FITOKIMIA

Kromatografi
Lapis Tipis
apt Ari Susiana Wulandari, M.Sc.
Definisi Kromatografi Secara Umum
 Kromatografi adalah teknik pemisahan molekuler yang didasarkan
pada berbagai model pergerakan antara fase gerak dan fase diam
untuk memisahkan komponen (dalam bentuk molekul) dalam larutan.
 Molekul-molekul yang larut dalam fase gerak melewati fase diam.
Molekul yang memiliki ikatan kuat dengan kolom akan cenderung
bergerak lebih lambat daripada molekul dengan ikatan lemah.
 Menggunakan berbagai jenis molekul dapat dipisahkan tergantung
pada pergerakan kolom. Setelah komponen terelusi dari kolom, dapat
dianalisis menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk
analisis nanti.

2
Prinsip KROMATOGRAFI
 Semua metode kromatografi menggunakan satu fasa statis (stationary phase)
dan satufasa mobile (mobile phase).
 Kromatografi akan melibatkan beberapa fenomena, yaitu:
➢ adsorpsi,
➢ partitisi,
➢ pertukaran ion,
➢ eksklusi molekul
➢ Keberhasilan memunculkan profil senyawa target dipengaruhi oleh ketepatan
sistem kromatografi yang digunakan yakni fase diam, fase gerak, jenis pelarut
yang digunakan untuk melarutkan ekstrak kembali, jumlah perbandingan
sampel dan metode visualisasi yang dipilih
Polaritas
 Polaritas menunjukkan adanya pemisahan kutub muatan positif dan negatif dari
suatu molekul sebagai akibat terbentuk konfigurasi tertentu dari atom-atom
penyusunnya
 Molekul tersebut dapat tertarik oleh molekul lain yang mempunyai polaritas
 Tingkat pemisahan dari molekul-molekul tersebut menentukan polaritas dan daya
tariknya
 Polaritas digunakan sebagai petunjuk sifat:
1. Pelarut/solven
2. Adsorben
3. Zat yang dipisahkan/solute

PRINSIP “LIKE DISSOLVES LIKE “

1. Pelarut polar cenderung melarutkan solut polar
2. Adsorben polar cenderung mengadsorbsi solut polar
 Polaritas pelarut
 Polaritas pelarut sebanding dengan

konstanta dielektrik zat pelarut

 Konstanta ini melambangkan

rapatnya fluks elektrostatik dalam

suatu bahan bila diberi POTENSIAL

LISTRIK.

 Konstanta dielektrik merupakan

perbandingan energi listrik yang

tersimpan pada bahan tersebut

jika diberi sebuah potensial,

relative terhadap vakum (ruang

hampa).
Partisi dan Adsorbsi
 Proses partisi tergantung dari daya larut solut dalam dua macam cairan
 Peka terhadap perbedaan BM solut
 Zat yang terdiri dari satu seri deret homolog paling baik dipisahkan dengan
kromatografi partisi ex: pemisahan berbagai jenis asam amino, asam lemak,
gula
 Pemisahan dengan proses partisi dan adsorbsi dipengaruhi oleh perbedaan
polaritas solut yang dipisahkan
 Polaritas merupakan faktor yang menentukan daya larut (kemampuan partisi)
dan adsorbsi solute
 Banyaknya solut yang dapat diadsorbsi pada permukaan adosrben tergantung
dari konfigurasi solute
 Adsorbsi peka terhadap bentuk stereometri dari solut yang dipisahkan, cocok
untuk memisahkan campuran solut yang serupa tetapi mempunyai perbedaan
bentuk sterometrik
JENIS KROMATOGRAFI
Berdasarkan Teknik Kerja yang digunakan, antara lain :
1. Kromatografi Kertas
2. Kromatografi Kolom
3. Kromatografi Lapis Tipis
4. Kromatografi Gas
5. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Alasan Pemilihan KROMATOGRAFI

Pemilihan kromatografi didasarkan pada :

 Kemudahan pelaksanaan
 Tujuan pemisahan: preparatif atau analitik
 Bentuk senyawa yang dipisahkan: volatilitas, bentuk stereometri,
derivatisasi, dll
Kromatografi Kertas

kromatografi yang menggunakan kertas

selulosa murni yang mempunyai afinitas
besar terhadap air atau pelarut polar
lainnya.
KLT (Kromatografi lapis tipis)

Prinsip Kerja KLT Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan
kesetimbangan antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase
diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi
dengan fasa geraknya.
Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase
gerak, serta kepolaran dan ukuran molekul.

10
Perhitungan RF

Pada KLT dan Kromatografi kertas perkiraan

identifikasi diperoleh dengan pengamatan 2
bercak dengan harga Rf dan ukuran yang lebih
kurang sama. Ukuran dan intensitas bercak dapat
digunakan untuk menggambarkan atau
memperkirakan kadar

Jarak yang ditempuh substansi

Rf =
Jarak yang ditempuh oleh pelarut (fase gerak)

12
KLT vs Kromatografi Kertas ???

 Kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk memisahkan senyawa –

senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang
sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas.
 Kromatografi kertas digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya
menjadi komponen-komponennya. Pelarut bergerak lambat pada kertas,
komponen-komponen bergerak pada laju yang berbeda dan campuran
dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna.
 Pada cara penggunaan KLT hampir sama dengan penggunaan Kromatografi
kertas, hanya saja pada KLT fase diamnya menggunakan plat gelas/ logam/
Aluminium foil/ silica jel sedangkan pada kromatografi kertas menggunakan
kertas saring.
Pemilihan Fase Diam KLT
 Selain memilih fase diam, memilih eluen pengembang kromatografi lapis tipis
(KLT) juga merupakan faktor yang berpengaruh besar, karena hanya beberapa
kasus solvent pengembang yang hanya terdiri dari satu komponen saja. Pada
umumnya campuran larutan pengembang KLT (solvent system) bisa sampai
enam komponen dengan perbandingan tertentu.
 Fasa Diam (adsorben/lapisan penyerap) Fase diam yang digunakan dalam KLT
merupakan penyerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30
µm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit
kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi
dan resolusinya.
Fase Diam KLT
Fase diam yang biasa digunakan :
 Silika gel (Silika gel G, Silika gel GF254, Silika gel H/silika gel N, Silika gel S,
Silika gel PF 254 & 366, Silika gel F254)
 Alumina
 Magnesium Trisilikat
 Kalsium Sulfat(K2SO4)
 Kieselghur
 Selulosa
Fase diam yang umum digunakan untuk KLT adalah silica gel GF254. Bahan ini
bisa memisahkan mayoritas golongan kimia yang artinya jika tidak
dinyatakan lain maka lempeng jenis ini yang kita gunakan. Jika fase normal
gagal memberikan pemisahan, maka fase diam diganti dengan fase terbalik
nonpolar yang terbuat dari C18 yang terikat silika. Fase gerak yang
digunakan disesuaikan dengan fase diamnya. Jika pemisahan kurang tajam,
bisa ditambahkan asam lemah seperti asam formiat beberapa mikro liter
yaitu 1-3 tetes.
Sifat-sifat dasar TLC
Fase gerak KLT

Campuran larutan/eluen pengembang KLT ini berfungsi untuk :

1. melarutkan campuran bahan
2. mengangkut bahan untuk dipisahkan pada lapisan fase diam
(sorben)
3. memberikan nilai hRf senyawa yang terpisah
4. memberikan selektivitas yang memadai untuk campuran
bahan untuk dipisahkan.
Syarat Fase Gerak KLT
Bagaimana memilih solvent system/fase gerak/eluen yang
cocok agar komponen senyawa terpisah baik???
Adapun syarat eluen KLT (mobile phase) antara lain :
• kemurnian yang memadai
• stabilitas yang memadai
• viskositas rendah
• partisi/pemisahan linier
• tekanan uap sedang
• daya toksik yang serendah mungkin
Kesesuaian pelarut terhadap senyawa
target
 Jenis pelarut yang digunakan memegang peranan penting
di dalam mengambil senyawa target. Meskipun ketentuan
umum ekstrak adalah ekstrak etanol maka kita tidak bisa
memaksa senyawa target di dalamnya akan terlarut dalam
etanol dengan jumlah yang cukup. Bisa jadi senyawa
target tidak nampak karena kadarnya terlalu rendah.
Sehingga pemilihan pelarut harus dengan cermat dipilih
sehingga kadar yang terambil cukup untuk divisualisasikan
atau dideteksi dengan sinar visible atau UV.
Jumlah perbandingan sampel
 Sering kali senyawa marker memiliki kadar yang sangat
rendah di dalam sampel atau larutan uji. Selain faktor
ketidaksesuaian jenis pelarut di atas, senyawa target
tidak muncul pada lempeng mungkin juga disebabkan
karena kadarnya terlalu rendah sehingga dengan stok
ekstrak tertimbang dengan bobot kecil ketika ditotolkan
tidak tampak. Maka solusinya adalah jumlah kita
menotolkan lebih banyak.
Pemilihan metode visualisasi yang tepat

 Penggunaan cahaya UV adalah detector umum yang selanjutnya bisa

diarahkan pada reagen khusus. Secara umum senyawa berantai ganda
cukup akan tampak pada penyinaran di bawah UV. Sebagaimana
prinsip teknik fitokimiawi dalam penggunaan sinar UV, sinar UV pada
panjang gelombang 254 nm akan memadamkan fluoresensi senyawa
dengan gugus kromofor. Bercak bercak pemadaman akan berwarna
gelap dengan latar belakang lempeng berwarna hijau muda akibat
fluoresensi dari MgSO4 yang ditambahkan pada silika. Namun ada
beberapa pengecualian yakni di bawah sinar ini beberapa senyawa
justru mengalami fluoresensi sebagaimana terjadi pada kumarin atau
eurikumanol. Sinar dengan panjang gelombang 366 nm secara umum
akan membuat senyawa kimia berfluoresensi dengan berbagai warna.
 ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA FLAVONOID
DALAM DAUN BELUNTAS (Pluchea indica L.)

 Telah dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa flavonoid dalam daun

beluntas (Pluchea indica L.). Isolasi dilakukan dengan cara ekstraksi maserasi
menggunakan pelarut etanol 96% p.a selama 7 hari dan partisi menggunakan
pelarut n-heksana yang menghasilkan ekstrak kental daun beluntas. Ekstrak
yang diperoleh dipisahkan dengan Kromatografi Lapis Tipis menggunakan
eluen n-butanol : asam asetat : air (BAA) (4:1:5). Isolat 3, hasil dari
pemisahan Kromatografi Lapis Tipis positif mengandung senyawa golongan
flavonoid. Dari spektrum Ultra Violet - Visibel, dapat diduga bahwa senyawa
flavonoid tersebut merupakan golongan flavonol, yang dapat dilihat dari
rentang panjang gelombangnya yaitu antara 250-280 nm (pita II) dan 350-385
nm (pita I).

Koirewoa, Y. A., Fatimawali, F., & Wiyono, W. (2012). Isolasi dan identifikasi
senyawa flavonoid dalam daun beluntas (Pluchea indica L.). Pharmacon, 1(1).
Dari hasil spektrum yang
tampak, terdapat dua pita pada
isolat ketiga. Pita pertama
mempunyai panjang gelombang
372 nm pada absorbansi 0,252
dan pita kedua mempunyai
panjang gelombang 276 nm
pada absorbansi 0,532 ini
menandakan bahwa isolat yang
dibaca positif mengandung
flavonol.
SKRINING FITOKIMIA DAN ANALISIS KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
SENYAWA ALKALOID DARI BERBAGAI EKSTRAK
KOPI ROBUSTA (Coffea canephora)

Pratita, A. T. K. (2018). Skrining Fitokimia Dan Analisis Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Alkaloid dari Berbagai Ekstrak Kopi Robusta
(Coffea canephora). Jurnal Kesehatan Bakti Tunas Husada: Jurnal Ilmu-ilmu Keperawatan, Analis Kesehatan dan Farmasi, 17(2),
198-201.
SKRINING FITOKIMIA DAN ANALISIS KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
EKSTRAK TANAMAN PATIKAN KEBO (Euphorbia hirta L.)

Yuda, P. E. S. K., Cahyaningsih, E., & Winariyanthi, N. P. Y. (2017). Skrining fitokimia dan analisis kromatografi lapis tipis ekstrak
tanaman patikan kebo (Euphorbia hirta L.). Jurnal Ilmiah Medicamento, 3(2), 61-70.