IGF-1 Tindakan

1. oligodendrocytes dan mielinisasi

 6

Tikus kurang IGF-1 acara kekurangan mielinisasi seluruh otak. korpus

menampilkan callosum menurun mielinisasi dan pengurangan ketebalan yang tidak proporsional

untuk ukuran otak sebesar 70%. Komisura anterior juga tidak proporsional menurun

total ukuran otak, dan saluran materi putih di sumsum tulang belakang yang menurun (Beck et

al., 1995). Efek itu diperkirakan disebabkan oleh jumlah total menurun

dari oligodendrocytes seluruh otak; Namun, mielinisasi tidak sepenuhnya

dihapuskan, menyarankan regulator lainnya mielinisasi. kultur sel otak diperlakukan

dengan IGF-1 juga menunjukkan meningkatnya jumlah oligodendrocytes, meningkat jumlahnya sebagai

dosis meningkat (Beck et al., 1995).

Demikian pula, mielinisasi berkurang pada hewan perkembangan hipotiroid, sebagai

TH memainkan peran penting dalam diferensiasi, proliferasi, dan pematangan

oligodendrocytes seluruh pembangunan (Rodriguez-Pena, 1999). Selanjutnya,

myelin-dasar-protein (MBP), komponen utama dari myelin, diatur langsung oleh TH

dengan TRE -186 ke -169 pasangan basa dari promotor MBP (Farsetti et al., 1991).

Oligodendrocytes, yang mengungkapkan MBP, yang menurun jumlahnya di bawah kondisi CH

seluruh pembangunan, dengan pengobatan pengganti TH terbukti berhasil di

menyelamatkan jumlah sel pada usia berapa pun (Schoonover et al., 2004). Secara kolektif, laporan ini

menunjukkan bahwa kedua TH dan IGF-1 memainkan peran penting dalam mengatur mielinisasi selama

neurodevelopment.

2. Parvalbumin Neuron

Pada tikus IGF-1 KO, neuron parvalbumin mengalami penurunan proporsional untuk

Total ukuran otak sebesar 50%. Secara khusus, dalam dentate gyrus dari hippocampus,

parvalbumin neuron berkurang sekitar 35%. Namun, sel-sel granul

 7

dari dentate gyrus berkurang total volume sebesar 59%; yang bisa sebagian

dikaitkan dengan hilangnya neuron parvalbumin. Hal ini menunjukkan bahwa IGF-1 terlibat dalam

generasi neuron granul dentate (Beck et al., 1995).

Dalam otak tikus perkembangan hipotiroid, pengurangan parvalbumin-

interneuron positif diamati di neokorteks dan hipokampus, tetapi tidak ada secara keseluruhan

perubahan neuron GABAergic terdeteksi (Gilbert et al., 2007). observasi ini

menunjukkan bahwa itu adalah bukan angka dari interneuron dipengaruhi oleh TH perkembangan

insufisiensi, bukan ekspresi fenotip parvalbumin dalam sel-sel ini. SEBUAH

penurunan interneuron parvalbumin-positif diamati di wilayah ini

selama periode perinatal dan menjadi dewasa bahkan setelah memulihkan eutiroid

negara. Selain itu, suntikan T4 selama awal postnatal parvalbumin periode penyelamatan

ekspresi (Gilbert et al., 2007). Mengingat hasil ini, IGF-1 dan TH keduanya

penting untuk pengembangan yang tepat dari interneuron parvalbumin selama otak

pengembangan.

3. Neurogenesis

ekspresi IGF-1 biasanya ditemukan di daerah di mana neurogenesis dewasa terjadi,

seperti hippocampus dan otak kecil; Namun, ekspresi dapat dideteksi sedini

embrio hari 18 (E18) dengan peningkatan bertahap sampai sekitar postnatal hari 20 (P20)

(D'Ercole et al., 2002). peningkatan ekspresi tajam dari IGF-1 dari P0 ke P14 kemudian

bertepatan dengan proliferasi neuron. Setelah P14 sekitar P30, penurunan IGF-1 untuk

tingkat dewasa sesuai dengan penurunan proliferasi neuron (Bartlett et al., 1991).
 8

TH juga penting untuk neurogenesis selama perkembangan janin dan postnatal.

Menurun TH selama awal embriogenesis mengarah ke migrasi neuronal terganggu di

korteks dan hipokampus, serta penurunan proliferasi sel glial dalam

cerebellum (Ausó et al, 2004;.. Martinez et al, 2011). Baru-baru ini, model

kekurangan yodium selama pertunjukan perkembangan janin ditingkatkan diferensiasi neuron di

zona subventricular dan hippocampus (Kapoor et al., 2012). Selama postnatal dan

neurogenesis dewasa, penurunan kadar TH menyebabkan penurunan mielinisasi,

synaptogenesis, dan migrasi neuronal dan diferensiasi (Preau et al., 2015). Itu

Efek dari penurunan TH pada neurogenesis yang mirip dengan penurunan IGF-1 tingkat

di daerah yang sama dari otak berkembang.

TH dan IGF-1 Cross Bicara

1. Fenotipik Kemiripan antara Bawaan Hypothyroidism dan IGF-1

Kekurangan Model Hewan

Penurunan yang tidak proporsional dalam tubuh dengan berat otak telah terlihat di IGF-1

tikus kekurangan, bersama dengan peningkatan jumlah bayi lahir mati di IGF-1 - / - tikus (Beck et

al., 1995). Karakteristik ini mirip dengan etiologi bawaan

hipotiroidisme, yang meliputi berat badan lahir rendah (Brent, 1999), pertumbuhan tulang yang terbatas,

dan Kretinisme, penyakit yang ditandai dengan tuli dan keterbelakangan mental ireversibel.

(Flamant et al., 2006).

2. Peraturan sistemik IGF-1 oleh Tiroid Hormon

Telah terbukti bahwa hormon tiroid secara langsung efek sistemik tingkat IGF-1

dan ekstra-hati IGF-1 produksi, yang telah dilaporkan pada hewan model.
 9

Penurunan tingkat TH menyebabkan tingkat menghambat GH beredar dan dengan demikian mengurangi

perifer IGF-1. Ada juga penurunan ekspresi reseptor hormon pertumbuhan

(GHR) mRNA di hati tikus hipotiroid (Chang et al., 2014), berpotensi menyebabkan

penurunan pelepasan IGF-1. Menariknya, IGF-1 tingkat hanya dikembalikan jika T3 atau T4 adalah

diberikan kembali (Chang et al., 2014) tetapi tidak GH sendiri (Burstein et al., 1979). hasil ini

menyarankan hormon tiroid rendah mengganggu sumbu GH-IGF pada tingkat sistemik.

3. Hormon Peraturan Tiroid dari Lokal Diproduksi IGF-1

Baru-baru ini telah dihipotesiskan bahwa hormon tiroid secara langsung mengatur Igf-

1 diproduksi dalam tulang, menunjukkan bahwa gangguan pertumbuhan pada hewan hipotiroid mungkin

Akibatnya, sebagian, dari mengurangi IGF-1. Sebuah studi yang berfokus pada akuisisi tulang pada tikus

mendukung gagasan bahwa tingkat prapubertas dari TH lebih penting daripada tingkat GH

untuk lokal IGF-1 produksi (Xing et al., 2012). Studi ini menunjukkan positif yang kuat

korelasi antara peningkatan pemberian perawatan T3 dan kenaikan tingkat Igf-

1 di tulang. Hal ini juga menunjukkan bahwa peningkatan alami dalam jumlah yang beredar T3

terjadi sesaat sebelum peningkatan IGF-1 dalam tulang selama pengembangan awal. Selanjutnya,

IGF-1 transkripsi juga terbukti secara langsung diatur oleh TRE pada gen IGF-1

yang dapat diaktifkan dengan TRα di osteoblas (Xing et al., 2012).

Di otak, Kline dan rekannya melaporkan penurunan IGF-1 sel positif di

motor korteks tikus perkembangan hipotiroid bila dibandingkan dengan eutiroid

tikus (Kline, 2016). Selain itu, studi ini melaporkan bahwa T4 dan serum IGF-1 tingkat yang

berkorelasi positif (Kline, 2016).

 10

Bersama-sama, bukti ini menunjukkan bahwa hormon tiroid yang beredar mengontrol

ekspresi baik lokal yang diturunkan dari otak dan hati (sistemik) IGF-1. Penemuan-penemuan ini

membawa saya ke hipotesis kerja saya bahwa: TH rendah selama pengembangan perinatal mengurangi

lokal yang diturunkan dari otak IGF-1 mRNA di korteks, hipokampus, dan otak kecil di

tikus hipotiroid bila dibandingkan dengan tikus wildtype . Hipotesis wajar adalah bahwa

pengurangan hipotiroidisme yang diinduksi di otak IGF-1 mRNA menghasilkan permanen

defisit neurologis diamati pada hipotiroidisme kongenital.

Material dan metode

Perawatan hewan

Penelitian ini menggunakan C57BL / 6J tikus. Strain yang sangat inbrida ini telah disediakan oleh

Jackson Laboratories. Semua prosedur eksperimental telah disetujui oleh Minnesota

State University, Mankato Kelembagaan Perawatan Hewan dan Komite Gunakan (IACUC).

Pengobatan hewan

bendungan hamil waktunya dibagi menjadi dua kelompok perlakuan: eutiroid (kontrol)

dan hipotiroid. Hypothyroidism di bendungan diinduksi dengan menyediakan air minum

mengandung 0,01% bovine serum albumin (BSA), 0,02% methimizole (MMI), dan 1%

potasium perklorat (KClO 4). Control (eutiroid) hewan menerima air minum

dengan 0,01% BSA saja. Perlakuan yang dimulai pada hari embrio 14,5 (E14.5)

dan berlanjut sampai hari postnatal 21 (P21). anak anjing eutiroid disapih dari mereka

ibu di P21 sementara anak anjing hipotiroid disapih di P35 untuk memungkinkan lebih lanjut

pengembangan. Ukuran sampel untuk setiap kelompok perlakuan pada setiap kali perkembangan
 11

Titik dinilai adalah n = 5. Dua sampel yang hilang selama pemrosesan, meninggalkan n = 4

untuk korteks dan hipokampus di P7.

Pengorbanan dan Diseksi

anak anjing eutiroid dan hipotiroid dikorbankan pada usia P7, P14, P21, dan P42.

Sesuai protokol, anak anjing eutanasia menggunakan CO 2 gas diikuti oleh pemenggalan kepala menggunakan

gunting tajam. Segera pemenggalan kepala berikut darah batang dikumpulkan dan

diizinkan untuk mengentalkan di atas es. Otak kemudian dengan hati-hati dibedah dari tengkorak dan

total berat otak basah diukur pada skala analitis. Berikutnya, otak kecil adalah

dihapus dari otak besar, ditempatkan dalam tabung 2 mL, beku di es kering, dan disimpan dalam -

80 Hai C freezer. Otak yang tersisa bersamaan beku di es kering dan disimpan

pada -80 Hai C sampai microdissection bisa terjadi.

Analisis serum

darah batang dikumpulkan pada semua umur eksperimental diselidiki. Seluruh darah

diizinkan untuk mengentalkan atas es basah untuk tidak kurang dari 20 menit dan tidak lebih dari satu

jam. Serum diisolasi oleh pemusingan darah batang selama 10 menit pada delapan relatif

gaya sentrifugal (RCF) dan disimpan pada -20 Hai C sampai assay enzyme-linked immunosorbent

(ELISA) dapat dilakukan untuk mengukur tingkat sirkulasi hormon. A T4 Manusia

ELISA Uji Kit digunakan untuk menganalisis kadar T4 dalam serum, berikut produsen

protokol. konsentrasi yang dihasilkan dihitung berdasarkan standar uji.

Microdissection untuk Cortex dan Hippocampal Daerah

sampel jaringan otak beku yang dipasang di Suhu Cutting Optimal

(Oktober) Compound dan dipotong pada bidang koronal pada 20 mikron sampai korpus
 12

callosum dapat diidentifikasi dengan pewarnaan biru metil. Setelah tercapai, otak adalah

dihapus dari senyawa Oktober, ditempatkan di 1mm matriks otak mengandung koronal

interval, dan sepotong memperluas posterior 1mm dari corpus callosum dikumpulkan

di bregma 1.09mm dan 4.88mm Interaural. Menggunakan atlas Allen-Brain,

microdissection dari korteks motor termasuk menghilangkan jaringan kalah dengan korpus

callosum, dan jaringan lateral motor korteks (Gambar 1A). berikut korteks

koleksi, otak kemudian remounted di Oktober dan langkah-langkah microdissection yang

diulang untuk mengumpulkan hippocampus di bregma -1,43 mm dan Interaural 2.36mm

(Gambar 1B). sampel jaringan otak dikumpulkan selama lima ekor anak pada setiap interval usia.

Bagian ditempatkan dalam tabung koleksi dan segera dihomogenisasi dengan 900μl dari

QIAzol Lisis Reagen menggunakan rotor stator Homogenizer selama 30 sampai 60 detik. Itu

homogenat diproses kemudian disimpan pada -80 ° C sampai RNA isolasi bisa terjadi.

Gambar 1. bagian Coronal otak murine. Daerah diuraikan dalam merah mewakili daerah microdissected motor korteks
dan corpus callosum (kiri) dan juga hippocampus (kanan). Daerah diidentifikasi menggunakan Allen-Otak Atlas.
 13

RNA Isolasi

Prosedur isolasi RNA mengikuti protokol yang disediakan oleh Qiagen

RNeasy Ditambah Universal Handbook: RNeasy Ditambah Universal Mini Kit dengan beberapa

modifikasi. jaringan dibedah digabungkan dengan 900μl dari QIAzol Lisis Reagen

dan homogen menggunakan homogenizer rotor stator selama sekitar 30 detik sampai

homogen. Homogenat kemudian disimpan pada -80 ° C tidak lebih dari lima hari

sampai pengolahan RNA bisa melanjutkan. Setelah suhu kamar tujuh menit

inkubasi setelah pencairan, 100μl gDNA Eliminator Solusi ditambahkan ke

homogenat dan dikocok dengan kuat selama 15 detik. 180μl kloroform ditambahkan

dan dikocok lagi selama 15 detik. homogenat diinkubasi pada suhu kamar

selama dua menit diikuti dengan sentrifugasi pada 12.000 xg selama 15 menit pada 4ºC. Itu

lapisan air dipindahkan ke tabung 2ml baru, 600μl dari 70% etanol ditambahkan dan

dicampur dengan pipetting. Sampel kemudian dipindahkan ke spin kolom RNeasy Mini

dan disentrifugasi selama 15 detik pada 10.000 rpm. Tambahan DNase on-kolom

pengobatan selesai untuk otak kecil saja. RNA dimuat kolom kemudian mencuci

dengan 700μl dari disiapkan penyangga RWT dan kemudian dua kali dengan 500μl dari Buffer RPE. sampel

kemudian disentrifugasi dengan kecepatan penuh selama satu menit untuk menghilangkan penyangga yang tersisa.

RNA dielusi dari kolom dengan menambahkan 30μl air RNase bebas dan

disentrifugasi pada 10.000 rpm selama satu menit. Untuk otak kecil, sebuah 30μL tambahan

elusi dengan air RNase bebas selesai. Untuk jaringan otak, awal 30μL

elusi digunakan kembali untuk kedua kalinya untuk mengelusi setiap RNA yang tersisa. Konsentrasi RNA adalah

ditentukan dengan menggunakan spektrofotometer dan sampel kualitas ditentukan dengan menggunakan 1%

dikelantang-agarosa gel elektroforesis. 1% pemutih rumah tangga (8,25% natrium

 14

hipoklorit) ditambahkan ke gel untuk menstabilkan degradasi RNA terhadap

ribonucleases (Aranda et al., 2012). sampel cerebellar kemudian diencerkan tiga kali lipat

dengan air RNase bebas. Sampel RNA disimpan pada -80 ° C.

Sintesis cDNA menggunakan transkripsi terbalik

mRNA diisolasi terbalik ditranskripsi menjadi cDNA sesuai dengan superscript

IV VILO Guru Mix protokol. Setiap campuran reaksi termasuk 4μL dari superscript IV

VILO Guru Mix, 1μg mRNA, dan diisi dengan total 20μL dengan air RNase bebas.

Sampel diinkubasi pada 25 ° C selama 10 menit, suhu kemudian meningkat ke

50 ° C selama 10 menit, dan akhirnya meningkat lagi menjadi 85 ° C selama 5 menit. Proses ini

anil oligonukleotida ke mRNA, membalikkan ditranskripsikan RNA, dan

tidak aktif enzim reverse transcriptase.

Pengujian primer

IGF-1 primer mRNA digunakan pada konsentrasi 0.3μM dan 0.5μM di

sampel cDNA eutiroid dan hipotiroid yang baik diencerkan pada rasio 1: 1 dengan

air atau disimpan rapi. Primer yang diperkuat dengan sampel cDNA menggunakan PCR standar

amplifikasi 40 pengulangan dari 95 ° C selama 15 menit, 94 ° C selama 15 detik, 60 ° C untuk

15 detik, dan 72 ° C selama 30 detik. Tabel 1 menunjukkan masing-masing primer diuji maju dan

urut terbalik, nomor aksesi, dan ukuran band.

 15

Urutan aksesi # Ukuran

primer A F: CTGGACCAGAGACCCTTTGC R: NM_010512.5 268 bp
(Harvard GGACGGGGACTTCTGAGTCTT
Bank)
primer B F: CAACTCCCAGCTGTGCAATT R: NM_001111276.1 165 bp
(Ge et al., GCCAGGTGAACACAAAACT
2015)
primer C F: TGGATGCTCTTCAGTTCGTG R: NM_010512.5 112 bp
(Omazic et al., GCAACACTCATCCACAATGC
2001)

Tabel 1. IGF-1 Primer. Semua primer cocok untuk IGF-1 transkrip varian satu mRNA. Primer A diambil dari Harvard Bank dan memiliki
panjang amplikon diprediksi dari 268 pasangan basa. Primer B (Ge et al., 2015) dan primer C (Omazic et al., 2001) yang ditemukan dari
penelitian sebelumnya dan memperkirakan ukuran band 165 dan 112 pasangan basa.

Real Time kuantitatif-reverse transcriptase Polymerase Chain Reaction

qPCR dilakukan dengan menggunakan PowerUp SYBR Hijau PCR mastermix, yang disediakan oleh

Thermo Scientific. kurva efisiensi primer dijalankan menggunakan pengenceran sepuluh kali lipat untuk kedua

set primer: IGF-1 dan PPIA. Sampel akan berlapis oleh daerah otak dan kemudian

lanjut yang diselenggarakan oleh usia, untuk total enam piring qPCR, dua piring per wilayah. Itu

kurva standar adalah pengenceran lima kali lipat dari satu sampel dari cDNA, yang digunakan pada

setiap piring untuk menormalkan perbedaan lintas-plating potensial.

Analisis statistik

1. Berat Badan dan Total Basah Otak Berat

Sebuah ANOVA dua arah dengan pengobatan dan usia sebagai faktor digunakan untuk menganalisis pup

bobot tubuh pada P7-P21 (data gabungan dengan (Kline, 2016) untuk ukuran sampel n = 95).

Sebuah Sidak pasca-hoc t-test dikoreksi untuk beberapa perbandingan setelah dua arah

ANOVA. sampel P42 dianalisis menggunakan t-test tidak berpasangan. Total bobot otak basah

dianalisis dengan cara yang sama seperti berat badan, dengan ukuran sampel n = 39.
 16

2. ELISA Analisis

Jumlah kadar serum T4 dianalisis menggunakan metode kurva standar.

sampel eksperimental berarti nilai absorbansi kemudian diinterpolasi dari

standar yang sesuai. Sebuah dua arah ANOVA digunakan untuk menentukan statistik

efek yang signifikan dari usia, pengobatan, dan interaksi untuk sampel antara P7-P21. SEBUAH

Sidak pasca-hoc t-test kemudian digunakan untuk menentukan perbedaan yang signifikan antara

kelompok perlakuan pada setiap usia. Konsentrasi di P42 dianalisis menggunakan berpasangan

uji t-test untuk mendeteksi perbedaan yang signifikan antara kelompok perlakuan.

3. Kuantifikasi Relatif IGF-1 mRNA Levels

kuantitas IGF-1 mRNA ditentukan melalui metode kurva standar untuk qRT-

PCR. Nilai efisiensi ditentukan dengan menggunakan sampel kalibrator cDNA yang

menjalani proses yang sama seperti cDNA eksperimental tapi serial diencerkan lima kali lipat

total lima kali (100ng / uL, 20ng / uL, 4NG / uL, 0.8ng / uL, dan 0.16ng / uL). Relatif

jumlah mRNA eksperimental kemudian bisa dikalibrasi sesuai dengan jumlah

diproduksi oleh kurva standar. Sama standar kurva pengenceran set dijalankan pada semua

piring sampel eksperimental untuk menormalkan untuk analisis lintas-piring.

Kuantitas relatif IGF-1 mRNA kemudian dianalisis menggunakan dua arah

ANOVA untuk menentukan efek signifikan dari waktu, pengobatan, dan interaksi antara

usia P7-P21. Sebuah Sidak pasca-hoc t-test digunakan untuk mengoreksi beberapa perbandingan

untuk menentukan perbedaan yang signifikan antara perawatan. IGF-1 tingkat mRNA pada usia

P42 dianalisis menggunakan t-test berpasangan untuk menentukan perbedaan yang signifikan

antara kelompok perlakuan.

 17

hasil

RNA Pengujian Mutu menggunakan Bleach-Agarose Gel Elektroforesis

Tidak ada DNA genomik hadir sepanjang sumur di korteks (Gambar 2A), yang

hippocampus (Gambar 2B), atau otak kecil (Gambar 2C). Kedua 28S dan 18S rRNA

band juga terlihat jelas di sekitar 1.325 kDa dan 750 kDa tanpa

mengolesi, menunjukkan RNA kualitas tinggi (Gambar 2).

Gambar kualitas 2. RNA diuji dengan menggunakan 1% pemutih-agarose gel elektroforesis. Korteks (kiri), hippocampus (tengah),
dan otak kecil (kanan) semua memiliki berbeda 28S dan 18S bandeng. A 1 Kb ditambah DNA tangga digunakan sebagai referensi.

Efisiensi primer

Ketiga diprediksi ukuran band IGF-1 primer mRNA cocok hasil gel,

dengan tidak ada perbedaan dalam amplifikasi antara konsentrasi primer atau pengenceran cDNA

(Gambar 3). Berdasarkan pengamatan ini, primer digunakan di 0.3μM dengan murni

cDNA untuk memastikan amplifikasi kuat dengan potensi setidaknya untuk primer terkait

anomali.
 18

Gambar 3. IGF-1 mRNA transkrip varian 1 pengujian konsentrasi primer. Standar PCR amplifikasi digunakan
dengan diencerkan dan murni, sampel cDNA eutiroid dan hipotiroid untuk menguji primer-to-cDNA rasio konsentrasi
yang paling efisien.

Yang dipilih IGF-1 Primer C (Omazic et al., 2001) dan kontrol primer PPIA

(Cyclophilin-A) kemudian diuji oleh QRT-PCR untuk efisiensi amplifikasi pada

sampel eutiroid diencerkan sepuluh kali lipat lima kali (100ng / uL, 10ng / uL, 1NG / uL, 0.1ng / uL,

dan 0.01ng / uL). Seperti ditunjukkan dalam Gambar 4, ambang kritis IGF-1 Primer C

amplifikasi adalah C t = 18, sedangkan C t = 12 untuk primer PPIA. Amplifikasi semua lima

pengenceran serial pada siklus yang sama menunjukkan hanya gen target yang diamplifikasi, yang berarti

primer yang efisien dan spesifik.

 19

Gambar 4. IGF-1 mRNA dan PPIA primer amplifikasi plot. Primer khusus diperkuat dipilih IGF-1 mRNA urutan
(atas) dari semua sampel jaringan. Eksperimental gen kontrol cyclophilin-A, PPIA (bawah), juga menunjukkan
amplifikasi spesifik.

Tubuh dan Otak Berat

Sebuah efek yang signifikan usia (F ( 2,74) = 121,2, p <0,0001) dan pengobatan (F ( 1,74) =

80,91, p <0,0001) ditemukan untuk bobot tubuh. Interaksi juga signifikan

(F ( 3,94) = 18,88, p <0,0001). Sebuah Sidak pasca-hoc t-test deteremined signifikan

penurunan hipotiroid berat pup tubuh di P7 (t = 2,457, p = 0,0482), P14 (t = 4,325,

p = 0,0001), dan P21 (t = 8.70, p <0,001). Sebuah t-test berpasangan ditentukan signifikan

penurunan hipotiroid berat pup tubuh dibandingkan dengan anak anjing eutiroid di P42 (t = 8,298

p <0,0001 (Gambar 5A)).

Sebuah efek yang signifikan usia (F ( 2,27) = 62,63, p <0,0001) dan pengobatan (F ( 1,27) =

10.58, p = 0,0031) diamati untuk bobot otak basah (Gambar 5B). anak anjing hipotiroid
 20

memiliki bobot otak secara signifikan lebih rendah bila dibandingkan dengan kontrol sama sekali perkembangan

titik waktu kecuali untuk P14. Hasil ini menunjukkan bahwa anjing hipotiroid adalah

secara signifikan perkembangan terhambat dalam pertumbuhan dibandingkan dengan kontrol eutiroid. Lebih

penting, ukuran pertumbuhan terbelakang bertahan dalam anjing hipotiroid setelah mereka disapih

dari goitrogens.

Gambar berat badan 5. Tubuh dan jumlah perbedaan berat otak basah antara tikus
perkembangan eutiroid dan hipotiroid.
Rata-rata berat badan (atas) dengan pengorbanan dan rata-rata berat otak basah (bawah)
dianalisis menggunakan ANOVA dua arah dengan tes posthoc Sidak. berat badan secara
signifikan berkurang pada semua umur pada tikus hipotiroid dibandingkan dengan eutiroid.
bobot otak basah juga menurun secara signifikan pada tikus hipotiroid pada usia P7, P21, dan
P42. * P <0,05, *** p <0,001, **** p <0,0001
 21

Beredar Tingkat T4

Sebuah efek yang signifikan ditemukan untuk usia (F ( 2,30) = 38,64, p <0,0001), pengobatan

(F ( 1,30) = 461,80, p <0,0001), dan interaksi (F ( 2,30) = 38,11, p <0,0001). Sana

penurunan yang signifikan dari beredar T4 di anak anjing perkembangan hipotiroid di

usia P7, P14, dan P21. Pada P42, berikut penarikan goitrogens di P21, tidak ada

perbedaan yang signifikan antara perlakuan dan kontrol hewan diamati; menunjukkan

anak anjing diperlakukan kembali ke keadaan eutiroid (Gambar 6).

Gambar 6. Serum T4 pada tikus perkembangan eutiroid dan hipotiroid. Sebuah dua arah
ANOVA dan uji post hoc sebuah Sidak ini ditentukan penurunan yang signifikan dalam tingkat
sirkulasi T4 pada usia P7, P14, dan P21 pada tikus hipotiroid. Tidak ada signifikansi ditemukan
di P42 usia menggunakan uji t berpasangan. **** p <0,0001

IGF-1 Ekspresi Sepanjang perkembangan saraf

Untuk memahami perubahan IGF-1 tingkat mRNA selama perkembangan otak,

IGF-1 tingkat mRNA relatif diperoleh QRT-PCR dari tikus eutiroid dianalisis

oleh dua arah ANOVA untuk usia P7-P42 menggunakan wilayah otak dan usia perkembangan sebagai
 22

faktor. Ada pengaruh yang signifikan usia (F ( 3,45) = 53,74, p <0,0001), dan daerah

(F ( 3245) = 12,02, p <0,0001), bersama dengan interaksi antara dua variabel (F ( 6,45)

= 6,968, p <0,0001) yang berarti efek pengobatan tergantung pada usia. Sebuah pasca Sidak

tes hoc ditentukan bahwa korteks memiliki ekspresi gen relatif signifikan lebih besar

dibandingkan dengan otak kecil dan hippocampus di P14.

//
//

Gambar 7: Relatif IGF-1 mRNA ekspresi dalam kondisi eutiroid dalam mengembangkan
motorik korteks, hipokampus, dan otak kecil. IGF-1 ekspresi gen itu dinormalisasi ke tingkat
PPIA mRNA. 2-way ANOVA menemukan efek yang signifikan dan interaksi usia dan
pengobatan. Sebuah Sidak tes post-hoc ditentukan peningkatan yang signifikan dalam IGF-1
ekspresi di korteks di P14 dibandingkan dengan ekspresi di hippocampus dan otak kecil.

*** * P <0,0001.

Relatif IGF-1 mRNA Ekspresi bawah eutiroid dan Hipotiroid Kondisi

1. motor Cortex

tingkat kortikal IGF-1 mRNA dianalisis menggunakan ANOVA dua arah untuk usia

P7-P21 (Gambar 8). Sebuah efek yang signifikan usia (F ( 2,23) = 11,61, p = 0,0003) terlihat di

korteks; namun, tidak ada pengaruh yang signifikan dari pengobatan atau interaksi antara

dua. Sebuah Sidak post-hoc t-test menunjukkan tidak ada perbedaan tingkat IGF-1 mRNA setiap
 23

usia diselidiki dalam korteks berkembang. Tidak ada perbedaan signifikan yang diamati pada

usia P42.

// //

Gambar 8. Relatif IGF-1 ekspresi di korteks berkembang selama perkembangan saraf. Sebuah
dua arah ANOVA dan uji post-hoc sebuah Sidak ini tidak menemukan perbedaan yang signifikan
antara tikus hipotiroid dan eutiroid pada usia P7-P21. Sebuah uji t berpasangan menemukan
perbedaan yang signifikan antara kelompok di P42.

2. Hippocampus

Dalam hippocampus berkembang, ada pengaruh yang signifikan dari usia (F ( 2,23) =

19,39, p <0,0001) dan interaksi yang signifikan (F ( 2,23) = 8,466, p = 0,0018) antara

usia dan pengobatan. IGF-1 tingkat mRNA secara signifikan berkurang (t = 3,687, p =

0,0037) pada P7 pada tikus hipotiroid bila dibandingkan dengan tikus eutiroid. Ekspresi gen

tingkat antara tikus hipotiroid dan eutiroid tidak berbeda secara signifikan di P14 atau

P21. Pada P42, tingkat IGF-1 mRNA meningkat secara signifikan (t = 4,485, p = 0,0028)

pada hewan perkembangan hyopthyroid dibandingkan dengan perkembangan eutiroid.

 24

Gambar 9. Relatif IGF-1 mRNA ekspresi dalam hippocampus berkembang di bawah

kondisi hipotiroid dan eutiroid. Usia P7-P21 dianalisis menggunakan ANOVA dua arah
dan post-hoc tes Sidak ini. tingkat mRNA IGF-1 secara signifikan berkurang pada tikus
hipotiroid pada P7. Sebuah uji t tidak berpasangan di P42 usia ditentukan secara signifikan
mengurangi IGF-1 ekspresi gen pada tikus perkembangan eutiroid dibandingkan dengan
tikus hipotiroid. ** p <0,01

3. Cerebellum

Di otak kecil, IGF-1 tingkat mRNA menunjukkan efek signifikan usia (F ( 2,24)

= 137,3, p <0,0001), tetapi tidak ada efek pengobatan atau interaksi (Gambar 10). SEBUAH

penurunan yang signifikan dalam otak IGF-1 tingkat di P14 ditemukan di perkembangan

tikus hipotiroid (t = 2,838, p = 0,0270) bila dibandingkan dengan kontrol eutiroid. Sana

Tidak ada perbedaan yang signifikan antara kelompok perlakuan pada setiap usia lainnya.
 25

Gambar 10. Relatif IGF-1 mRNA ekspresi dalam otak kecil berkembang. Sebuah dua arah ANOVA
menemukan usia berpengaruh signifikan, namun tidak berpengaruh signifikan dari pengobatan atau
interaksi untuk usia P7-P21. Sebuah Sidak tes post-hoc ditentukan penurunan yang signifikan dari IGF-1
ekspresi gen di P14 pada tikus hipotiroid bila dibandingkan dengan kontrol eutiroid. Sebuah uji t tidak
berpasangan ditentukan tidak ada perbedaan yang signifikan antara kelompok di P42. * P <0,05

Diskusi

Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa rendah TH mengurangi jumlah serum IGF-1

(Burstein et al, 1979;.. Chang et al, 2014) dan jaringan yang diturunkan IGF-1 (Xing et al, 2012.;

Kline, 2016). Peraturan serum IGF-1 terjadi dengan cara GH disekresikan dari

kelenjar hipofisis dan kemampuannya untuk mengikat reseptor GH hati, yang TH rendah telah

terbukti menurunkan (Chang et al., 2014). Dalam tulang, TH, bukan GH, tampaknya langsung

mengatur kadar diproduksi secara lokal IGF-1 (Xing et al., 2012). Namun, apakah ini

kasus pada jaringan ekstra-hepatik lainnya, seperti otak, yang belum ditentukan.

Hypothyroidism didefinisikan sebagai rendahnya tingkat T4 dan T3 dalam serum. klinis dan

tanda-tanda eksperimental hipotiroidisme CH dan perkembangan termasuk penurunan tubuh

dan berat otak. Dalam percobaan saat ini, pengobatan GOITROGEN mengakibatkan

T4 secara signifikan lebih rendah serum, berat badan, dan berat otak; menunjukkan tikus yang
 26

diobati dengan goitrogens memang terang-terangan hipotiroid. kadar serum T4 dari

perkembangan tikus hipotiroid kembali normal di P42 setelah goitrogens berada

dihapus di P21; oleh karena itu, masuk akal untuk menyarankan perbedaan terlihat di P42 adalah

cacat permanen akibat TH rendah selama pembangunan. Ide ini didukung

oleh penurunan diamati di otak dan tubuh berat di P42 di perkembangan

tikus hipotiroid dibandingkan dengan tikus eutiroid.

Meskipun hewan percobaan kami menunjukkan tanda-tanda yang jelas dari hipotiroidisme terang-terangan,

perlu dicatat bahwa jaringan tingkat TH dapat diatur secara lokal, tindakan TH uncoupling

di jaringan dari tingkat sirkulasi T4. Bahkan dengan T4 serum menurun, kompensatoris

mekanisme seperti enzim deiodinase tipe II dapat meningkatkan T3 aktif dalam jaringan,

yang telah dicatat untuk mamalia CNS berkembang (Silva dan Larsen, 1982).

Namun, setelah hewan menjadi terang-terangan hipotiroid, mekanisme kompensasi

gagal untuk meningkatkan T3 jaringan ke tingkat normal, mengakibatkan hipotiroidisme jaringan (Silva dan

Larsen, 1982). Penelitian sebelumnya juga telah menunjukkan korelasi langsung antara beredar

jumlah T4 dengan serum IGF-1 (Kline, 2016) menunjukkan bahwa tidak lengkap

mekanisme kompensasi untuk hipotiroidisme perkembangan yang jelas juga akan paling

kemungkinan besar akan gagal di kompensasi untuk penurunan akibat dari IGF-1.

Kekurangan baik IGF-1 atau TH menyebabkan cacat perkembangan yang sama.

Karena model IGF-1 knockout memiliki tingkat kematian yang tinggi, model kekurangan serum

IGF-1 dianggap standar. Ames dan Snell tikus mutan spontan yang melayani

model sebagai eksperimental serum defisiensi IGF-1 yang juga terjadi untuk menjadi kekurangan

TH. Model ini mengalami penurunan berat badan, cacat neuroanatomical, dan

masalah kognitif dan sensorik sebagai orang dewasa (Carter et al., 2002). Karena Ames dan
 27

model Snell menunjukkan defisit kognitif dan neurologis ketika serum IGF-1 berkurang,

meskipun tingkat jaringan otak tetap tidak berubah, adalah wajar untuk menunjukkan bahwa

Kekurangan TH bisa langsung atau tidak langsung bertanggung jawab atas defisit neurologis

karena kedua model kekurangan TSH. Selain itu, IGF-1 model KO hati-spesifik

yang secara acak menghapus urutan gen yang mengkode serum IGF-1, menurunkan kadar serum oleh

75%; Namun, tingkat jaringan IGF-1 lokal untuk model ini di jantung, otak, ginjal, dan

lemak tidak menunjukkan perubahan ekspresi meskipun serum IGF-1 tingkat dikurangi (Carter

et al., 2002).

Perkembangan Hypothyroidism dan IGF-1 mRNA Ekspresi

TH sangat penting untuk perkembangan otak normal. perkembangan otak yang abnormal di

Menanggapi TH rendah dianggap hasil ekspresi gen diubah. Mengingat

laporan yang diusulkan peraturan langsung dari IGF-1 oleh reseptor hormon tiroid dalam tulang

dan cacat neuroanatomical sama antara TH rendah dan rendah IGF-1 (Xing et al.,

2012), kami berusaha untuk mengkarakterisasi pengaruh TH rendah dalam pengembangan berasal lokal

IGF-1.

1. motor Cortex

pola ekspresi Temporal menunjukkan puncak yang sama dan menurun di bawah kedua

kondisi pengobatan. Tingkat meningkat dari P7 ke puncak pada P14, diikuti dengan dramatis

menurun sampai P42. Meskipun ada perbedaan statistik dalam kortikal IGF-1 mRNA adalah

diamati antara tikus perkembangan hipotiroid dan eutiroid, tren mendukung

penurunan IGF-1 ekspresi mRNA dalam kondisi hipotiroid. Peningkatan

Ukuran sampel berpotensi memberikan kekuatan untuk mencapai signifikansi statistik.

 28

Meskipun demikian, pengamatan ini tidak konsisten dengan laporan lainnya yang menunjukkan

mengurangi kortikal IGF-1 mRNA (Elder et al., 2000) dan IGF-1 sel positif (Kline, 2016).

Kedua mikroglia dan oligodendrocytes adalah regulator penting dari Igf- tersedia

1 mRNA dan protein tingkat selama perkembangan postnatal awal (Wilkins et al., 2001;

Ueno et al., 2013). Mereka juga kedua target dari TH sinyal selama perkembangan otak

(Lima et al, 2001;.. Schoonover et al, 2004). Sangat terakumulasi dalam saluran materi putih

seperti corpus callosum, mikroglia menghasilkan IGF-1 yang mengarah ke kelangsungan hidup neuron

selama pengembangan. Ketika mikroglia yang transfected dengan IGF-1 siRNA, menurun

kelangsungan hidup neuron diikuti penurunan tingkat mRNA IGF-1 (Ueno et al., 2013).

Namun, pada tikus di mana tanggapan mikroglia yang tidak teregulasi berikut

reseptor fractalkine Cx3cr1- defisiensi, kelangsungan hidup neuron menurun berikut ada

perubahan IGF-1 tingkat mRNA. Ueno dan rekan menemukan meskipun tingkat IGF-1 mRNA

tidak berubah, protein IGF inhibitor IGFBP5 adalah diregulasi. peningkatan regulasi ini

dari protein yang mengikat membatasi ketersediaan bebas IGF-1 protein untuk mengaktifkan reseptor

menyebabkan apoptosis neuronal di hadapan tingkat IGF-1 mRNA normal.

Oligodendrocytes bisa menjalani proses serupa, yang juga sangat

akumulasi dekat saluran materi putih, berpotensi menjelaskan mengapa tidak ada

perbedaan yang signifikan terlihat pada IGF-1 tingkat mRNA antara masing-masing kelompok perlakuan.

Studi berfokus pada IGF-1 sel positif dalam korteks motor ditemukan sel statistik kurang

pada tikus perkembangan hipotiroid bila dibandingkan dengan kontrol (Kline, 2016),

menyarankan kompensasi mungkin dalam produksi IGF-1 mRNA oleh tersisa IGF-1

Sel-sel yang positif untuk mengembalikan keseluruhan IGF-1 ekspresi. Namun, belum ditentukan
 29

jika jenis sel ini termasuk mikroglia, dan tidak diketahui apakah perkembangan

hipotiroidisme menyebabkan disregulasi mikroglia.

percobaan berikutnya berfokus pada tingkat IGF-1 protein harus dilakukan

seluruh korteks untuk membandingkan lokasi mRNA dan jumlah itu protein

tingkatan untuk lebih memahami IGF-1 mekanisme. sel positif IGF-1 juga bisa menjadi

diidentifikasi sebagai jenis sel tertentu untuk menentukan apakah efek hipotiroidisme perkembangan

produksi IGF-1 mRNA berbeda di masing-masing jenis.

2. Hippocampus

Temporal, kami mengamati IGF-1 tingkat mRNA di hippocampus memuncak di P7,

kemudian menurun sampai P21 ketika ekspresi mencapai tingkat dewasa diukur pada P42. Di

P7, IGF-1 mRNA dalam hippocampus tikus eutiroid secara signifikan lebih tinggi daripada

pada tikus hipotiroid. Meskipun IGF-1 mRNA pada hewan eutiroid menurun,

ekspresi di bawah kondisi hipotiroid memuncak di P14 dan melampaui eutiroid

tingkat mRNA. Meskipun lebih tinggi IGF-1 tingkat mRNA pada usia ini serta P21 adalah

tidak signifikan, IGF-1 ekspresi secara statistik lebih tinggi pada P42 berikut

hipotiroidisme perkembangan.

Hasil ini bisa menunjukkan pergeseran temporal IGF-1 ekspresi selama

pengembangan. Dalam kondisi normal, IGF-1 mRNA tingkat puncak awal dan musim gugur sampai

masa dewasa. Namun, dalam kondisi hipotiroid, IGF-1 tingkat puncak sampai P14 agak

dari P7, dan kemudian mulai jatuh. Ini tertunda puncak dalam ekspresi dapat dikaitkan dengan

ketersediaan T3 rendah. Pergeseran yang sama dalam ekspresi temporal mielinisasi bawah

kondisi hipotiroid telah dilaporkan sebelumnya (Rodriguez-Pena et al., 1993).

 30

Namun, apakah ekspresi tertunda IGF-1 terkait dengan mielinasi diubah

(Atau sebaliknya) masih harus diuji.

Lebih dari setengah dari semua ketersediaan T3 di otak berasal dari konversi T4

oleh Dio2 (Bernal, 2015). Mengingat ini, orang bisa berspekulasi bahwa kemampuan Dio2

kegiatan untuk meningkatkan berikut hipotiroidisme perkembangan, dan moderat

perubahan T3 otak, juga dapat perkembangan diatur. Artinya, peningkatan Dio2

aktivitas mungkin hanya terjadi setelah P7, tetapi sebelum P14. Hasil tersebut akan meningkatkan

jumlah T3 setelah P7, sehingga menunda ekspresi puncak dari IGF-1 mRNA. keterlambatan ini

akan menyebabkan penurunan melambat untuk dewasa IGF-1 tingkat, berpotensi menyebabkan lebih tinggi

jumlah IGF-1 mRNA pada tikus hipotiroid menjadi dewasa. tingkat protein dari Dio2

serta tingkat mRNA dari T3 harus diperiksa pada jaringan saraf, termasuk

hippocampus, dalam rangka untuk menjelaskan perbedaan tersebut.

3. Cerebellum

ekspresi serebelum IGF-1 pada P7 adalah serupa di antara eutiroid dan

hewan hipotiroid, bertentangan temuan sebelumnya dari tingkat mRNA menurun

selama hipotiroidisme (Elder et al., 2000). Ketidakkonsistenan ini bisa disebabkan

perbedaan perlakuan GOITROGEN. Namun, lebih mungkin, perbedaan ini disebabkan oleh

sensitivitas uji yang digunakan untuk mengukur tingkat IGF-1. rekan Penatua dan menggunakan

ribonuklease perlindungan assay, yang kurang sensitif dibandingkan RT-QRT-PCR pada penentuan

tingkat mRNA.

Setelah P7, penurunan dramatis dalam IGF-1 ekspresi terlihat di kedua eutiroid

dan kondisi hipotiroid, plateauing dari P14 ke P42. anak anjing hipotiroid menunjukkan
 31

tren penurunan kadar IGF-1 mRNA bila dibandingkan dengan anak anjing eutiroid, tapi

hanya statistik signifikan pada P14. Dengan jumlah yang menurun secara keseluruhan IGF-1 gen

ekspresi di bawah kondisi hipotiroid, baik cerebellums eutiroid dan hipotiroid

mengikuti pola yang sama ekspresi. Seperti korteks, otak kecil bisa menjadi cepat

untuk menyesuaikan ketersediaan T3 lokal bahkan di hadapan tingkat serum T4 rendah, dengan meningkatkan

jumlah DIO2.

kesimpulan

Hormon tiroid memainkan peran penting dalam perkembangan saraf, bersama dengan spesifik

faktor pertumbuhan seperti insulin-like growth factor 1. Kekurangan salah satu dari kedua

hormon menyebabkan kelainan perkembangan yang sama seperti tubuh menurun dan

ukuran otak (Beck et al, 1995;. Brent, 1999), dan keterbelakangan mental (Flamant et al,.

2006). hipotiroidisme perkembangan diketahui menyebabkan cacat neurologis yang dapat

menyebabkan defisit kognitif permanen jika tidak diobati cukup awal dalam pengembangan (Zoeller

dan Rovet, 2004). Mekanisme di balik kelainan neurologis berikut

rendah tingkat sirkulasi TH belum diketahui; Namun, TH dan IGF-1 saham banyak umum

situs tindakan seluruh otak berkembang. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menjelaskan

hubungan potensial antara beredar TH selama pengembangan awal dan

usikan diproduksi secara lokal otak IGF-1 tingkat mRNA.

Hipotesis kerja penelitian ini adalah bahwa: TH rendah selama perinatal

pengembangan mengurangi ekspresi temporal IGF-1 mRNA di korteks,

hipokampus, dan otak kecil pada tikus hipotiroid bila dibandingkan dengan tikus wildtype .

Hipotesis wajar adalah bahwa pengurangan hipotiroidisme-diinduksi dalam IGF-1 otak

mRNA mengakibatkan defisit neurologis permanen diamati dalam CH.

 32

Secara keseluruhan, hasil penelitian ini mendukung hipotesis kerja ini. Di korteks

dan otak kecil, tikus perkembangan hipotiroid mengalami penurunan jumlah IGF-1

mRNA, meskipun perbedaannya tidak selalu signifikan secara statistik. Dalam

hippocampus, puncak IGF-1 tingkat mRNA bergeser ke P14 pada tikus hipotiroid dibandingkan

untuk P7 dalam kondisi eutiroid. Karena pengobatan goitrogens berhenti di P21, setiap

Perbedaan terlihat di P42 adalah hasil dari defisit TH permanen selama awal

pengembangan. Bukti ini adalah yang paling menonjol ketika membandingkan berat badan secara keseluruhan

dan jumlah bobot otak basah, yang keduanya secara signifikan kurang pada tikus hipotiroid bahkan

ketika tingkat T4 serum normal.

Sejak hasil ini tidak tercermin dalam penurunan IGF-1 ekspresi di P42 di setiap

wilayah, dapat diasumsikan bahwa TH memiliki tindakan mekanistik lebih kompleks dari sekadar

mengatur IGF-1 ekspresi gen. Hal ini juga aman untuk mengusulkan bahwa otak IGF-1 mRNA

Ekspresi dipengaruhi oleh TH serum rendah; namun cara IGF-1 ekspresi gen adalah terganggu

adalah regional dan temporal tertentu. Studi ini telah mengidentifikasi sebuah novel potensial,

Mekanisme yang sebelumnya belum dijelajahi, dimana TH rendah selama hasil pembangunan di

defisit neurologis.
 33

Referensi

Aranda, PS, DM Lajoie, dan CL Jorcyk. 2012. Bleach gel: Sebuah gel agarosa sederhana untuk
menganalisis kualitas RNA. Elektroforesis 33: 366-369.
Ausó, E. et al. 2004. Kekurangan Moderat dan Transient Fungsi Ibu Tiroid di
Awal dari janin Neocorticogenesis Alters neuron Migrasi. Endokrinologi 145: 4037-4047.

Bartlett, WP, XS Li, ​M. Williams, dan S. Benkovic. 1991. Lokalisasi insulin-like
Faktor-1 pertumbuhan mRNA dalam sistem saraf pusat murine selama pengembangan postnatal.
Perkembangan Biologi 147: 239-250.
Beck, KD, L. Powell-Braxton, HR Widmer, J. Valverde, dan F. Hefti. 1995. gen IGF1
Hasil gangguan dalam mengurangi ukuran otak, CNS hypomyelination, dan kehilangan granul hipokampus dan
striatal parvalbumin mengandung neuron. Neuron 14: 717-
730.
Bernal, J. 2015. hormon tiroid dalam perkembangan otak dan fungsi. Bradley, D., H. Towle, dan WS Young. 1992.
ekspresi spasial dan temporal dari alpha-dan
mRNA beta-tiroid reseptor hormon, termasuk beta 2-subtipe, dalam sistem saraf mamalia
berkembang. Journal of Neuroscience 12: 2288-2302. Brent, GA 1999. Ibu hipotiroidisme:
pengakuan dan manajemen. Tiroid 9: 661-
665.
Burstein, PJ, B. Draznin, CJ Johnson, dan DS Schalch. 1979. Pengaruh
Hipotiroidisme pada Pertumbuhan, Serum Hormon Pertumbuhan, Pertumbuhan HormoneDependent
somatomedin, Insulin-Like Growth Factor, dan Its Pembawa Protein pada Tikus. Endokrinologi 104:
1107-1111.
Carter, CS et al. 2002. Model Hormon Pertumbuhan dan IGF-1 DeficiencyApplications ke
Studi Penuaan Proses dan Hidup-Span Penentuan. The Jurnal of Gerontology: Seri
A 57: B177-B188.
Chang, YJ, CM Hwu, CC Yeh, PS Wang, dan SW Wang. 2014. Pengaruh subakut
hipotiroidisme pada metabolisme dan molekul terkait pertumbuhan. Molekul (Basel, Swiss) 19:
11.178-11.195.
D'Ercole, JA, P. Ye, dan JR O'Kusky. 2002. model Mutant mouse insulin-like growth
tindakan faktor dalam sistem saraf pusat. Neuropeptida 36: 209-220. Dyer, AH, C.
Vahdatpour, A. Sanfeliu, dan D. Tropea. 2016. Peran Insulin-Like
Growth Factor 1 (IGF-1) dalam perkembangan otak, pematangan dan neuroplastisitas. Neuroscience 325:
89-99.
Elder, DA, AF Karayal, AJ D'Ercole, dan AS Calikoglu. 2000. Pengaruh
hipotiroidisme pada insulin-like growth factor-I ekspresi selama perkembangan otak pada tikus. huruf
Neuroscience 293: 99-102.
Farsetti, A., T. Mitsuhashi, B. Desvergne, J. Robbins, dan VM Nikodem. 1991. Molekuler
dasar regulasi hormon tiroid ekspresi gen protein dasar mielin dalam otak tikus. The Journal kimia
biologi 266: 23.226-23.232. Feldman, EL, KA Sullivan, B. Kim, dan JW Russell. 1997. Faktor
Pertumbuhan Insulin-seperti
Mengatur neuron Diferensiasi dan Survival. Neurobiology of Disease 4: 201-
214.
Flamant, F. et al. 2006. International Union of Pharmacology. LIX. farmakologi dan
klasifikasi dari superfamili reseptor nuklir: reseptor hormon tiroid. ulasan farmakologis
58: 705-711.
Freitas, SM et al. 2010. sinyal parakrin oleh glial mengaktivasi triiodothyronine sel yang diturunkan
ekspresi gen neuronal di otak tikus dan sel manusia. The Journal penyelidikan klinis 120:
2206-2217.
 34

Ge, RT et al. 2015. Insulin-seperti faktor-1 pertumbuhan endues monosit dengan kekebalan
kemampuan penekan untuk menghambat peradangan pada usus. Ilmiah melaporkan 5: 7735. Gilbert, ME et
al. 2007. tiroid hormon insufisiensi selama perkembangan otak mengurangi
parvalbumin immunoreactivity dan fungsi penghambatan di hippocampus. Endokrinologi
148: 92-102.
Guadano-Ferraz, A., MJ Obregon, DL St Germain, dan J. Bernal. 1997. tipe 2
deiodinase iodothyronine dinyatakan terutama dalam sel glial dalam otak tikus neonatal. Prosiding
National Academy of Sciences dari Amerika Serikat 94: 10.391-10.396.

Kapoor, R., LA Desouza, IN Nanavaty, SG Kernie, dan VA Vaidya. 2012. Tiroid

Hormon Mempercepat Diferensiasi Dewasa Hippocampal nenek moyang. Journal of
Neuroendocrinology 24: 1259-1271.
Kline, S. 2016. Temporal Lokalisasi IGF1 Sel Positif di Otak Mengikuti
Perkembangan Hypothyroidism, Minnesota State University, Mankato. Lima, FR et al. 2001.
Peraturan pembangunan microglial: peran baru untuk tiroid
hormon. J Neurosci 21: 2028-2038.
Martinez, R., C. Eller, NB Viana, dan FCA Gomes. 2011. menginduksi hormon tiroid
cerebellar migrasi neuronal dan diferensiasi glia Bergmann melalui faktor pertumbuhan epidermal /
mitogen-diaktifkan protein kinase. European Journal of Neuroscience 33: 26-35.

McMorris, FA, TM Smith, S. DeSalvo, dan RW Furlanetto. Pertumbuhan 1986. Insulin-seperti

Faktor I / somatomedin C: inducer poten pembangunan oligodendrocyte. Prosiding National
Academy of Sciences dari Amerika Serikat 83: 822-826.

Ng, L., MW Kelley, dan D. Forrest. 2013. Pembuatan akal dengan hormon tiroid - peran
T (3) dalam pembangunan pendengaran. ulasan alam. Endokrinologi 9: 296-307. Omazic, B. et al. 2001.
ekspresi Diubah reseptor untuk hormon tiroid dan insulin-like
Faktor-I pertumbuhan selama pemulihan setelah transplantasi sel induk hematopoietik alogenik.
Sumsum tulang transplantasi 27: 1163-1171.
Preau, L., JB Fini, G. Morvan-Dubois, dan B. Demeneix. 2015. tiroid hormon signaling
selama neurogenesis awal dan maknanya sebagai jendela rentan untuk gangguan endokrin.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Peraturan Mekanisme 1849: 112-121.

Rodriguez-Pena, A. 1999. pengembangan oligodendrocyte dan hormon tiroid. Jurnal dari

neurobiologi 40: 497-512.
Rodriguez-Pena, A., N. Ibarrola, MA Iniguez, A. Munoz, dan J. Bernal. 1993. Neonatal
hipotiroidisme mempengaruhi ekspresi tepat waktu glikoprotein myelin terkait di otak tikus. The
Journal penyelidikan klinis 91: 812-818. Schoonover, CM et al. 2004. Hormon tiroid mengatur
akumulasi oligodendrocyte di
mengembangkan otak tikus saluran materi putih. Endokrinologi 145: 5013-5020. Silva, JE, dan PR
Larsen. 1982. Perbandingan iodothyronine 5'-deiodinase dan lain
Tiroid-hormon tergantung Kegiatan enzim dalam Cerebral Cortex dari hipotiroid neonatal Rat: Bukti
Untuk Adaptasi Untuk Hypothyroidism. Journal of Clinical Investigation 70: 1110-1123.

Tu, HM et al. 1999. ekspresi Daerah tipe 3 iodothyronine deiodinase utusan

asam ribonukleat dalam tikus sistem saraf pusat dan pengaturannya oleh hormon tiroid.
Endokrinologi 140: 784-790.
Ueno, M. et al. 2013. Lapisan V neuron kortikal memerlukan dukungan microglial untuk bertahan hidup selama
pengembangan postnatal. Nat Neurosci 16: 543-551.
 35

Wallis, K. et al. 2010. Tiroid protein reseptor hormon alpha1 dinyatakan dalam
neuron postmitotik embrio dan tetap berlangsung di sebagian besar neuron dewasa. endokrinologi molekul
(Baltimore, Md.) 24: 1904-1916.
Wang, L., YY Shao, dan RT Ballock. 2010. tiroid hormon pertumbuhan-dimediasi dan
diferensiasi pertumbuhan kondrosit lempeng melibatkan IGF-1 modulasi [beta] catenin. Jurnal
Bone dan Mineral Penelitian 25: 1138-1146. Weinberger, C. et al. 1986. c-erb-A gen mengkode
reseptor hormon tiroid. Alam
324: 641-646.
Wilkins, A., S. Chandran, dan A. Compston. 2001. Peran oligodendrocyte diturunkan IGF-1
dalam mendukung trofik neuron kortikal. Glia 36: 48-57.
Xing, W. et al. 2012. Bukti genetik bahwa hormon tiroid sangat diperlukan untuk prapubertas
insulin-like growth factor-I berekspresi dan akuisisi tulang pada tikus. Jurnal tulang dan penelitian
mineral: jurnal resmi American Society untuk tulang dan Mineral Penelitian 27: 1067-1079.

Yen, PM 2001. Fisiologis dan dasar molekul tindakan hormon tiroid. Fisiologis
ulasan 81: 1097-1142.
Zoeller, RT, dan J. Rovet. 2004. Review Pasal: Waktu Tiroid Hormon Aksi di
Mengembangkan Otak: Pengamatan klinis dan Temuan Eksperimental. Journal of
Neuroendocrinology 16: 809-818.
Zoeller, RT, SW Tan, dan RW Tyl. 2007. latar belakang Umum di hipotalamus yang
hipofisis-tiroid (HPT) axis. ulasan kritis dalam toksikologi 37: 11-53.