LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

APLIKASI TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

DISUSUN OLEH :

NAMA : NALAT TAZKIA FIRDA

NIM : K1A018062

KELAS :B

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN KIMIA
PURWOKERTO
2021
 1

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI .......................................................................................................................... 1

APLIKASI TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN ................................................................ 2
I. TUJUAN ......................................................................................................................... 2
II. REVIEW VIDEO DEMONSTRASI .............................................................................. 2
2.1 Nobel Lecture: Jennifer Doudna, Nobel Prize in Chemistry 2020 .......................... 2
2.2 CRISPR Gene Editing: Using CRISPR-Cas9 with the Out of the Blue CRISPR
Kit ............................................................................................................................ 8
III. KESIMPULAN ......................................................................................................... 15
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................................... 16
 2

APLIKASI TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

I. TUJUAN
Mengetahui aplikasi teknologi DNA rekombinan untuk menghasilkan produk unggulan.

II. REVIEW VIDEO DEMONSTRASI

2.1 Nobel Lecture: Jennifer Doudna, Nobel Prize in Chemistry 2020

Jennifer Doudna lahir di Washington DC pada tahun 1964. Jennifer Doudna
mendapatkan gelar doktor pada tahun 1989 dari sekolah kedokteran Harvard di Boston.
Jennifer Doudna sekarang menjabat sebagai profesir di Universitas California Berkeley
di Amerika Serikat. Teknologi genom editing pada saat ini telah muncul dalam dunia
teknologi. Teknologi genom editing melakukan pendekatannya disinyalir lebih baik dari
pada teknologi manipulasi gen transgenesis klasik, seperti mengintroduksi sifat baru dari
tanaman atau hewan dengan rekombinasi genetik alami dengan cara mengawinkannya
dengan induk yang memiliki kualitas lebih baik atau unggul. Genome editing adalah
suatu metode yang menarget sebuah sekuen DNA di dalam genom suatu organisme
sehingga dapat disisipi, diganti, atau dihapus dengan bantuan enzim nuklease yang
berfungsi sebagai gunting molekuler (Schinkel dan Schillberg, 2016). Banyak pendapat
menyatakan bahwa genome editing pada tanaman berpotensi besar dalam ketahanan
pangan yang berkelanjutan untuk menghadapi ancaman perubahan iklim, penambahan
penduduk, dan penyusutan lahan pertanian (Bogdanove et al., 2018). Salah satu metode
genome editing, yaitu clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-
associated protein 9 (CRISPR/Cas9), menjadi populer karena lebih mudah penerapannya.

Teknologi genome editing generasi awal menggunakan perantara oligonukleotida

(oligonucleotide-mediated mutagenesis, OMM), yang disintesis secara kimiawi dan
berfungsi untuk membantu enzim pemulihan DNA dalam menemukan situs spesifik gen
dan melakukan penggantian atau penambahan basa DNA (Beetham et al., 1999). Saat
ini, generasi terbaru teknologi genome editing menggunakan enzim nuclease yang telah
dimodifikasi dengan situs terarah (site-directed nucleases, SDNs; atau kadang-kadang
disebut juga site-specific nucleases, SSNs), yang mampu melakukan penargetan sangat
spesifik pada gen yang diinginkan. Pemotongan utas ganda DNA (double strand breaks,
DSBs) oleh enzim SDN akan memicu mekanisme perbaikan/reparasi DNA di dalam sel
tersebut. Jenis reparasi yang dilakukan sel selanjutnya dapat diarahkan untuk
menghasilkan sejumlah modifikasi sekuen DNA, baik berupa penghilangan sekuen DNA
(delesi) maupun penyisipan (insersi) DNA baru dalam berbagai ukuran (Puchta dan
 3

Fauser, 2013). Kelas utama SDN diketahui ada empat, yaitu meganuclease (MegaN),
zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs),
dan CRISPR/Cas9 (Abdallahet al,. 2015).

Saya pikir saya akan memulai dengan memberi tahu tentang asalnya ide ini.
Setidaknya selama 2 dekade dengan hasil penelitian dilaboratorium mikrobiologi bahwa
bakteri memiliki kekebalan adaptif untuk memberikan perlindungan terhadap virus
infeksi yang memungkinkan sel untuk mendapatkannya secara real time dan kemudian
melindungi sel dari virus tersebut menggunakan sistem pencatatan ini dalam genome dan
sistem ini kemudian disebut crispr dan seperti pada gambar (1.43)

Ini adalah mekanisme yang digunakan bakteri dan sel dapat beradaptasi dengan
virus dengan mengintegrasikan potongan-potongan kecil DNA virus kedalam genome
orgnanisme yang disebut crispr dan kemudian menggunakan informasi itu untuk
membuat salinan RNA dari urutan yang bisa lalu berikan informasi yang diperlukan
untuk deteksi dan pembelahan virus DNA atau RNA menggunakan crispr. Sistem ini
menunjukan cara sistem bekerja dengan bioinformatika dan genetika molekular.

Kita bisa melihat ketika CRISPR beroperasi dalam bakteri yang tumbuh dibiofilm
sedang terinfeksi oleh virus dan saat virus disuntikan DNA nya kedalam sel, sel dapat
memperoleh sebagian kecil darinya dan masuk kedalam lokus crispr suatu tempat
didalam genome yang terdiri dari urutan berulang yang mengapit dari virus yang disebut
spacer dan sel kemudian membuat salinannya dalam bentuk RNA yang kemudian diolah
menjadi unit yang menyertakan urutan yang berasal dari virus yang digabungkan dengan
RNA tersebut.

Jenis RNA kedua yang disebut sebagai pelacak dan protein disebut Cas-9 untuk
membentuk kompleks pengawasan dan protein yang dipandu RNA yang dapat
menelusuri sel untuk mencari urutan yang cocok dengan urutan dari panduan RNA dan
ketika terjadi reaksi crispr dan protein cas9 mampu untuk memotong DNA untai ganda.
Penghancuran DNA dalam sel bakteri dan jalur ini telah beroperasi sangat lama selama
waktu evolusioner berkembang dalam bakteri dan dari waktu ke waktu telah
didiversifikasi menjadi banyak yang berbeda yang dapat beroperasi secara efektif
diorganisme ini.

Dalam contoh tersebut menunjukan tiga langkah CRISPR diperoleh kekebalan

yang mencakup adaptasi, ekspresi dan gangguan dalam penelitian yang Jennife Doudna
 4

lakukan dibantu dengan Blake Wiedenheft dan Rachel Horowitz setelah itu memulai
meneliti tentang ketiga langkah pada crispr dan yang mengganggu tahapan pada jalur
crispr.

Pada 2011 Jennifer Doudna memulai untuk berkolaborasi dengan Emmanuel

Sharpentier dan muridnya Christopher Chielineki dan menemukan sesuatu yang luar
biasa karena bisa berkesempatan untuk menjawab apa yang pada saat itu sangat menarik
yaitu pertanyaan ada fungsi dari protein Crispr-Cas9 dan mereka akhirnya melakukan
penelitian tersebut karena ini sel dan khususnya jenis bakteri yang Emmanuel Sharpentier
sedang melakukan penelitian disebut Strepcoccus Pyogenes. Organisme itu menginfeksi
manusia dan organisme tertentu dan protein crispr cas9 yang dikodekam dalam sistem
crispr terlibat dalam penelitian sel dari infeksi virus tetapi pertanyaannya adalah
bagaimana caranya. Dalam kolaborasi mereka, Jennifer dan Emmanuel menyelediki hal
tersebut dan menjawab hal tersebut dengan melakukam eksperimem biokimia yang
terlibat dengan protein cas9 crispr yang dimurnikan dan RNA yang digunakan unruk
menargetkan urutan RNA dalam sel.

Akhirrnya yang mereka temui dan ini adalah penelitain yang dilakukan oleh Martin
Yinnicl seorang alumni Postdoctoral di laboratorium Jennifer Doudna dan Chris Tylenski
yang ada di Laboratorium Emmanuel Sharpentier adalah bahwa CRISPR-Cas9 adalah
dual RNA yang menggunakan protein yang sudah dijelaskan pada video pengantar. Ini
adalah protein yang menggunakan molekul CRISPR RNA untuk mengarahkan urutan
DNA yang cocok dengan urutan CRISPR RNA. Hal tersebut membutuhkan molekul
RNA kedua yang disebut tracer, yang menyediakan interaksi dengan CRISPR RNA yang
diperlukan untuk perakitan dengan CAS9 dan bersama saka dua tracer Cas9 RNA ini
menuju urutan dimana protein Cas9 berada bisa membuat potongan diheliks ganda DNA.

Jennifer Doudna pikir salah satu aspek yang menganggumkan dari project CRISPR
dengan tim Emmanuel adalah bahawa inilah nantinya yang dalam penelitian kami
dimana apa yang dimulai sebagai rasa ingin tahu yang didorong dengan investigasi dan
berujung menjadi project yang jauh lebih luas penggunaannya karena dengan begitu kita
dapat memahami bagaimana secara alamai menggunakan RNA ganda untuk memandu
Cas9 ke urutan DNA target. Hal tersebut mungkin untuk merekayasa panduan RNA
ganda sebagai panduan RNA tunggal yang ditampilkan yang termasuk kedua penargetan
informasi dan persyaratan struktural untuk perakitan dengan protein Cas9 dalam satu
 5

molekul RNA dan percobaan ini dilakukan oleh Martin dan Kristoff bahwa cas9 dapat
diprogram dengan RNAs dan diarahkan untuk membelah DNA beruntai ganda pada
urutan yang diinginkan dengan memanfaatkan keduanya dari informasi penargetan yang
sebenarnya di molekul crispr rna serta kebutuhan untuk apa yang disebut urutan PAM
PROTO SPACER. Motif pam yang berdekatan lebih mudah terjadi tepat disebelah target
urutan dalam DNA dan kedua elemen tersebut diperlukan agar cas9 mengenali dan
membelah DNA. Tapi persyaratan ini cukup untuk cas9 yang berfungsi sebagai pemandu
RNA.

Para peneliti berusaha menciptakan modul terbaru dari genom editing yang
memiliki harga lebih murah dan presisi tinggi. Teknologi tersebut telah ditemukan, dan
dikenal dengan nama Cluster Regulary Interspaced Short Palondromic Repeats-
associated protein-9 nuclease, atau dapat dikenal dengan (CRISPR-Cas 9). Penemuan
modul teknologi genom editing ini dalam dunia molekuler termasuk dalam penemuan
baru dan terbesar. Sistem CRISPR/ Cas9 merupakan teknologi SDN yang paling
mutakhir. Dengan CRISPR/Cas9, penargetan DNA dicapai melalui sebuah RNA
penuntun (guide RNA) yang basa-basanya berpasangan secara spesifik dengan sekuen
target dalam kromosom (Shan et al., 2013). Kompleks pasangan RNA dan DNA ini
kemudian dikenali dan dipotong oleh nuklease Cas9.

Penemuan CRISPR-Cas 9 dimulai dari penelitian pada tahun 2007 mengenai

kekebalan imunitas yang terjadi pada bakteri. Ide pertama dari teknik CRISPR bermula
pada tahun 1987, ketika sebuah tim penelitian mengamati fenomena proses pengulangan
skuens yang aneh pada salah satu ujung dari gen bakteri. Pada tahun 2007, para peneliti
dari Danisco, yang bergerak dalam industri komposisi makanan yang dimiliki oleh
DuPont, melakukan penelitian mengenai bakteri Streptococcus thermophilusyang sangat
penting dalam industri pembuatan yoghurt dan keju. Bakteri tersebut diekspose dengan
virus agar dapat melawan serangan virus. Hasil yang didapat sangat menarik, bakteri
tersebut mampu menciptakan kekebalan imun sistem yang memungkinkannya untuk
resisten pada serangan virus yang kedua dan seterusnya. Sistem pertahanan yang
ditunjukkan oleh bakteri S. thermophilus tersebut menjadi sangat penting, bahkan hingga
para ahli biologi molekuler lainnya tertarik untuk meneliti lebih lanjut lain (Pennisi,
2013).
 6

Jennifer Doudna dan Emmanuelle Charpentier, ahli biologi molekuler dari jerman
(2007) meneliti lebih jauh dari sistem CRISPR ini dengan mengaitkannya dengan
protein-protein lain untuk mengetahui bagaimana S. thermophilus ini menggunakan
DNA spacers dalam sistem pertahanan imun mereka. Jennifer Doudna dan Emmanuelle
Charpentier melakukan fokus menggunakan sistem CRISPR ini dengan protein yang
disebut Cas9 untuk menyederhanakan sistem CRISPR dibandingkan dengan yang lain
(Pennisi, 2013).

Komponen utama dalam sistem CRISPR-Cas9 adalah protein Cas dan single guide
RNA (sgRNA). Sistem CRISPR-Cas tipe II, Cas9 ini merupakan protein penting yang
menjadi karakteristik utama dan sistem ini yang paling banyak digunakan dalam
penelitian. CRISPR-Cas tipe II ini memiliki komponen yang lebih sederhana yaitu 3
komponen (Cas9, crRNA dan trRNA) yang lebih mudah diadaptasi dibandingkan
CRISPR Cas tipe I, III dan IV. Cas 9 berfungsi sebagai enzim yang memotong DNA
target di sekuen yang posisinya dekat dengan situs protospacer adjacent motif (PAM).
Protein cas9 ini memiliki 2 situs homolog yaitu RuvC dan HNH, yang masing-masing
memotong satu dari untai ganda DNA, yang menghasilkan potongan tumpul (blunt cut)
pada sekuen DNA target. Kemudian sgRNA yang merupakan RNA buatan gabungan dari
dua noncoding RNA yaitu crRNA yang berfungsi sebagai guide yang bisa menyesuaikan
dengan sekuen dari DNA target dan tracrRNAyang berfungsi sebagai scaffold. Sekuen
sgRNA ini digunakan untuk mentarget lokus genom tanaman/hewan yang secara
34ector34us panjangnya 19-22bp, dengan penambahan 3 bp sekuen PAM (NGG).

Cas9 dan sgRNA dapat dikonstruk dalam satu vektor atau bisa menggunakan dua
vektor yang terpisah dengan mengkombinasikan dengan jenis promotor dan sekuen dari
enzim restriksi lainnya tergantung dari karakter genom yang ditargetkan. Metode
pengeditan dari CRISPR ini, sama dengan dua teknologi sebelumnya yaitu adanya
mekanisme reparasi akibat terpotongnya sekuen DNA target. Mekanisme reparasi
tersebut bisa terjadi secara alami yang bergabung dengan Nonhomologous end Joining
(NHEJ) maupun dengan menggunakan cetakan eksternal yang diinginkan seperti
homology directed repair (HDR). Dari mekanisme perbaikan ini maka akan terjadi insersi
basa atau penghapusan nukleotida baru yang menyebabkan terjadinya disfungsi gen
(Sprink et al., 2015).
 7

Teknologi CRISPR ini mampu menciptakan varietas baru dari lalat buah yang
memiliki mata berwarna hitam dengan mengedit gen yang bertanggung jawab terhadap
pigmen warna mata pada lalat buah. Dalam dunia industri dan therapeutik, penggunaan
CRISPR sangat gencar dilakukan, terbukti dengan dana penelitian yang dikeluarkan
mencapai hamper 89 juta dollar pada tahun 2013. Publikasi-publikasi ilmiah yang
membahas tentang aplikasi teknik CRISPR ini dalam dunia medis meningkat tajam
seperti penggunaan CRISPR-Cas 9 untuk terapi gen secara in vivo dan tercatat sebagai
publikasi terbesar kedua setelah teknologi induced pluripotent stem sel (iPS) dan diikuti
oleh Zinc fingers dan Talens (Ledford, 2015). Pada tahun 2014, Shan dan koleganya
menemukan metode untuk menciptakan mutasi pada padi dan gandum dengan
menggunakan teknik CRISPR ini dengan menggunakan transformasi dari protoplas
dengan masa regenerasi mutan yang relatif cepat selama 13-17 minggu. , pada bulan
April 2015, para peneliti melaporkan bahwa mereka berhasil mengedit embrio manusia
dengan menggunakan teknik CRISPR ini. Meskipun hal ini memunculkan perdebatan di
kalangan masyarakat dunia mengenai etis atau tidak etisnya teknologi CRISPR ini
digunakan untuk penelitian pada manusia (Jiang et al., 2013; Ledford et al., 2015).
Aplikasi dan trend dari penggunaan teknologi CRISPR yang cenderung meningkat dalam
dunia penelitian baik biomedis dan pertanian merupakan bukti nyata bahwa teknik ini
merupakan gebrakan baru dalam dunia genome editing dan biologi molekuler yang tentu
saja menimbulkan status pro dan kontra mengenai status produk yang dihasilkannya di
masa depan.

Para peneliti internasional juga mulai memperdebatkan mengenai apakah produk

yang dihasilkan dengan teknologi CRISPR ini masih tergolong sebagai GMO. Mereka
menilai bahwa teknologi genome editing bukan termasuk dalam kategori produk GMO,
karena tidak adanya DNA asing yang dimasukkan dan tidak melibatkan penggunaan
bakteri Agrobacterium yang bersifat pathogen dalam perakitannya (Puchta & Fauser,
2013; Araki & Ishii, 2015). Dengan kata lain teknik ini meniru proses alami dari sel dan
tidak menyebabkan transformasi gen secara keseluruhan yang merupakan isu sensitif dari
produk GMO. Karena itulah, para peneliti-peneliti internasional berdebat mengenai
terminologi GMO yang dirasa regulasinya tidak lagi valid untuk produk-produk hasil
dari teknik genome editing karena organisme yang dihasilkan lebih disebut sebagai
Genetically edited organism (GEO) (Qaim& Zilberman, 2003). Evaluasi mengenai
produkproduk baru dan akhir yang dihasilkan dari teknik genome editing ini mungkin
 8

perlu menjadi perhatian yang serius kedepannya oleh para ahli, agar masyarakat ter-
edukasi dan mampu menentukan pilihan dan sikap yang benar terhadap produk-produk
dari GMO/GEO. terlepas dari adanya kontroversi terkait regulasi GMO maupun GEO,
teknologi CRISPR-Cas9 ini memberikan angin segar bagi para peneliti, industri dan
masyarakat pada umumnya. Karena pada akhirnya, inovasi dan perkembangan
bioteknologi hewan dan tanaman yang dulu sukar diprediksi akan tercerahkan
kedepannya, terutama dengan maraknya isu-isu mengenai pemanasan global dan climate
change yang sekarang banyak diperbincangkan.

2.2 CRISPR Gene Editing: Using CRISPR-Cas9 with the Out of the Blue
CRISPR Kit
Genome editing adalah metode perakitan genetik dimana sebuah sekuens DNA
bisa disisipkan, diganti dihapus, dan atau dipindahkan dari genom suatu organisme ke
organisme laindengan bantuan suatu enzim nuklease yang berfungsi seperti gunting
molekuler (Schinkel & Schillberg, 2016). Tujuan dari metode ini tak lain adalah
mengedit susunan basa DNA pada genom sehingga ketika diterjemahkan dalam bahasa
asam amino bisa merubah sifat dari organisme tersebut. Teknologi genome editing
tergolong baru karena baru resmi dipublikasikan pada tahun 2005. Beberapa modul
teknik genome editing yang telah digunakan diantaranya Zinc Finger Nucleases (ZFNs)
dan Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) (Ledford, 2016).

Salah satu teknologi yang baru-baru ini ada yaitu CRISPR . CRISPR (dieja
‘krisper’), kepanjangan dari Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats, atau disebut juga CRISPR/ Cas9, merupakan teknologi pengubah gen dipandu
RNA (asam ribonukleat).

Ada dua komponen utama dalam sistem CRISPR-Cas9 yaitu protein Cas dan single
guide RNA (sgRNA). Cas 9 berfungsi sebagai enzim yang memotong DNA target di
sekuen yang posisinya dekat dengan situs protospacer adjacent motif (PAM). Sekuen di
situs PAM ini biasanya ditandai dengan 3 basa nukleotida (NGG, dengan N adalah basa
nukleotida yang bisa berupa A: Adenin; T: Timin; C: Cytocine; G: Guanin). Protein cas9
ini memiliki 2 situs homolog yaitu RuvC dan HNH, yang masing-masing memotong satu
dari untai ganda DNA, yang menghasilkan potongan tumpul (blunt cut) pada sekuen
DNA target. Selanjutnya, sgRNA yang merupakan RNA buatan gabungan dari dua
noncoding RNA yaitu crRNA yang berfungsi sebagai guide yang bisa menyesuaikan
dengan sekuen dari DNA target dan tracrRNAyang berfungsi sebagai scaffold. Cas9 dan
 9

sgRNA dapat dikonstruk dalam satu vektor atau bisa menggunakan dua vektor yang
terpisah dengan mengkombinasikan dengan jenis promotor dan sekuen dari enzim
restriksi lainnya tergantung dari karakter genom yang ditargetkan. Metode pengeditan
dari CRISPR ini, sama dengan dua teknologi sebelumnya yaitu adanya mekanisme
reparasi akibat terpotongnya sekuen DNA target (Sprink et al., 2015).

Sejak awal kemunculannya, teknologi CRISPR ini telah membawa angina segar
dalam dunia genome editing. Aplikasinya yang sederhana dan relatif murah telah banyak
diterapkan di sel eukariotik, tikus, nematode dan tanaman. Sebagai contoh nyata Pennisi
(2013). Dalah satu aplikasinya ada pada video yang akan direview ini, mengenai editing
lacZ pada E-coli di laboratorium Bio-rad’s dengan Blue CRISPR Kit.

Dalam keadaan normal, koloni e coli berwarna coklat muda seperti pada gambar :

Gambar 2.1 Koloni E-Coli

E coli memiliki gen dalam kromosomnya, yaitu lacZ yang mengkode enzim β-
galaktosidase atau β -gal . β-gal akan bekerja dengan merusak laktosa, tetapi juga dapat
memecah substrat yang disebut X-gal yang tidak berwarna. Ketika X- gal ini dipecah
maka akan menghasilkan warna biru. Jadi bakteri dengan lacZ yang masih berfungsi akan
berwarna biru ketika mereka tumbuh di media yang mengandung X –gal.
 10

Gambar 2.2 Koloni E-Coli dengan fungsional LacZ

Pada cawan, dapat dilihat bakteri yang mengekspresikan lacZ sehingga warnanya
biru. Jika kita tinjau sebaliknya, bakteri dengan gen lacZ yang sudah tidak berfungsi tidak
memproduksi beta- gal dan bakteri tidak dapat merusak x gal maka pigmen biru juga
tidak terbentuk. Ketika bakteri tumbuh di cawan dengan x gal koloninya berwarna putih.

lacZ bisa digunakan sebagai model untuk gen lain yang mungkin ingin
dimodifikasi. Modifikasi gen dapat dilakukan dengan menghapus,memasukkan atau
mengganti urutan DNA dengan teknologi DNA rekombinan, salah satunya yang sedang
berkembang pesat saat ini yaitu CRISPR-Cas9. Dengan menggunakan CRISPR,
mempermudah untuk menargetkan dan mengedit gen tertentu . Pada video ini diuraikan
mengenai gen lacZ yang masih berfungsi dan penggunakan CRISPR untuk memotong
dan mengedit sehingga nantinya lacZ ini tidak befungsi sebagaimana mestinya.

Selama ini, kita difokuskan mengenai teknologi CRISPR untuk memotong DNA,
namun perlu diketahui 2 hal penting saat mengedit dengan gen CRISPR yaitu , memotong
dan juga memperbaiki. Cara kerja dari CRISPR ini yaitu cas 9 dan guide RNA akan
membentuk kompleks yang mengenali atau menemukan DNA target berdasarkan urutan
nukleotida RNA. DNA lepas dan urutan komplementer mengikat RNA pemandu.
Kemudian cas 9 membuat untaian ganda,memotong DNA. Kini, bakteri memiliki untai
ganda pada kromosomnya. Bakteri telah mengembangkan cara untuk memperbaiki
kerusakan pada DNA sehingga mereka tidak mati. Proses selanjutnya adalah perbaikan,
bakteri dapat menggunakan proses yang disebut HDR (hemology directed repair) untuk
memperbaiki untai ganda pada kromosom. Dalam proses ini, donor DNA masuk ke
dalam potongan DNA sebelumnya da mulai perbaikan dengan menggunakan bacteria
repair machinery. DNA donor ini lah yang memiliki lengan hemologi,yang merupakan
 11

urutan yang cocok dengan bagian DNA tujuan. Lengan hemologi membantu donor
berbaris dengan benar.

Jadi, menurut uraian di atas, diperlukan 4 komponen untuk pengeditan gen

CRISPR yaitu :

1. Cas 9

2. Guide RNA

3. DNA donor

4. Repair machinery

Pada lab ini, digunakan e coli yang memiliki gen lacZ yang berfungsi. Kemudian
digunakan CRISPR-cas9 untuk memotong DNA dan kemudian memperbaiki kerusakan
dengan memasukkan DNA donor. Telah direkayasa pula donor DNA khusus ini dengan
stop kodon. Jadi ketika donor DNA dimasukkan ke dalam lacZ gen yang telah dipotong,
terjemahan urutan akan berhenti lebih awal dan lacZ tidak lagi berfungsi sebagaimana
mestinya.

Tujuan dari lab ini adalah menggunakan pengeditan gen CRISPR untuk mengedit
gen lacZ sehingga lacZ tidak berfungsi lagi. Dimulai dengan bakteri biru yang memiliki
gen lacZ yang masih berfungsi dengan baik, setelah bakteri diedit , gen lacZ tidak akan
berfungsi lagi dan itu akan ditularkan ke semua bakteri lain. Tanpa gen lacZ yang
berfungsi, bakteri akan berwarna putih bahkan saat tumbuh di dalam media yang
mengandung X-gal.

Prosedur Laboratorium

Pertama dilakukan 4 proses transformasi bakteri yang berbeda, di atas cawan media
yang berisi X-gal, lalu diinkubasi 24 jam. Kemudian masuk ke dalam komponen yang
diperlukan dalam proses gen editing ini

1. Cas 9
Laboratorium yang ada pada video,menggunakan E coli yang telah direkayasa
untuk terus mengekspresikan cas 9, jadi bakteri yang tumbuh sudah memproduksi cas9
nantinya.
2. Repair machinery protein
 12

Proses perbaikan setelah DNA dipotong dibutuhkan repair machinery. Pada

laboratorium ini juga telah menempatkan gen untuk repair machinery protein di bawah
kontrol arabinosa (Ara). Saat bakteri starter ditanam dalam media arabinosa, repair
mechinary akan dibuat, sedangkan jika bakteri starter ini ditanam di dalam media yang
tidak mengandung arabinosa, maka repair mechinary tidak akan diproduksi.
3. RNA pemandu dan donor DNA
2 komponen ini dapat dikerjakan bersama karena inilah bagian kekuatan CRISPR.

Lokasi untuk memotong dna dan bagaimana cara memperbaikinya dipandu pada
laboratorium ini. 2 komponen yang diperlukan pada proses repair ini, dapat didapatkan
dengan mengubah bakteri di dua plasmid yang berbeda. Pertama,plasmid pD untuk donor
plasmid dan pDG untuk plasmid donor guide. Kedua plasmid ini memiliki urutan DNA
donor . pDG juga memiliki DNA yang mengkode guide RNA, sedangkan bakteri dengan
guide pD tidak akan membuat guide RNA. Setelah semua komponen didapat,perlu
diingat proses sebelumnya bahwa untuk mengedit target gen lac Z, setelah di potong
bagian dalam kromosom lacZ dan kemudian diperbaiki dengan donor DNA, bakteri
dalam cawan di proses awal tadi, sudah otomatis mengeluarkan cas9. Pada proses ini
setelah ditambahkan plasmid pDG , bakteri akan membuat guide RNA, dan terbentuklah
kompleks cas 9- guide RNA yang dapat mengenali atau menemukan target DNA lacZ di
kromosom, melepas dan kemudian memotong DNA nya.

Pada donor DNA, didapatkan DNA dengan stop kodon dari pDG plasmid. Bakteri
juga telah memiliki repair machinery protein karena telah ditumbuhkan dalam media
arabinosa (Ara) . Machine repainery akan memperbaiki potongan DNA dengan
memasukkan donor DNA dengan stop kodon, yang dimana, setelah masuk dalam gen
lacZ,lacZ tidak akan berfungsi dengan semestinya.

Instuktur Persiapan

Mulai dari lab, menuangkan bakteri pada cawan setidaknya tiga hari sebelum
dilakukan penelitian. The starter plate dicoret streak 24 jam sebelum penelitian. Alat dan
bahan yang dibutuhkan spidol permanen, empat tabung kosongkan dua ml, dua plasmid:
pD dan pDG, lb nutrient broth,tempat, container dengan es atau air es, larutan
transformasi agar tetap menjadi es, dua plate starter: dengan dan tanpa arabinose, berlabel
ixera dan IX, empat piring eksperimental berlabel IX-SPT:Ini memiliki spektinomisin
untuk memilih bakteri yang diubah, loops p20 p200 dan p1000 pipet dan ujung, Lakban
 13

lab, penangas air atau penangas kering dengan suhu 60 oC dan suhu inkubator disetel ke
37 oC.

Pertama-tama, beri label 4 tabung yaitu A, B, C, dan D, kemudian taruh diatasnya

es. Untuk hasil terbaik dijaga agar es nya tidak mencair selama proses pengerjaan. Lalu,
tambahkan 250 μL larutan transformasi dingin kesetiap tabung dan kemudian meletakkan
tabung kembali diatas es. Gunakan loop untuk mengambil lima koloni dari IX starter
plate tanpa arabinose, dan tambahkan ke tabung A, putar melingkar selama sekitar satu
menit sehingga bakteri membubar didalam larutan transformasi. Lihat loop sesekali
untuk memasikan tidak melihat gumpalan bakteri jika memberikan pusaran lagi. Lalu
letakkan tabung kembali diatas es. Lalukan hal yang sama untuk tabung B gunakan loop
baru. Dan ambil lima koloni dari starter plate tanpa arabinose. Tambahkan koloni ke
tabung B dan putar loop melingkar untuk memecah gumpalan. Setelah bakteri
dibubarkan, taruh kembali tabung diatas es.

Sekarang beralih ke IX starter plate dengan arabinose. Gunakan loop baru untuk
memilih lima koloni dari cawan ini, lalu dimasukkan ke dalam tabung C. Putar loop
melingkar pada larutan transformasi, dan pastikan menyingkirkan semua bakteri dari
loop. Letakkan kembali tabung diatas es setelah selesai. Gunakan loop baru dan ambil
lima koloni lagi dari cawan ini, lalu tambahkan ke tabung D, putar loop melingkar untuk
membubarkan bakteri yang ada pada larutan trasformasi. Kemudian letakkan kembali
tabung diatas es setelah selesai.

Sekarang saatnya menambah plasmid yang berbeda, ingat akan menambahkan

salah satu plasmid ke bakteri dari setiap starter plate. Dimulai dengan plasmid pD yang
akan ditambahkan ke tabung A dan C. Lalu atur mikropipet menjadi 10 μL dan
tambahkan ujungnya. Kemudian tambahkan 10 μL plasmid pD ke tabung A. Kibaskan
tabung beberapa kali untuk mencampur dan meletakkannya kembali diatas es. Kemudian
ganti ujung pipet dan tambahkan 10 μL pD ke tabung C. Pipet ke atas dan ke bawah atau
kibaskan tabung agar bercampur. Kemudian meletakkan tabung kembali diatas es.
Selanjutnya, menambahkan plasmid pDG ke tabung B dan D, menambahkan ujung baru
dan menambahkan 10 μL dari plasmid pDG ke tabung B. Kibaskan untuk mencampur
dan meletakkannya kembali diatas es. Ganti ujung pipet dan tambahkan 10 μL pDG ke
tabung D. Campur dan taruh tabung D kembali diatas es.
 14

Inkubasi semua tabung diatas es selama 10 menit. Langkah ini sangat penting.
Sekarang saatnya untuk heat shock menggunakan dry bath dengan sedikit air dari sumur.
Taruh tabung diatas es untuk dry bath atau water bath, atur waktu selama 50 detik.
Pindahkan keempat tabung ke dry bath dalam waktu 50 detik dan kemudian
meletakkannya kembali diatas es segera. Biarkan tabung mendingin diatas es selama dua
menit. Keluarkan tabung anda dari penangas es dan tambahkan 250 μL lb untuk masing-
masing. Diamkan pada suhu kamar untuk recovery selama 20 menit. Ini bisa menjadi
titik perhentian jika ingin memiliki periode kelas yang lebih pendek. Biarkan tabung pada
suhu kamar semalaman dan ambil kembali keesokan harinya. Sementara bakteri
mendingin diatas es, beri label pada keempat IX-SPT plate A, B, C, dan D dan dapat
menambahkan tanggal dan Inisial grup lab atau nomor grup. Kemudian atur pipet p200
ke 100 μL dan letakkan diujungnya. Kibaskan tabung A beberapa kali. Kemudian trasfer
100 μL ke plate A dan buang ujungnya. Gunakan loop baru untuk menyebarkan cairan
secara merata ke seluruh plate, kemudian buang loop setelah selesai. Ulangi proses ini
untuk sampel B,C dan D.Menggunakan ujung pipet baru dan loop baru setiap saat. Lalu
susun plate dan rekatkan. Balik tumpukan plate dan inkubasi secara terbalik. Jika
memiliki inkubator 37 oC, inkubasi selama 24 jam. Jika tidak memiliki inkubator 37 oC,
dapat membiarkannya pada suhu kamar selama tiga hari dalam kegelapan karena X-gal
peka cahaya. Simpan inkubator diruangan gelap atau letakkan beberapa foil untuk
membungkus. Tumpukannya dengan longgar tetapi jangan terlalu ketat sehingga tidak
membuat lemas . Hari setelah 37 oC atau tiga hari pada suhu kamar, lihatlah cawan
apakah melihat koloni, apa warnanya, jika tidak ada koloni biru. Taruh cawan di lemari
es selama lima hari dan periksa lagi. Pada percobaan ini peneliti tidak ingin memberikan
hasil lab, tetapi beberapa fenotipe dapat dilihat setelah lab, yaitu tidak ada koloni putih
dan koloni biru. Apa yang diharapkan untuk melihat DNA dengan lac Z dipotong dan
tidak diperbaiki dengan stop kodon. Hasil yang diharapkan setiap plate:

Gambar 2.3. Hasil yang diharapkan.

 15

III. KESIMPULAN
Pada acara 5 ini terdapat 2 video. Video pertama yang berjudul “Nobel Lecture:
Jennifer Doudna, Nobel Prize in Chemistry 2020” menjelaskan pengertian crispr beserta
cara cripsr beroperasi dalam bakteri yang tumbuh sedang terinfeksi virus disuntikkan
DNA nya kedalam sel, sel dapat memperoleh sebagian kecil darinya dan masuk kedalam
lokus crispr suatu tempat didalam genome yang terdiri dari urutan berulang yang
mengapit dari virus yang disebut spacer dan sel kemudian membuat salinannya dalam
bentuk RNA yang kemudian diolah menjadi unit yang menyertakan urutan yang berasal
dari virus yang digabungkan dengan RNA tersebut. Dalam video tersebut juga dijelaskan
penelitian-penelitian dari Jennifer Doudna.

Video yang kedua yang berjudul “CRISPR Gene Editing: Using CRISPR-Cas9
with the Out of the Blue CRISPR Kit” menjelaskan teknologi CRISPR untuk memotong
DNA, namun perlu diketahui 2 hal penting saat mengedit dengan gen CRISPR yaitu ,
memotong dan juga memperbaiki. Pada lab ini, digunakan e coli yang memiliki gen lacZ
yang berfungsi. Kemudian digunakan CRISPR-cas9 untuk memotong DNA dan
kemudian memperbaiki kerusakan dengan memasukkan DNA donor. Telah direkayasa
pula donor DNA khusus ini dengan stop kodon. Jadi ketika donor DNA dimasukkan ke
dalam lacZ gen yang telah dipotong, terjemahan urutan akan berhenti lebih awal dan lacZ
tidak lagi berfungsi sebagaimana mestinya. Tanpa gen lacZ yang berfungsi, bakteri akan
berwarna putih bahkan saat tumbuh di dalam media yang mengandung X-gal.
 16

DAFTAR PUSTAKA

Abdallah, N.A., Prakash, C.S. & McHughen, A.G. (2015) Genome editing for crop
improvement: Challenges and opportunities. GM Crops & Food. 6 (4), 183– 205.

Araki M & Ishii T. (2015). Towards social acceptance of plant breeding by genome editing.
Trends in plant science. 20(3), 145-149.

Beetham, P.R., Kipp, P.B., Sawycky, X.L., Arntzen, C.J. & May, G.D. (1999) A tool for
functional plant genomics: Chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-
specific mutations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States
of America. 96 (15), 8774–8778.

Bogdanove, A.J., Donovan, D.M., Elorriaga, E., Kuzma, J., Pauwels, K., Strauus, S.H. &
Voytas, D.F. (2018) Genome editing in agriculture: Methods, applications and
governance. CAST Issue Paper, 60.

Jiang, W, Bikard, D, Cox, D, Zhang, F, & Marraffini, LA. (2013). RNA-guided editing of
bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology. 31(3), 233- 239.

Ledford, H. (2015). CRISPR, the disruptor. Nature. 522(7554), 20-24.

Ledford, H. (2016): Riding the CRISPR Wave. Nature, 531(7593), 156-159.

Schinkel, H. & Schillberg, S. (2016) Genome editing: Intellectual property and product
development in plant biotechnology. Plant Cell Reports. 35 (7), 1487–1491.

Pennisi, E. (2013). The CRISPR craze. Science. 341(6148), 833-836.

Puchta H, Fauser F. (2013). Gene targeting in plants: 25 years later. The International Journal
of Developmental Biology. 57, 629-637

Qaim, M, & Zilberman, D. (2003). Yield effects of genetically modified crops in developing
countries. Science. 299(5608), 900-902.

Schinkel H & Schillberg S. (2016): Genome editing: intellectual property and product
development in plant biotechnology. Plant cell reports, 1-5.

Shan, Q., Wang, Y., Li, J., Zhang, Y., Chen, K., Liang, Z., Zhang, K., Liu, J., Xi, J.J., Qiu, J.L.
& Gao, C. (2013) Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas
system. Nature Biotechnology. 31 (8), 686–688.
 17

Sprink T, Metje J, Hartung F. (2015). Plant genome editing by novel tools: TALEN and other
sequence specific nucleases. Current Opinion in Biotechnology. 32, 47-53.