1.

Tujuan
Tujuan Praktikum

◎ Melakukan Rekayasa Reaksi Enzimatis menggunakan

Bioreaktor
◎ Mengamati Perilaku reaksi pembentukan produk dalam
bioreaktor

4
2. Teori Dasar
 Bioreaktor

◎ Bioreaktor merupakan perangkat yang diproduksi,

direkayasa atau sistem yang mendukung lingkungan biologis
aktif di mana proses kimia dilakukan yang melibatkan
organisme atau zat biokimia aktif yang berasal dari
organisme tersebut. Proses ini dapat menjadi proses aerobik
atau anaerobik (Admin, 2016).

◎ Atas dasar modus operasi, bioreaktor dapat diklasifikasikan

sebagai batch, fed batch atau kontinyu.
Gambar 2.1. Bioreaktor Lambda Minifor
Sumber : lambda-instruments.com

6
 Bioreaktor

◎ Bioreaktor dapat digunakan untuk kultivasi sel atau mikroba,

mengubah barang mentah (raw material) menjadi barang jadi
dengan menggunakan proses bio.

◎ Kinerja bioreaktor dipengaruhi oleh pH, suhu, oksigen yang

terlarut, serta bahan baku dan nutrisi.

Gambar 2.1. Bioreaktor Lambda Minifor

Sumber : lambda-instruments.com

7
 Biokatalis

◎ Bioreaktor dapat menggunakan enzim sebagai katalis

untuk mempercepat reaksi.
◎ Enzim adalah biokatalisator organik yang dihasilkan
organisme hidup di dalam protoplasma, yang terdiri
atas protein atau suatu senyawa yang berikatan dengan
protein (Administrator, 2019).

Gambar 2.2 Mekanisme Biokatalis

Sumber : nafiun.com

8
 Biokatalis

◎ Enzim hanya mengubah kecepatan reaksi, artinya enzim

tidak mengubah produk akhir yang dibentuk atau
mempengaruhi keseimbangan reaksi dan bekerja secara
spesifik.
◎ Enzim mengkatalis reaksi dengan cara meningkatkan
laju reaksi. Enzim meningkatkan laju reaksi dengan cara
menurunkan energi aktivasi.
◎ Penurunan energi aktivasi dilakukan dengan
membentuk kompleks dengan substrat. Setelah produk
dihasilkan, kemudian enzim dilepaskan. Gambar 2.2 Mekanisme Biokatalis
Sumber : nafiun.com

9
Lipase dan Hidrolisis Lemak

◎ Lipase merupakan biokatalisator yang mempunyai kemampuan

mengkatalisis reaksi hidrolisis lipid menjadi asam lemak dan gliserol.
◎ Enzim lipase merupakan enzim yang dapat menghidrolisis trigliserida
menjadi asam lemak bebas (ALB), gliserida (digliserida dan monogliserida)
serta gliserol (Winarno, 1995).
◎ Reaksi enzim lipase merupakan reaksi yang terjadi secara bertahap yang
menghasikan digliserida dan monogliserida sebagai senyawa antara. Reaksi
hidrolisis ini dapat dilihat pada Gambar 2.4.

10
Lipase dan Hidrolisis Lemak

Gambar 2.3 Hidrolisis Lemak oleh Lipase

Sumber: https://phoenixhillna.org/kinetika-enzim/

Gambar 2.4 Reaksi Enzim LIpase

Sumber: repository.usu.ac.id
11
 Bilangan Asam

◎ Bilangan asam adalah bilangan yang menunjukkan jumlah miligram basa

kuat yang dibutuhkan untuk menetralkan asam lemak bebas yang terdapat
dalam gram minyak/lemak (Suroso, 2013) .

◎ Bilangan asam yang besar menunjukkan kualitas yang rendah karena asam
lemak bebas yang besar pula, yang berasal dari hidrolisa minyak atau lemak,
ataupun karena proses pengolahan yang kurang baik. Besarnya bilangan
asam tergantung dari kemurnian dan umur dari minyak tersebut.

12
Bilangan Asam

◎ Bilangan asam dapat dihitung dengan menentukan jumlah miligram KOH

(Kalium Hidroksida) yang dibutuhkan untuk menetralkan asam-asam
lemak bebas dari satu gram minyak atau lemak melalui proses titrasi.

13
Kinetika Enzimatis
◎ Laju dari kinetika enzim ini mempunyai
pengaruh dari reaksi enzimatik
◎ Michaelis –Menten  laju awal reaksi
enzimatis dapat ditentukan
berdasarkan fungsi terhadap
konsentrasi substrat dan parameter yg
berpengaruh dalam enzim
◎ Kinetika enzimatis enzim lipase dapat Keterangan
dilihat pada persamaan berikut
TG = Trigliserida
FFA = Free Fatty Acid
E = Enzim
K= Konstanta
Pembentukan Produk
14
3. Alat dan Bahan
Alat dan Bahan

◎ Alat
○ Labu ukur 25 mL, 50 ml
○ gelas beaker 50 mL ,100 mL
○ spatula
○ pipet tetes
○ kaca arloji
○ corong kaca
○ batang pengaduk
○ pH meter
○ magnetic stirrer
○ pipet volum 10 mL ,25 mL
○ Erlenmeyer 250 mL
○ buret 10 mL
○ Neraca analitik
○ Lambda Minifor
◎ Bahan
○ 0.3402 g KH2PO4
○ 0.4355 g K2HPO4
○ 25 mg Candida rugosa lipase
○ 100 mL minyak goreng
○ 25 mL Larutan enzim
○ Indikator PP (Phenolpthalein) 1%
○ KOH 0,1 N
○ Asam Oksalat
16
Analisis Alat dan Bahan

◎ Candida rugosa lipase

○ Merupakan enzim lipase yang didapatkan dari jenis fungi Candidia
rugosa. Enzim lipase berfungsi sebagai biokatalisator dalam reaksi
hidrolisis trigliserida menjadi asam lemak dan gliserol.

◎ KH2PO4 & K2HPO4

○ Merupakan larutan penyangga yang digunakan untuk
mempertahankan pH larutan dikarenakan penggunaan enzim yang
memerlukan pH yang stabil

17
Analisis Alat dan Bahan

◎ Minyak goreng
○ Mengandung trigliserida untuk kemudian dihidrolisis
◎ KOH
○ Sebagai agen yang akan menetralkan asam lemak sehingga sebagai
parameter perhitungan asam lemak

◎ Asam Oksalat
○ Sebagai larutan asam yang digunakan dalam menetralkan KOH dan
untuk standarisasi larutan KOH

18
4. Prosedur Percobaan
1. Pembuatan Larutan Buffer Fosfat

Melarutkan bahan tersebut

Menimbang 0,402 g KH2PO4
dengan aquades di dalam Mengukur nilai pH
dan 0,4355 g K2HPO4
labu ukur 50 ml

Analisis:
• Proses penimbangan dilakukan dengan neraca analitik karena memiliki ketelitian yang
tinggi.
• Buffer adalah larutan yang dapat mempertahankan nilai pH.
• Larutan buffer terdiri dari campuran asam lemah dan basa konjugasi.
• Pada percobaan ini, asam lemah adalah H2PO4- dan basa konjugasi adalah HPO42-
• Pengukuran nilai pH dilakuakn dengan pH meter supaya akurat.
• Buffer ini digunakan karena pH bernilai 6-7, sesuai dengan pH optimum enzim lipase yang
akan digunakan.
2. Pembuatan Larutan Enzim Lipase

Menambahkan 25 ml Mengaduk larutan

Menyiapkan 5 mg Mencatat konsntrasi
buffer fosfat ke dalam dengan stirrer agar
dan 25 mg Candida larutan yang dibuat
dua glass beaker 50 buffer dan enzim
rugosa lipase tersebut (mg/mL)
ml terlarut sempurna

Analisis:
• Lipase adalah enzim yang berfungsi untuk nghidrolisis lemak, yaitu trigliserida menjadi
gliserol dan asam lemak.
Trigliserida + H2O  3 Asam Lemak + Gliserol

• Konsentrasi yang dihasilkan larutan pertama adalah 1 mg/ml dan larutan kedua adalah 0,2
mg/ml

21
 3. Eksperimen Hidrolisis Minyak

Masukkan larutan
Pada saat yang
enzim 1 ke bioreaktor Mengatur
Menyiapkan sama, melakukan pre
dan memanaskan pengadukan sebesar
bioreaktor heating 100 ml
sampai suhu stabil 0,5 Hz
minyak
37oC

Mengambil sampel
Mencampurkan Lakukan kembali
Mengambil sampel pada t=10 dan 30
larutan minyak ke percobaan tersebut
t=0 menit dari minyak menit, masing-
dalam larutan enzim dengan larutan
sebanyak 10 ml masing sebanyak 10
dalam bioreactor enzim 2
ml

Analisis:
• Bioreaktor diatur pada suhu 37C karena itu adlah suhu optimum untuk enzim lipase
• Preheating dan pengadukan dilakukan untuk mendorong terjadinya hidrolisis dengan
mempebanyak tumbukan
• Sample diambil dalam berbagai waktu untuk melihat perubahan yang terjadi
22
4. Standardisasi KOH 0.1 N
Larutan diambil
Melarutkan ke dalam sebanyak 25 ml
Menimbang 0,63 g Menambahkan 2
labu ukur 100 ml dengan pipet ke
Asam Oksalat tetes PP
dan dihomogenkan dalam labu
Erlenmeyer 250 ml

Menitrasi dengan
Melakukan duplo
KOH 0,1 N

Analisis:
• KOH berfungsi sebagai larutan titran dalam titrasi larutan sampel
• Standardisasi bertujuan untuk menguji apakah larutan yang akan digunakan benar
memiliki konsentrasi 0,1 N.
• Asam oksalat dipilih karena memiliki sifat yang sama dengan larutan sampel yang akan
ditirasi, yaitu lbersifat asam lemah. 23
 5. Analisis Kandungan Asam Lemak bebas
Menitrasi dengan
Mengambil 10 ml
KOH 0,1 N hingga
sampel minyak ke Melarutkan dengan Menambahkan 2 tetes
berwarna agak merah
dalam Erlenmeyer 50 ml ethanol hangat indikator PP
muda sebagai titik
250 ml
akhir titrasi

Mencatat volume Melakukan

KOH yang diperlukan perhitungan

Analisis:
• Titrasi dilakukan untuk menentukan banyaknya asam lemak pada larutan sampel
• Ethanol digunakan untuk melarutkan minyak karena kepolarannya tidak jauh dari minyak,
sehingga dapat larut.
• Indikator PP digunakan untuk mengetahui titik ekuivalen titrasi
• Jumlah KOH yang diperlukan utnuk titrasi lalu digunakan dalam perhitungan. 24
5. Data Pengamatan
 m K2HPO4 (gr) 0,4238
m KH2PO4 (gr) 0,3969
pH Buffer 6,98 Massa C. rugosa t (menit) V KOH (ml)

0 0,5
m C. rugosa (mg) 25 5
25 mg 10 0,9
V Buffer Fosfat (ml) 25 25
Konsentrasi Larutan Enzim (mg/ml) 1 0,2 30 1,4
m KOH (gr) 1,4011
0 1,4
m As. Oksalat (gr) 0,6311
5 mg 10 1,8
Mr KOH 56
Mr As. Oksalat 90 30 2,3
V As. Oksalat yg dititrasi 25
V KOH yg dititrasi (1) 27
V KOH yg dititrasi (2) 29
V KOH rata2 28

26
6. Pengolahan Data
1. Konsentrasi Asam Lemak Bebas

◎ Standarisasi KOH
𝑚 1000
Melakukan standarisasi KOH 𝑁= ×
𝑀𝑟 𝑚𝑙 𝐿𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛
× 𝐹𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑃𝑒𝑛𝑔𝑎𝑙𝑖
sebanyak 2 kali dan didapatkan hasil
0,63 𝑔𝑟 1000
titrasi KOH sebanyak 27 ml dan 29 ml 𝑁𝑜𝑘𝑠𝑎𝑙𝑎𝑡 = × × 2 = 0,14 𝑁
90 100 𝑚𝑙
dengan rata-rata 28 ml
𝑁𝐾𝑂𝐻 × 𝑉𝐾𝑂𝐻 = 𝑁𝑂𝑘𝑠𝑎𝑙𝑎𝑡 × 𝑉𝑜𝑘𝑠𝑎𝑙𝑎𝑡

𝑁𝑂𝑘𝑠𝑎𝑙𝑎𝑡 × 𝑉𝑜𝑘𝑠𝑎𝑙𝑎𝑡 0,14 𝑁 × 25 𝑚𝑙

𝑁𝐾𝑂𝐻 = =
𝑉𝐾𝑂𝐻 𝟐𝟖 𝒎𝒍
= 0,125 N

28
1. Analisis

◎ Standarisasi KOH dilakukan untuk menentukan apakah KOH yang

digunakan memiliki konsentrasi tepat 0,1 atau tidak

◎ Dilakukan titrasi KOH didapatkan volume sebesar 27 ml dan 29 ml

dengan rata-rata 28 ml, untuk mengubah warna Asam Oksalat
menjadi pink. Perubahan warna yang terjadi, menunjukkan Asam
sudah menjadi Basa

29
1. Analisis

◎ Dilakukan perhitungan, didapatkan hasil konsentrasi asam oksalat

sebesar 0,14 N

◎ Dari data konsentrasi asam oksalat, dapat dihitung konsentrasi KOH

dan didapatkan hasil sebesar 0,125 N

30
1. Konsentrasi Asam Lemak Bebas

◎ 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐾𝑂𝐻 ≈ 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐹𝐹𝐴

◎ 𝑀𝐾𝑂𝐻 × 𝑉𝐾𝑂𝐻 = 𝑀𝐹𝐹𝐴 × 𝑉𝐹𝐹𝐴

V KOH
Enzim t (menit) V FFA (ml) M KOH (M) mmol KOH mmol FFA M FFA
(ml)
0 0.5 10 0.125 0.0625 0.0625 0.00625
25 mg 10 0.9 10 0.125 0.1125 0.1125 0.01125
30 1.4 10 0.125 0.175 0.175 0.0175
0 1.4 10 0.125 0.175 0.175 0.0175
5 mg 10 1.8 10 0.125 0.225 0.225 0.0225
30 2.3 10 0.125 0.2875 0.2875 0.02875

31
1. Konsentrasi Asam Lemak Bebas
0,035

0,03

0,025

0,02

0,015

0,01

0,005

0
0 10 30

25 mg 5 mg

Grafik Hubungan Konsentrasi FFA dengan Waktu pada Enzim 5 mg dan 25 mg

32
1. Analisis

◎ Dapat dilihat dari tabel perhitungan dan grafik, semakin lama waktunya,
semakin banyak molFFA yang terbentuk. Hal ini karena enzim yang
memudahkan proses pemecahan trigliserida menjadi asam lemak bebas
dan gliserol. Volume KOH yang meningkat juga menunjukkan bahwa
jumlah FFA yang terhidrolisis semakin banyak.

◎ Pada grafik, ditunjukkan bahwa enzim 5 mg dan enzim 25 mg meningkat

secara konstan. Hanya saja konsentrasi FFA pada enzim 5 mg lebih besar
pada awalnya, tetapi kedua garis menunjukkan peningkatkan yang konstan

33
2. Perhitungan Derajat Hidrolisis

◎ Menghitung % DH atau derajat hidrolisis pada waktu tertentu

dengan persamaan :

◎ Memplot nilai % DH terhadap waktu

34
 2. Perhitungan Derajat Hidrolisis

Pengolahan Data
Enzim t (menit) CFFA,t CFFA,0 CFFAtotal %DH

0 0,0063 0,0063 0,0000

25 mg 10 0,0113 0,0063 0,0351 14,2857

30 0,0175 0,0063 32,1429

0 0,0175 0,0063 16,3636

5 mg 10 0,0225 0,0063 0,0689 23,6364

30 0,0288 0,0063 32,7273

35
 2. Perhitungan Derajat Hidrolisis
% DH vs waktu
35,0000
• Derajat hidrolisis adalah banyaknya zat yang
bereaksi dengan air (reaksi hidrolisis)
30,0000 dibanding dengan banyaknya zat sebelum
terjadi hidrolisis (Rukim, 2015).
25,0000 • Semakin bertambahnya waktu, maka volume
KOH akan semakin banyak sehingga
konsentrasi komponen FFA yang terhidrolisis
20,0000
%DH

15,0000
25 mg semakin meningkat.
5 mg • Peningkatan reaksi hidrolisis ini
10,0000 menunjukkan semakin banyaknya zat FFA
yang bereaksi dengan air sehingga % DH juga
5,0000 meningkat setiap bertambahnya waktu.
• Oleh karena itu, peningkatan waktu
0,0000
0 10 30 berbanding lurus dengan peningkatan
t (menit) derajat hidrolisis.
Gambar 6.2 Grafik Hubungan antara
Derajat Hidrolis dengan Waktu 36
 3. Perhitungan Bilangan Asam
N 0,125 N
BM KOH 56,1 g/mol

𝟓𝟔, 𝟏 × 𝑵 × 𝑽 V sampel minyak 10 ml

𝑨𝒄𝒊𝒅 𝑽𝒂𝒍𝒖𝒆 𝑨𝑽 = ρ minyak (25℃) 0,8875 g/cm3
𝒎
ρ minyak (37℃) 0,8815 g/cm3

N = Normalitas dari KOH yang digunakan (N) enzim t (menit) V KOH (ml)
m minyak
AV
(gr)
V = Volume KOH yang digunakan untuk titrasi
0 0,5 8,875 0,39507
(mL)
m = massa dari minyak yang digunakan (gram) 25 10 0,9 8,815 0,715967
56,1 = berat molekul KOH 30 1,4 8,815 1,113727
0 1,4 8,875 1,106197
5 10 1,8 8,815 1,431934
30 2,3 8,815 1,829694

37
 3. Analisis Bilangan Asam

Grafik waktu terhadap bilangan asam

2
◎ Pada grafik terlihat bahwa
1,8
bilangan asam yang dihasilkan
1,6 pada penambahan enzim
1,4 sebesar 25mg lebih besar
1,2 dibandingkan penambahan
AV

1
enzim 25mg enzim 5mg
0,8
0,6
enzim 5mg
◎ Hal ini dikarenakan semakin
0,4
banyak katalis yang
membantu berjalannya reaksi
0,2
0
0 5 10 15 20 25 30 35 hidrolisis trigliserida pada
t
minyak menjadi asam lemak

38
 3. Analisis Bilangan Asam

Grafik waktu terhadap bilangan asam ◎ Hal ini terlihat juga pada
2 volume KOH yang dibutuhkan
1,8
1,6
untuk menetralkan asam
1,4 lemak
1,2
◎ Pada sampel dengan berat
AV

1
0,8
enzim 25mg enzim yang lebih besar maka
0,6
enzim 5mg
lebih banyak volume KOH
0,4 yang dibutuhkan
0,2
0 ◎ Sehingga hal ini menunjukan
0 5 10 15
t
20 25 30 35
semakin banyak asam lemak
yang dihasilkan

39
4. Kinetika Reaksi

𝑇𝐺 3𝐹𝐹𝐴 + 𝐺𝑙𝑖𝑠𝑒𝑟𝑜𝑙
𝑘1

𝑑 𝐶𝑇𝐺
− = 𝑘𝐶𝑇𝐺
𝑑𝑡

𝑑(𝐶𝑇𝐺 )
= −𝑘 𝑑𝑡
𝐶𝑇𝐺
Keterangan
𝐶𝑇𝐺 𝑡
𝑑(𝐶𝑇𝐺 )
= −𝑘 𝑑𝑡
𝐶𝑇𝐺𝑜 𝐶𝑇𝐺 0 TG = Trigliserida
FFA = Free Fatty Acid
E = Enzim
𝐶𝑇𝐺
ln = −𝑘𝑡 K= Konstanta
𝐶𝑇𝐺𝑜 Pembentukan Produk

40
4. Kinetika Reaksi
• Dengan,
– CTGo = 1/3CFFAtotal

• Sehingga,
𝐶𝐹𝐹𝐴𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 − 𝐶𝐹𝐹𝐴
𝐶𝑇𝐺 =
3

𝐶𝑇𝐺
• Dengan melakukan substitusi, persamaan ln = −𝑘𝑡 dapat dituliskan sebagai
𝐶𝑇𝐺𝑜

𝐶𝐹𝐹𝐴𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 − 𝐶𝐹𝐹𝐴
ln 3 = −𝑘𝑡
𝐶𝐹𝐹𝐴𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙
3

𝐶𝐹𝐹𝐴𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 − 𝐶𝐹𝐹𝐴
ln = −𝑘𝑡
𝐶𝐹𝐹𝐴𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙
41
4. Kinetika Reaksi

• Persamaan tersebut dapat dibuat sebuah persamaan garis lurus dengan nilai y, m, dan x
sebagai berikut.

𝐶𝐹𝐹𝐴𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 − 𝐶𝐹𝐹𝐴
ln = −𝑘 𝑡
𝐶𝐹𝐹𝐴𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙

y m y

42
4. Kinetika Reaksi

• Dari perhitungan sebelumnya, didapat data yang disusun pada tabel berikut ini.

Untuk enzim 25 mg: Untuk enzim 5 mg:

t CFFA ln CFFA t CFFA ln CFFA

0 0,00625 -0,19609 0 0,0175 -0,29302
10 0,01125 -0,38642 10 0,0225 -0,39536
30 0,0175 -0,6903 30 0,0288 -0,54128
Total 0,0351 Total 0,0689

43
4. Kinetika Reaksi

• Maka, dapat dibuat persamaan garis sebagai berikut.

ln (CFFAtotal-CFFA)/CFFAtotal vs Waktu
ln (CFFAtotal-CFFA)/CFFAtotal vs Waktu 0
0 5 10 15 20 25 30 35
-0,1

-0,2
enzim 25mg
-0,3
enzim 5mg
-0,4 Linear (enzim 25mg)
Linear (enzim 25mg)
-0,5
y = -0,0081x - 0,3014 Linear (enzim 5mg)
R² = 0,9921
-0,6 Linear (enzim 5mg)
y = -0,0163x - 0,2071
-0,7
R² = 0,9966
-0,8
t(waktu)

44
4. Kinetika Reaksi

• Dari hasil linearisasi, didapat persamaan garis sebagai berikut dan nilai k sebagai berikut.

Untuk enzim 25 mg: Untuk enzim 5 mg:

y = -0,0163x – 0,2071 y = -0,0081x – 0,3844

m = -k m = -k
maka k = 0,0163/min maka k = 0,0081/min

45
7. Analisis Kesalahan
Analisis Kesalahan

◎ Pada saat titrasi, jumlah titrasi KOH terlalu banyak sehingga hasil
konsentrasi FFA tidak tepat.
◎ Saat menimbang bahan, angka pada timbangan kurang akurat sehingga
mempengaruhi hasil percobaan
◎ Ketika pengambilan sampel, tidak tepat pada menit ke 10 dan 30,
sehingga mempengaruhi hasil yang kurang tepat

47
8. Kesimpulan
Kesimpulan

◎ peningkatan waktu berbanding lurus dengan peningkatan derajat hidrolisis

karena semakin banyak zat yang mengalami reaksi hidrolisis
◎ semakin lama waktu tinggal, maka semakin banyak asam lemak yang terbentuk
sehingga peningkatan waktu tinggal dengan peningkatan asam lemak
berbanding lurus
◎ Semakin banyak katalis yang ditambahkan maka semakin besar nilai dari
bilangan asam dikarenakan semakin banyak asam lemak yang dihasilkan yang
diindikasikan oleh semakin peningkatan volume KOH yang dibutuhkan untuk
menetralkan asam lemak
◎ Nilai k untuk enzim 25 mg adalah 0,0163/min
◎ Nilai k untuk enzim 5 mg adalah 0,0081/min

49