Lecture Note 31S3101 FISIOLOGI Semester Gasal T.A.

2021/2021

Genomik dan Proteomik

Bagian_1

Bab ini membahas mengenai tehnik-tehnik biologi molekuler yang digunakan untuk mempelajari

urutan DNA, ekspresi gen, interaksi DNA-protein, dan interaksi protein-protein. Pada bab ini dibahas

mengenai tehnik-tehnik yang digunakan dalam genomik dan proteomik serta bagaimana

pengetahuan dan informasi yang diperoleh dapat digunakan untuk mempelajari fisiologi mikroba dan

evolusi.

I. GENOMIK

Genomik adalah studi tentang seluruh genom dari suatu organisme; yang mencakup di

dalamnya studi tentang struktur, fungsi, evolusi, pemetaan gen dan pengeditan gen.

1.1. Kloning Genom

Kloning genom dilakukan untuk mempelajari urutan DNA dari genom suatu organisme. Kromosom
DNA suatu organisme diisolasi, dipotong dengan enzim restriksi sehingga menghasilkan fragmen-
fragmen DNA berukuran < 2 kb yang overlap. Fragmen-fragmen hasil pemotongan tersebut diklon
ke dalam vektor melalui proses ligase, kemudian dimasukkan ke dalam sel inang E. coli sehingga
dihasilkan banyak klon E.coli yang masing-masing membawa fragmen DNA yang berbeda. Strategi
ini dikenal dengan istilah “shotgun cloning” yang merupakan kebalikan dari strategi kloning langsung
yang membutuhkan identifikasi secara teliti terhadap fragmen DNA tertentu yang mengkode gen
yang spesifik. Hasil dari shotgun cloning adalah klon yang random yang dapat ditentukan urutan
DNA nya dan menghasilkan pustaka DNA suatu organisme. Dengan metode yang diotomatisasi
dibutuhkan hanya beberapa hari untuk menentukan urutan genom suatu organisme.

1
RFK_Institut Teknologi Del
Lecture Note 31S3101 FISIOLOGI Semester Gasal T.A. 2021/2021

Gambar 1. Pemotongan parsial untuk menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang overlap.

(Jeremy W. Dale and Malcolm von Schantz, 2002)

Gambar 2. Membuat genomic library

(Jeremy W. Dale and Malcolm von Schantz, 2002)

2
RFK_Institut Teknologi Del
Lecture Note 31S3101 FISIOLOGI Semester Gasal T.A. 2021/2021

1.2. Sekuensing DNA

Penentuan urutan DNA dilakukan dengan metode sekuensing DNA. Metode sekuensing DNA yang
banyak digunakan adalah metode dideoksi Sanger (Sanger dan Coulson, 1975). Satu untai DNA
digunakan sebagai cetakan untuk sintesis serangkaian fragmen-fragmen DNA, dimana setiap
fragmennya berukuran lebih panjang hanya satu basa dari fragmen sebelumnya. Sintesis ini
membutuhkan primer yang berukuran 20 -25 basa yang berikatan pada urutan spesifik pada vektor.
Primer diperpanjang dengan bantuan enzim DNA polimerase.

Pada sekuensing DNA selain dNTP juga ditambahkan ddNTP (dideoxynucleotide triphosphate),
dimana gula pentosanya kehilangan gugus –OH pada atom C2 dan C3. DNA polimerase tidak dapat
membedakan dNTP dan ddNTP. Jika DNA polimerase memilih menambahkan ddNTP pada rantai,
maka fragmen DNA yang dihasilkan tidak memiliki –OH bebas pada ujungnya (ujung 3’) sehingga
polimerisasi lebih lanjut tidak terjadi atau terhenti. Molekul ddNTP berperan sebagai pemutus rantai,
sehingga basa yang terdapat pada ujung 3’ DNA hasil sintesis dengan sendirinya adalah basa yang
dibawa oleh molekul ddNTP.

Pada sekuensing dengan metode Sanger dan Coulson yang telah dikembangkan,
dideoksinukleotida diberi label dengan senyawa berfluoresensi yang berpendar pada panjang
gelombang yang berbeda-beda. Metode ini dikenal dengan dye terminator DNA sequencing. Dengan
metode ini, setiap fragmen DNA yang dihasilkan akan memiliki basa yang berfuorsens pada
ujungnya.

Untuk membaca urutan DNA, campuran berbagai ukuran fragmen DNA berlabel dipisahkan dengan
elektroforesis gel poliakrilamid. Hasil elektroforesis ini adalah urutan fragmen-fragmen DNA yang
terpisah pada gel dimana berbeda ukuran hanya 1 basa dengan fragmen DNA sebelumnya. Alat
detektor laser optik akan mendeteksi ujung fragmen DNA yang berfluoresens dan warna yang
diemisikan sebagai basa DNA yang spesifik.

Pada shotgun cloning, dimana fragmen-fragmen DNA adalah dengan ujung yang overlap, dengan
analisis komputer terhadap fragmen-fragmen DNA tersebut akan mengidentifikasi dan menyatukan
fragmen yang overlap menjadi contig (urutan DNA yang berkesinambungan). Dengan pengisian
gap, contig kemudian disatukan menjadi genom yang lengkap dan siap untuk dianotasi. Anotasi
adalah proses dimana gen potensial, yang dikenal dengan istilah open reading frame (ORF)
diidentifikasi dengan mencari urutan spesifik seperti kodon pemula yang berdekatan dengan

3
RFK_Institut Teknologi Del
Lecture Note 31S3101 FISIOLOGI Semester Gasal T.A. 2021/2021

potensial ribosom binding site (RBS). Urutan DNA ORF tersebut dan perkiraan protein yang
dikodenya dibandingkan dengan gen dan protein yang sudah ada di bank data untuk melihat
kesamaannya (homologinya). Berdasarkan hasil tersebut, ORF dapat dianotasi memiliki fungsi yang
potensial.

Gambar 3. Sekuensing DNA. Templat DNA disekuensing menggunakan oliogonukleotida sebagai primer, DNA polimerase,
deoksinukleotida, dan dideoksinukleotida dengan konsentrasi rendah. Masing-masing dideoksinukleotida ditandai dengan
penanda berfluoresens yang berbeda warna. Setiap fragmen DNA yang disintesis hanya memiliki satu dideoksinukleotida
yang berinkorporasi pada ujung 3’. Oleh karena itu, setiap fragmen DNA yang dihasilkan akan bertanda pewarna
berfluoresens yang oleh sinyal akan diidentifkasi sebagai basa terakhir. Untuk membaca urutan DNA, campuran fragmen
DNA dilektroforesis pada tabung kapiler menggunakan gel poliakrilamid dimana fragmen-fragmen DNA akan dipisahkan
berdasarkan ukuran. Detektor laser diposisikan dekat dengan dasar gel untuk mendeteksi warna fluoresens yang
dihasilkan oleh setiap fragmen DNA (Moat, 2002).

1.3. Web Science: Perangkat Internet untuk Analisis Urutan DNA

Saat ini sudah banyak perangkat lunak komputer yang dapat digunakan untuk menganalisa urutan
DNA. Internet repositori utama untuk urutan gen adalah EMBL (Eropah) dan GenBank (USA).
Database ini dapat diakses melalui sejumlah situs web seperti laman National Institutes of Health
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) atau laman European Bioinformatics Institute
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/index.html). Melalui program seperti BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool) atau FASTA, dapat dibandingkan urutan DNA atau mendeduksi urutan protein terhadap
semua urutan DNA atau protein yang telah diketahui. Program-program ini menggunakan
perhitungan statistik untuk mengidentifikasi urutan signifikan dan mencocokkan antara urutan DNA
/protein yang diberikan dengan urutan DNA/protein yang ada pada database. Beberapa laman yang
berhubungan dengan analisis urutan DNA dapat dilihat pada Tabel 1.

4
RFK_Institut Teknologi Del
Lecture Note 31S3101 FISIOLOGI Semester Gasal T.A. 2021/2021

Tabel 1. Situs web untuk Genomik dan Proteomik

Sumber: Moat, 2020

Genomik telah memberikan beberapa wawasan yang menarik bagi seleksi dan pertahanan hidup

spesies. Sebagai contoh; dua bakteri patogen H. influenzae dan Mycoplasma pneumoniae,

keduanya menginfkesi saluran pernafasan, tapi memiliki strategi yang berbeda dalam memperoleh

zat terlarut. Analisis genom H. influenzae menunjukkan bahwa organisme ini memiliki transporter

untuk 13 asam amino yang berbeda dan peptida kecil. Sebaliknya, genom M. pneumoniae hanya

mengkode 3 transporter potensial yang memilik spesifitas terhadap asam amino. Spesies ini mungkin

mengalami evolusi reduktif dari asal gram-positif yang telah kehilangan gen-gen transporter dan

menggunakan transporter yang lebih kecil tapi memiliki spesifitas substrat lebih luas. Kedua spesies

5
RFK_Institut Teknologi Del
Lecture Note 31S3101 FISIOLOGI Semester Gasal T.A. 2021/2021

menempati ceruk yang sama, tapi menggunakan pendekatan yang berbeda dalam memperoleh zat

terlarut. Contoh ini menunjkkan bahwa kemampuan untuk membandingkan, menganotasi dan

merancang percobaan dengan multi genom menggunakan program komputer akan memiliki

pengaruh yang besar pada percobaan mikrobiologi. Namun harus dicermati bahwa hasil analisis dari

program komputer tersebut masih merupakan prediksi yang hanya dapat dianggap sebagai fungsi

yang potensial. Informasi yang diperoleh dari analisis komputer haruslah dikonfirmasi dengan

metode genetik atau biokimia melalui eksperimen.

1.4. Gene Replacement

Setelah dianalisis dengan program komputer yang menghasilkan prediksi fungsi suatu gen, maka

perlu dilakukan konfirmasi fungsi gen tersebut. Langkah yang bisa dilakukan adalah dengan

memutasi gen tersebut pada organisme yang dikenal sebagai reverse genetics yaitu, gen

diidentfikasi, kemudian dimutasi. Berbagai tehnik dapat digunakan, tapi metode yang lebih mudah

adalah dengan mengklon gen yang dimutasi ke dalam organisme sedemikian rupa sehingga mudah

untuk diseleksi Salah satu metode yang dapat digunakan adalah dengan metode suicide

mutagenesis. Metode ini melibatkan delesi bagian gen yang hendak dimutasi dan menyisipkannya
pada suicide vector.

Pada umumnya suicide vector adalah plasmid yang mengandung gen pengkode resisten antibiotik,

yang hanya bereplikasi pada sel yang mengandung protein spesifik replikasi. Satu-satunya cara

agar plasmid dapat memindahkan gen resistensi antibiotik kepada sel yang kehilangan protein

spesifik replikasi adalah dengan rekombinasi plasmid ke dalam kromosom sel inang, yang

menyebabkan juga gen target terinsersi ke dalam kromosom sel inang. Sel mutan yang telah

mengandung gen target tersebut dapat dianalisa karakter fenotipnya berdasarkan fungsi yang

diprediksi (computer-predicted function).

6
RFK_Institut Teknologi Del
Lecture Note 31S3101 FISIOLOGI Semester Gasal T.A. 2021/2021

Gambar 4. Suicide mutagenesis. Plasmid suicide mengandung gen target dengan fragmen DNA internal yang digantikan
oleh gen penanda resisten antibiotik (pada conoth ini: klorampenikol). Plasmid diklon ke dalam sel inang dan sel dengan
pengkode resisten Cm diseleksi. Sel inang yang resisten Cm hanya akan dihasilkan jika terjadi rekombinasi homolog antara
gen yang dimuatsi pada plasmid dan gen pada kromosom sel inang yang menyebabkan integrasi plasmid ke dalam
kromosom sel inang. Pada contoh ini, plasmid juga mengandung gen pengkode enzim sukrase, suatu enzim yang
menyebabkan sel sensitif terhadap adanya sukrosa. Seleksi lebih lanjt terhadap resistensi sukrosa akan menghasilkan dua
rekombinasi sekunder (ditandai denan dengan I dan II). Kedua rekombinasi tersebut menyebabkan kehilangan plasmid
yang mengkode resistensi Ap. Rekombinasi I menghasilkan kopi gen intact pada kromosom (kehilangan gen resistensi
Cm) sementara rekombinasi II menghilangkan gen intact, tapi terjadi insersi gen A::Cm (gen Cm disisipi oleh gen A)
(Moat, 2002)

1.5. Gen Array

Metode gen array memungkinkan untuk melihat bagaimana perubahan satu sistem biokimia lain

mempengaruhi sintesis semua sistem lainnya dalam sel. Teknologi gen array memungkinkan untuk

melihat ekspresi gen pada semua level genom. Ekspresi setiap gen dapat dimonitor secara simultan

menggunakan DNA microchip. Prinsip dasarnya adalah melekatkan urutan DNA dari setiap gen

suatu organisme pada permukaan pendukung yang solid sedemikian rupa sehingga akan

behibridiasi dengan DNA (atau cDNA) yang bertanda senyawa berfluoresens. Urutan DNA dari

setiap gen ditempatkan pada spot yang terpisah yang diatur sebagai suatu grid pada chip.

Keseluruhan chip hanya berukuran 1 – 2 inchi. Selanjutnya RNA dari sel dikestraksi dan diubah

menjadi complementary DNA (cDNA) menggunakan enzinm reverse transcriptase (DNA polimerase

RNA-dependen). Dengan menginkorporasikan nukleotida bertanda senyawa berfluoresens ke dalam

7
RFK_Institut Teknologi Del
Lecture Note 31S3101 FISIOLOGI Semester Gasal T.A. 2021/2021

campuran reaksi, maka akan dihasilkan molekul cDNA yang bertanda. Masing-masing molekul cDNA

tersebut akan berikatan pada lokasi yang spesifik pada chip yang mengandung gen yang dikodenya.

Laser scanning- dan detektor fluoresens akan membaca permukaan chip, dan komputer
menganalisa gen yang diekspresikan dan yang tidak.

Perbandingan pola ekspresi gen yang dihasilkan oleh satu galur bakteri/jamur yang ditumbuhkan

pada dua kondisi yang berbeda dapat dianalisa menggunakan gen array. Hal ini dapat dilakukan

dengan menandai cDNA dari sel yang ditumbuhkan pada kondisi yang berbeda dengan marka

(warna) fluoresen yang berbeda. Penandaan ini dapat dilakukan selama sintesis cDNA dengan

menginkorporasikan dTTP yang bertanda pada campuran reaksi.

(Moat, 2002)
Gambar 5. Tehnologi gene array. Titik-titik hitam pada array mengindikasikan molekul cDNA yang
berikatan dengan oligonukleotida yang bersesuaian.

8
RFK_Institut Teknologi Del
Lecture Note 31S3101 FISIOLOGI Semester Gasal T.A. 2021/2021

II. PROTEOMIK

Proteomik adalah studi tentang seluruh protein dari suatu organisme; yang mencakup struktur,

karakteristik, fungsi, lokalisasi, interaksi (DNA-protein; protein-protein), modifikasi post translasi.

Banyak protein yang diproduksi oleh sel sebagai respon terhadap stres, sementara tingkat ekspresi

protein lain menurun. Tehnologi gene array dapat memprediksi perubahan proteom yang

berhubungan dengan fluktuasi transkripsi, tapi tidak bisa memprediksi perubahan pada proteom

sebagai hasil dari translasi atau postranslasi. Yang dimaksud adalah, perubahan kondisi

pertumbuhan mungkin tidak mengubah transkripsi gen tertentu, tetapi mempengaruhi translasi

mRNA.

Proteom pada umumnnya dianalisa menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid 2-dimensi. Sel

ekstrak yang mengandung campuran 1000 -2000 protein yang berbeda pertama kali dielektroforesis

dengan elektroforesis isolectric focusing (IEF), yang memisahkan protein berdasarkan muatan

totalnya. Pada IEF, protein diaplikasikan pada suatu gel dengan gradien pH dan muatan listrik.

Masing-masing protein tersusun dari asam amino yang rantai sampingnya dapat memberikan

muatan bergantung pada gugus yang terprotonasi. Rantai samping asam amino mengubah keadaan

protonasi (muatan) berdasarkan pKa gugus samping dan pH lingkungan. Gugus rantai samping akan

diprotonasi pada keadaan pH yang lebih rendah dari nilai pKa. Muatan total protein bergantung pada

jumlah total muatan rantai samping asam-asam amino penyusunnya.

Pada IEF, protein akan berhenti bergerak pada saat mencapai keadaan muatan total nol, yaitu pada

nilai titik isoeletkriknya. Protein dengan nilai titik isoelektrik yang berbeda akan berhenti pada titik

yang berbeda pada gel IEF. Pemisahan dengan IEF adalah dimensi pertama dari elektroforesis 2-

dimensi. Protein yang memiliki ukuran berbeda, bisa saja memiliki nilai titik isoelektrik yang sama,

sehingga 1 titik / pita pada IEF dapat terdiri dari 10 – 15 protein yang berbeda.

Untuk memperoleh gambaran yang jelas, maka dilanjutkan dengan elektroforesis dimensi ke-2,

dimana protein dipisahkan berdasarkan ukurannya. Dimenis ke-2 adalah elektroforesis sodium

9
RFK_Institut Teknologi Del
Lecture Note 31S3101 FISIOLOGI Semester Gasal T.A. 2021/2021

dodecyl sulphate polyacrylamid gel (SDS-PAGE). Sodium dodecyl sulphate (SDS) adalah molekul
bermuatan negatif yang membungkus keseluruhan protein sehingga seluruh protein dalam

campuran akan bermuatan negatif sehingga dapat dipisahkan berdasarkan ukurannya pada medan

listrik. Gel IEF diletakkan di atas gel SDS-PAGE, kemudian direndam dalam bufer dan dialiri muatan

listrik. Protein berukuran lebih kecil akan bergerak lebih cepat. Protein-protein yang telah dipisahkan

berdasarkan muatan dan ukurannya dapat divisualisasi dengan pewarnaan coomassie blue.

Gambar 6. 2D-PAGE. Dua protein dengan nilai pI yang berbeda

10
RFK_Institut Teknologi Del
Lecture Note 31S3101 FISIOLOGI Semester Gasal T.A. 2021/2021

Gambar 7. 2D-PAGE dari proteom Salmonella typhimurium

PUSTAKA
1. Jeremy W. Dale and Malcolm von Schantz (2002) From Genesto Genomes: Concepts and
Applications of DNA Technology. John Wiley & Sons, Ltd.
2. Moat. G. Albert, Foster. W. John, Spector P. Michael (2002).Microbial Physiology, 4th ed.,
Woley & Sons Inc.
3. Sanger F; Coulson AR. (1975). A rapid method for determining sequences in DNA by primed
synthesis with DNA polymerase. J. Mol. Biol. 94 (3): 441–8.

11
RFK_Institut Teknologi Del