Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Lihat diskusi, statistik, dan profil penulis untuk publikasi ini di: https://www.researchgate.net/publication/49781983

Diskriminasi Antara DNA Manusia dan Hewan Penerapan Reaksi Rantai

Polimerase Dupleks untuk Identifikasi Forensik

Artikel di dalam Jurnal kedokteran forensik dan patologi Amerika: publikasi resmi dari National Association of Medical Examiners · Juni 2011
DOI: 10.1097/PAF.0b013e31820c2bba · Sumber: PubMed

KUTIPAN BACA
6 484

5 penulis, termasuk:

Pamela Tozzo Enrico Novelli

Universitas Padova Universitas Padova
80 PUBLIKASI 344 KUTIPAN 127 PUBLIKASI 1,968 KUTIPAN

LIHAT PROFIL LIHAT PROFIL

Maurizio Onisto Luciana Caenazzo

Universitas Padova Universitas Padova
102 PUBLIKASI 3,565 KUTIPAN 145 PUBLIKASI 1,208 KUTIPAN

LIHAT PROFIL LIHAT PROFIL

Beberapa penulis publikasi ini juga mengerjakan proyek terkait ini:

Keterlibatan heparanase pada Cedera ginjal akut Lihat proyek

kanker Lihat proyek

Semua konten yang mengikuti halaman ini diunggah oleh Maurizio Onisto pada 14 Februari 2019.

Pengguna telah meminta peningkatan file yang diunduh.

 CASE REPORT
Diskriminasi Antara DNA Manusia dan Hewan
Penerapan Reaksi Rantai Polimerase Dupleks untuk Identifikasi Forensik
Pamela Tozzo, MD,* Elena Ponzano, PhD,* Enrico Novelli, MVD,th Maurizio Onisto, PhD,NS
dan Luciana Caenazzo, PhD*
Abstrak: Identifikasi spesies laporan adalah salah satu analisis dasar di
laboratorium forensik. Penulis melaporkan kasus 6 fragmen tulang
ditemukan di daerah berhutan, yang tidak disebabkan oleh 1 spesies
hewan berdasarkan pemeriksaan morfologi. Tujuan dari penelitian ini
adalah untuk mengembangkan reaksi berantai polimerase dupleks (PCR)
untuk membedakan fragmen tulang asal manusia dan hewan. Metode ini
didasarkan pada amplifikasi PCR sitokromB dan fragmen DNA mitokondria
16S ribosom, yang belum pernah diuji sampai sekarang. Protokol kami
menggabungkan PCR putaran tunggal dengan visualisasi langsung
amplikon dalam gel agarosa, tanpa analisis sekuensing produk PCR.
Kehadiran pita tunggal (359 bp) menunjukkan asal sampel bukan manusia,
sedangkan 2 pita (157 dan 359 bp) menunjukkan sampel biologis manusia.
Metode ini ternyata berguna untuk tujuan forensik karena DNA
mitokondria ribosom 16S adalah fragmen kecil khusus manusia yang
mudah diamplifikasi bahkan dengan DNA terdegradasi dari bahan biologis
seperti tulang tua.
Kata Kunci: sitokrom B, 16S rRNA, ekstraksi DNA, fragmen tulang,
identifikasi spesies
(Am J Forensik Med Pathol 2011;32: 180kamu182)
S penentuan spesies spesimen kerangka merupakan komponen
penting dari analisis forensik dan antropologis. Masalahnya
sering dirujuk pada diferensiasi bahan tulang manusia dari yang
bukan manusia. Dalam kebanyakan kasus seperti itu, diagnosis
berdasarkan fitur anatomi adalah mungkin. Namun, ketika sisa-sisa
terfragmentasi atau kurang terpelihara, identifikasi spesies dapat
menjadi sulit atau tidak dapat dicapai.
Selama beberapa tahun terakhir, analisis penanda
mitokondria telah menunjukkan kelayakan yang baik untuk
penentuan spesies dan identifikasi individu manusia.1,2 Genom
mitokondria terdiri dari molekul DNA untai ganda kecil
melingkar yang hadir hingga beberapa ribu salinan per sel. Pada
hewan, genom mitokondria memiliki panjang sekitar 16.500 bp
dan memiliki 13 gen yang mengkode protein, 2 gen yang
mengkode RNA ribosom (rRNA), 22 gen yang mengkode RNA
transfer, dan 1 wilayah nonkode utama bernama d-loop, yang
berisi asal. dari replikasi.3
Naskah diterima 21 Agustus 2008; diterima 12 Desember 2008. Dari
*Departemen Kedokteran Lingkungan dan Kesehatan Masyarakat,
Bagian Hukum Kedokteran, Universitas Padua; kanDepartemen Ilmu
Biomedis Eksperimental, Universitas Padua, Padova; dankan
Departemen Kesehatan Masyarakat, Patologi Komparatif dan
Kebersihan Hewan, Universitas Padua, Legnaro, Italia.
Cetak Ulang: Luciana Caenazzo, PhD, Departemen Kedokteran Lingkungan
dan Kesehatan Masyarakat, Bagian Kedokteran Hukum, Universitas Padova,
Via Falloppio 50, 35121 Padova, Italia. Email: luciana.caenazzo@unipd.it. Hak
Cipta * 2011 oleh Lippincott Williams & Wilkins
ISSN: 0195-7910/11/3202kamu0180 DOI:
10.1097/PAF.0b013e31820c2bba
180 www.amjforensicmedicine.com
Hak Cipta © 2011 oleh American Psychosomatic Society. Dilarang memperbanyak artikel ini tanpa izin.
Analisis sitokrom B (cyt B) adalah metode mapan untuk
identifikasi spesies hewan.4kamu6 Metode lain telah diusulkan untuk
tujuan forensik untuk membedakan manusia dari spesimen bukan
manusia, yang melibatkan amplifikasi berbagai daerah DNA
mitokondria (mtDNA) dalam 1 putaran reaksi berantai polimerase
(PCR).7,8 Di antara gen mtDNA yang digunakan untuk deteksi spesies,
cyt B (sendiri atau terkait dengan penanda lain) telah berhasil
digunakan dalam metode berbasis PCR, bahkan jika analisis urutan
dan perbandingan dalam BLAST telah membuat analisis ini
merepotkan.4kamu8 Penanda mtDNA lain yang biasa digunakan untuk
studi filogenetik adalah gen 16S rRNA.9
Dalam kasus baru-baru ini, laboratorium kami perlu mencoba
identifikasi spesies dari 5 fragmen tulang kecil (Gbr. 1). Fragmen kecil
ini ditemukan sedikit terkubur oleh seorang pemburu di zona hutan
berbukit di Italia Utara. Perhatian utama adalah apakah mereka
berasal dari manusia. Ukuran kecil dari potongan menghalangi
pengakuan positif dari manusia versus asal bukan manusia
berdasarkan morfologi dan ketebalan kortikalnya. Untuk tujuan
menetapkan asal spesies dari fragmen ini, kami telah
mengembangkan metode berdasarkan produk PCR dupleks yang
diperkuat dari mtDNA yang terdeteksi dalam elektroforesis gel
agarosa. Amplikon ini sesuai dengan cytB (359 bp) dan ke fragmen
16S rRNA (157 bp) yang spesifik untuk manusia dan sejauh ini belum
pernah digunakan untuk tujuan ini. Karena 16S rRNA adalah fragmen
mtDNA kecil yang mudah diamplifikasi, metode ini bisa sangat
berguna untuk tujuan forensik dalam hal identifikasi spesies
manusia.
BAHAN DAN METODE
Langkah pertama untuk menentukan spesifisitas primer 16S rRNA
untuk spesies manusia adalah memeriksa struktur sekunder primer-dimer
dan jepit rambut minimum. Kemudian kami memverifikasi dengan analisis
BLAST urutan primer dan selanjutnya mengujinya dengan amplifikasi PCR.
DNA diekstraksi dari tulang masing-masing dari 5
fragmen dan dari tulang milik manusia dan spesies lain
(sapi, domba, kuda, babi, ayam, kelinci, dan kucing).
5 fragmen spesies yang tidak diketahui diperlakukan selama 30
menit dengan pemutih.
Setiap fragmen ditimbang antara 1 dan 2 g dan dihaluskan
menjadi bubuk halus setelah direndam dalam nitrogen cair.
Kemudian, dekalsifikasi dan DNA diekstraksi sesuai dengan
metode Crainic et al.10
Kami merancang primer untuk 16S rRNA, dengan
mempertimbangkan pentingnya suhu kerja leleh dan anil dari
cyt yang sudah ada B primer.11 Urutan primer yang digunakan
dalam PCR tunggal dilaporkan pada Tabel 1.
Setelah langkah denaturasi awal 1 menit pada 94-C, sampel
diamplifikasi dalam thermocycler (9700; Applied Biosystems, Foster
City, California), selama 40 siklus 5 detik pada 94-C, 30 detik pada 50-
C, dan 40 detik pada 72-C, diikuti dengan langkah perpanjangan
akhir 3 menit pada 72-C. Campuran PCR adalah sebagai berikut: 0,4K
M masing-masing kota B primer, 0,6 KM masing-masing dari 16S
Am J Kedokteran Forensik Pathol & Jilid 32, Nomor 2, Juni 2011
Am J Kedokteran Forensik Pathol & Jilid 32, Nomor 2, Juni 2011
GAMBAR 1. Pemulihan lima fragmen tulang di zona berhutan.
rRNA primer, 1,25 U Taq DNA polimerase (Biosistem Terapan),
0,2 KM setiap dNTP, 2,5 KL buffer 10- Taq, dan 5 hingga 10 ng
DNA dalam volume akhir 25 KL. Air sebagai pengganti DNA
digunakan sebagai kontrol PCR negatif.
Untuk memverifikasi efisiensi amplifikasi PCR, 10 ng
DNA manusia yang diperoleh dari seluruh darah digunakan
sebagai kontrol positif. DNA kontrol disimpan dalam buffer
asam Tris-Ethylenediaminetetraacetic diJ20-C pada
konsentrasi akhir 100 ng/KL hingga satu tahun.
Elektroforesis 10 KL PCR dilakukan dalam 2,0 % gel agarosa dalam
buffer asam 1- Tris-borat-Etilendiamintetraasetat dengan 1 mg/mL
etidium bromida untuk secara langsung memvisualisasikan amplikon di
bawah sinar ultraviolet.
Selanjutnya, kami melakukan pengurutan DNA otomatis
dari amplikon hewan yang berbeda menggunakan BigDye
Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Biosistem Terapan).
Produk sekuensing dianalisis pada ABI PRISM 310 Genetic
Analyzer (Biosistem Terapan).
HASIL
Kami menganalisis 5 fragmen tulang (Gbr. 1) dengan tujuan untuk
menentukan apakah mereka berasal dari manusia.
DNA diekstraksi dari fragmen tulang asal manusia
sebagai kontrol, dari sampel milik hewan yang berbeda, dan
kemudian dari 5 fragmen yang tidak diketahui asalnya. DNA
yang diperoleh diamplifikasi dalam PCR dupleks cytB (359
bp) dan fragmen mtDNA 16S rRNA (157 bp). Amplifikasi
multipleks menunjukkan pita 359 bp untuk cytB dan pita
kedua 157 bp untuk fragmen 16S rRNA untuk sampel
biologis manusia. Dalam kondisi yang sama, hanya cytB
fragmen dibuktikan untuk sampel hewan, sedangkan
fragmen 16S rRNA sama sekali tidak ada (Gbr. 2).
5 fragmen spesies yang tidak diketahui menunjukkan semua 2 pita
yang menunjukkan asal usul manusia. Konsentrasi primer dan jumlah
TABEL 1. Urutan Oligonukleotida untuk PCR
gen Urutan Primer
cyt.B maju 5-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3kan5-
cyt.B membalikkan GCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3kan9
16S rRNA maju 5-CAATTGGACCAATCTATCACC-3kan5-
16S rRNA terbalik GTGAGGGTAATAATGACTTGT-3kan
* 2011 Lippincott Williams & Wilkins
Hak Cipta © 2011 oleh American Psychosomatic Society. Dilarang memperbanyak artikel ini tanpa izin.
Diskriminasi Antara DNA Manusia dan Hewan
Siklus PCR dioptimalkan untuk menghindari amplifikasi preferensial; oleh
karena itu, di bawah kondisi yang dilaporkan, kami tidak melihat
perbedaan mencolok dalam intensitas 2 pita dengan 5 sampel tulang yang
tidak diketahui asalnya yang telah kami uji (Gbr. 3).
DISKUSI
Dalam situasi di mana fragmen kecil tulang ditemukan, mungkin
tidak mungkin dengan fitur morfologis saja untuk mengkonfirmasi atau
mengecualikan asal manusia, dan metode histologis atau molekuler harus
digunakan. Di sini, kami melaporkan kasus 5 fragmen tulang yang diambil,
yang asal-usulnya tidak terdeteksi.
Dengan tujuan untuk membedakan fragmen tulang manusia
dari bukan manusia, kami mengusulkan sebuah metode yang
melibatkan amplifikasi cyt B wilayah dan fragmen spesifik manusia
16S rRNA yang tidak pernah digunakan, tanpa analisis sekuensing
produk PCR. Tujuan mendeteksi asal sampel manusia dapat dengan
mudah dicapai dengan visualisasi langsung pada gel agarosa dari 2
pita untuk sampel biologis manusia atau hanya 1 pita untuk semua
spesies hewan lainnya. Kehadiran cytB pita adalah demonstrasi asal
hewan dari spesimen, sedangkan pita kedua hanya khusus untuk
manusia. Tidak ada pita samar atau tidak spesifik yang muncul pada
sampel hewan yang diuji: sapi, domba, kuda, babi, ayam, kelinci, dan
kucing. Aspek ini sangat penting karena penelitian lain melaporkan
adanya pita nonspesifik yang samar
GAMBAR 2. amplifikasi mtDNA dari cyt B (359 bp) dan 16S rRNA (157
bp) fragmen dari hewan yang berbeda. Jalur 1 menunjukkan ternak;
jalur 2, domba; jalur 3, kuda; jalur 4, babi; jalur 5, ayam; jalur 6,
kelinci; jalur 7, kucing; jalur 8, manusia; M, penanda berat molekul
100-bp.
www.amjforensicmedicine.com 181
 Tozzo dkk
GAMBAR 3. amplifikasi mtDNA dari cyt B (359 bp) dan 16S rRNA (157
bp) dari 5 fragmen tulang yang tidak diketahui asalnya dianalisis dari
jalur 1 hingga 5. Jalur 6 menunjukkan kontrol positif manusia; jalur 7,
kontrol negatif; jalur 8, penanda berat molekul 100-bp.
dalam sampel hewan menggunakan fragmen mtDNA lain untuk
identifikasi manusia.7
Selain itu, untuk memverifikasi PCR yang terjadi, kami
menyarankan penggunaan rutin DNA kontrol manusia yang
positif untuk membedakan hasil negatif untuk pita 16S rRNA.
Dalam hal ini, kurangnya amplikon 16S rRNA pasti karena
adanya bahan biologis dari hewan daripada kesalahan dalam
kondisi eksperimental. Namun, perhatian khusus harus
diberikan untuk menghindari kontaminasi oleh sisa sampel lain.
Dalam percobaan kami, kami tidak menemukan perbedaan dalam
intensitas 2 pita, yang memungkinkan kami mengidentifikasi sampel yang
berasal dari manusia.
Dalam laporan kasus, semua 5 fragmen tulang dihasilkan sebagai asal
manusia: semua 5 sampel DNA yang diperoleh dan diamplifikasi menunjukkan
pola yang sama dari sampel tulang manusia yang digunakan sebagai kontrol
positif.
Pengujian ini menunjukkan berguna untuk mengidentifikasi
spesies bukan manusia melalui analisis komparatif sederhana dalam
BLAST dari cyt B urutan DNA.
Berdasarkan hasil yang diperoleh dalam kasus yang dilaporkan,
kami menganggap metode yang diusulkan sebagai langsung dan dapat
diandalkan, yang memungkinkan diskriminasi DNA manusia dan hewan.
182 www.amjforensicmedicine.com
Hak Cipta © 2011 oleh American Psychosomatic Society. Dilarang memperbanyak artikel ini tanpa izin.
Lihat statistik publikasi
Am J Kedokteran Forensik Pathol & Jilid 32, Nomor 2, Juni 2011
dengan PCR putaran tunggal. Karena pemulihan informasi dari sampel
yang terdegradasi sering ditingkatkan dengan penggunaan produk PCR
yang lebih kecil, kami percaya bahwa analisis fragmen rRNA 16S kecil yang
baru dapat mewakili peningkatan metode PCR multipleks yang diusulkan
dalam literatur sejauh ini.
REFERENSI
1. Kocher TD, Thomas WK, Meyer A, dkk. Dinamika evolusi DNA mitokondria
pada hewan: amplifikasi dan sekuensing dengan primer yang dilestarikan.
Proc Natl Acad Sci US A. 1989;86:6196kamu6200.
2. Wolf C, Rentsch J, Hübner P. PCR-RFLP analisis DNA mitokondria: metode yang dapat
diandalkan untuk identifikasi spesies. J Pertanian Makanan Kimia.1999;47:1350
kamu1355.
3. Bore JL. Genom mitokondria hewan.Asam Nukleat Res.
1999;27:1767kamu1780.
4. Barallon R. Penentuan spesies dengan analisis sitokrom B gen. Dalam:
Lincoln PJ, Thomson J, eds.Protokol Profil DNA Forensik.Totowa, NJ:
Humana Press; 1998:251kamu260.
5. Branicki W, Kupiec T, Pawlowski R. Validasi sitokrom Banalisis urutan
sebagai metode identifikasi spesies. J Ilmu Forensik.2003;48:83kamu
87.
6. Parson W, Pegoraro K, Niederstatter H, dkk. Identifikasi spesies
melalui sitokromB gen. Int J Legal Med. 2000;114:23kamu28.
7. Bataille M, Crainic K, Leterreux M, dkk. Amplifikasi multipleks DNA
mitokondria untuk identifikasi manusia dan spesies dalam evaluasi
forensik.Ilmu Forensik Int. 1999;99:165kamu170.
8. Bellis C, Ashton KJ, Freney L, dkk. Pendekatan genetik molekuler untuk
identifikasi spesies hewan forensik.Ilmu Forensik Int. 2003; 134:99kamu
108.
9. Noda R, Kim CG, Takenaka O, dkk. Mitokondria 16S rRNA urutan
keragaman hominoid.J. Hered. 2001;92:490kamu6.
10. Crainic K, Paraire F, Leterreux M, dkk. Sisa kerangka yang diduga terendam
air selama tiga tahun diidentifikasi menggunakan analisis PCR-STR.
J Ilmu Forensik. 2002;47:1025kamu1027.
11. Meyer R, Höfelein C, Lüthy J, dkk. Reaksi berantai polimerasekamu
analisis polimorfisme panjang fragmen restriksi; metode sederhana
untuk identifikasi spesies dalam makanan.J AOAC Int.1995;78:1542
kamu1551.
* 2011 Lippincott Williams & Wilkins