TEKNIK DASAR LABORATORIUM BIOMEDIK

LAPORAN PRAKTIKUM ISOLASI DNA, PCR, DAN

ELEKTROFORESIS

Ulfi Rahma Efrianti 1906448961

Aqidatul Islamiyyati Elqowiyya 2006541750
Deajeng Laras H 2006541782
Syarifah Raisha Muhayya 2006542072

TDL KELAS E

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA
JAKARTA
2021
ii

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI.............................................................................................................. i
BAB I PENDAHULUAN.......................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang................................................................................................. 1
1.2 Tujuan Praktikum............................................................................................ 2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA................................................................................ 3
2.1 Isolasi DNA..................................................................................................... 3
2.2 Amplifikasi DNA dengan teknik PCR............................................................ 4
2.3 DNA Fingerprinting (RFLP)........................................................................... 5
2.4 Elektroforesis................................................................................................... 6
BAB III METODOLOGI........................................................................................... 7
3.1 Isolasi DNA..................................................................................................... 7
3.2 Amplifikasi DNA dengan teknik PCR............................................................ 9
3.3 DNA Fingerprinting (RFLP)........................................................................... 10
3.4 Elektroforesis................................................................................................... 11
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN................................................................... 12
12
15
17
19
21
BAB V PENUTUP..................................................................................................... 22
5.1 Kesimpulan...................................................................................................... 22
DAFTAR PUSTAKA................................................................................................ 23
LAMPIRAN............................................................................................................... 25
1

BAB I
PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah asam nukleat yang mengandung
informasi genetik yang mengatur perkembangan biologis secara seluler. DNA terdiri
dari molekul yang disebut nukleotida. Setiap nukleotida mengandung gugus fosfat,
gula, dan basa nitrogen. Empat jenis basa nitrogen adalah adenin (A), timin (T),
guanin (G) dan sitosin (C).1,2
Isolasi DNA dan polymerase chain reaction (PCR) adalah teknik dasar yang
digunakan di laboratorium molekuler. Prinsip dasar isolasi DNA adalah merusak
membran sel, dan membran inti untuk melepaskan DNA yang utuh diikuti dengan
presipitasi DNA dan menghilangkan biomolekul yang mengkontaminasi seperti
protein, polisakarida, lipid, fenol, dan metabolit sekunder lainnya baik dengan metode
enzimatik maupun kimia sehingga diperoleh DNA yang berkualitas baik dalam
jumlah yang cukup. Kualitas dan kuantitas DNA diukur menggunakan
spektrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemudian
DNA dapat diamplifikasi dengan bantuan PCR (Polymerase Chain Reaction). 1,2
Penggunaan PCR dapat secara cepat meningkatkan jumlah salinan dari suatu
segmen DNA untuk analisis lebih lanjut. Saat ini, analisis DNA dengan DNA
fingerprinting banyak digunakan di bidang forensik. Teknik ini dikembangkan pada
tahun 1984 oleh ahli genetika Inggris, Alec Jeffreys, setelah dia memperhatikan
bahwa urutan tertentu dari DNA yang sangat bervariasi (dikenal sebagai minisatelit),
dan menyadari bahwa setiap individu memiliki pola minisatelit yang unik.3
Analisis DNA telah menjadi bagian integral dari penyelidikan forensik dan
banyak laboratorium forensik mengandalkan DNA untuk membantu penyelidikan
kriminal serta identifikasi orang yang sudah meninggal. Sampel DNA yang diambil
dari TKP (tempat kejadian perkara) dibandingkan dengan sampel DNA dari
tersangka. Jika kedua profil DNA itu cocok, maka barang bukti berasal dari tersangka
2

itu. Sebaliknya, jika dua profil DNA tidak cocok, maka bukti tidak mungkin berasal
dari tersangka. DNA fingerprinting juga digunakan untuk menentukan paternitas.3
Oleh karena itu, pada praktikum ini dilakukan pengisolasian DNA yang
diambil darah sampel darah dan mukosa pipi, yang kemudian dihitung kadar dan
kemurniannya. Dilakukan amplifikasi DNA dengan teknik PCR dan divisualisasi
dengan elektroforesis. Selain itu, dilakukan identifikasi pelaku kejahatan dengan
membandingkan profil DNA yang ditemukan pada lokasi kejadian dengan profil
beberapa DNA tersangka

1.2. Tujuan Praktikum

 Mempelajari teknik isolasi DNA yang berasal dari sampel darah dan mukosa
pipi
 Mempelajari serta mengukur konsentrasi dan tingkat kemurnian DNA.
 Mempelajari teknik PCR dengan memperbanyak jumlah salinan DNA
 Mempelajari teknik elektroforesis serta mengetahui hasil visualisasi sampel
DNA produk PCR menggunakan elektroforesis
 Mengidentifikasi ada tidaknya elemen Alu insertion pada sampel DNA hasil
isolasi
 Mempelajari teknik analisis DNA fingerprinting dan membandingkan pola
pita antara DNA tersangka dengan DNA yang ditemukan pada lokasi

kejadian.
3

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Isolasi DNA

Pada seluruh jaringan dan cairan tubuh manusia tentu mengandung DNA.
Oleh karena itu, DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang
memiliki inti, seperti darah, semen, tulang, rambut, liur dan mukosa pipi. Isolasi
DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lainnya, seperti
protein, lemak dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga, yaitu
penghancuran (lisis), ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa
dan protein, serta pemurnian DNA.4
Bahan yang paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah
dan rambut beserta akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif mudah diperoleh.
Darah mamalia mengandung sel–sel berinti (sel darah putih) dan juga sel – sel tidak
berinti (sel darah merah). Pada isolasi DNA menggunakan darah penambahan CLS
atau cell lysis solution bertujuan untuk melisiskan sel darah merah yang tidak
mengandung DNA genom. Penambahan larutan nucleolus cell lysis (NCL) bertujuan
untuk melisiskan inti sel darah putih. Penambahan RNAse yang berguna untuk
menghilangkan adanya kontaminasi RNA terhadap DNA yang akan diisolasi setelah
penambahan NCL dapat dilakukan tergantung kondisi (conditional). Penambahan
larutan pengendap protein berguna untuk memisahkan protein dari supernatan yang
mengandung DNA.4
Isolasi DNA yang berasal dari apusan mukosa pipi juga telah banyak
dilakukan, karena sifat pengumpulan bahan yang non-invasif dan hasil DNA yang
akan diperoleh cukup tinggi. Pada isolasi DNA dengan bahan mukosa pipi perlu
ditambahkan instagene matriks yang berfungsi sebagai pengikat ion magnesium
(Mg+) yang bertindak sebagai kofaktor enzim. Tujuan penambahan instagene matriks
agar enzim inaktif atau tidak dapat bereaksi untuk melisiskan DNA.5
4

2.2. Amplifikasi DNA dengan Teknik PCR

PCR merupakan suatu metode perbanyakan DNA secara enzimatik sehingga
DNA yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis atau penelitian. DNA yang
jumlahnya sangat kecil, misalnya dari beberapa sel folikel rambut juga dapat
dikarakterisasi dengan metode ini. Saat ini PCR sudah digunakan secara meluas pada
kedokteran forensik, diagnosis genetika dan mikrobiologis serta manipulasi dan
rekayasa genetika. Teknik ini banyak digunakan baik untuk penelitian maupun
diagnosis klinik karena cukup spesifik, efisien dan memiliki derajat keberhasilan
yang tinggi.
Istilah “reaksi berantai” digunakan karena perpanjangan rantai DNA
dilakukan dalam siklus yang berulang-ulang (25-30 siklus). Yang diperlukan pada
reaksi PCR adalah suatu DNA sasaran yang akan diamplifikasi, sepasang
oligonukleotida primer yang masing-masing komplementer dengan ujung 3’ dari
salah satu untai DNA sasaran, deoksinukleotida trifosfat (dATP,dCTP,dGTP, dan
dTTP) dan suatu enzim DNA polymerase yang tahan terhadap pemanasan tinggi (Taq
polymerase). Taq polymerase berasal dari bakteri, Thermus aquaticus.
Reaksi PCR memiliki banyak komponen yang diinkubasi di dalam suatu
mesin yang dapat mengatur perubahan suhu secara tepat (thermal cycler). Tahap
pertama yaitu denaturasi DNA yaitu dengan cara meningkatkan temperature hingga
940C selama 1 menit sehingga terjadi pemisahan dari kedua untai DNA dupleks. Lalu
tahap kedua adalah tahap penempelan oligonukleotida primer (annealing/hibridasi).
Pada tahapan ini suhu reaksi diturunkan menjadi 50 0C hingga 620C selama 1 menit
agar oligonukleotida dapat menempel pada DNA. Tahap ketiga adalah pemanjangan
rantai, yaitu dengan cara memanaskan kembali komponen- komponen reaksi pada
suhu 720C selama 1 menit sehingga primer dapat diperpanjang oleh enzim DNA
polymerase hingga mencapai seluruh panjang dari DNA sasaran. Ketiga tahap ini
diulang sebanyak 35 kali hingga 40 kali.
Setiap DNA dupleks pada siklus pertama akan membentuk dua untai anak
sehingga seluruhnya terdapat 4 untai DNA. Selanjutnya selama siklus kedua, keempat
untai ini berfungsi sebagai cetakan dan akan dihasilkan 8 untai DNA. Pada akhir dari
5

siklus kedua akan terbentuk polinukleotida yang panjangnya hanya terbatas dari satu
primer ke primer lainnya. Fragmen DNA ini disebut Amplikon.

2.3. DNA Finger Printing (RFLP)

RFLP atau Restriction Fragment Length Polymorphism merupakan teknik
yang digunakan untuk membedakan antara dua individu dalam spesies yang sama
berdasarkan sampel DNA. Teknik dalam RFLP yaitu fragmentasi DNA genom yang
menggunakan enzim restriksi, enzim ini dapat mengenali dan memotong DNA di
mana terjadi urutan spesifik pendek dalam proses yang disebut restriction digestion.6
Teknik RFLP membutuhkan sejumlah DNA, yang diperoleh dari proses
isolasi. Bila DNA jumlahnya dianggap terlalu sedikit, dapat diamplifikasi terlebih
dahulu menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Enzim restriksi
ditambahkan pada produk PCR untuk memotong sekuens DNA tertentu (restriction
digestion) lalu fragmen yang telah dipotong dapat dipisahkan melalui proses
elektroforesis gel agarosa. Restriction digestion menggunakan enzim endonuklease
bersama dengan methyltransferase untuk memotong sekuens DNA tertentu. Enzim
restriksi yang sering dipakai adalah EcoRI dan PstI. EcoRI sering disebut sebagai 6-
cutters karena berikatan dengan sekuens 6 nukleotida.6
Agarose gel electrophoresis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA
yang sudah dipotong menggunakan enzim restriksi. DNA akan terpisah sesuai dengan
ukuran fragmen, di mana fragmen yang lebih kecil akan berjalan lebih cepat dan jauh.
Gel agarose digunakan untuk protein dengan ukuran sangat besar, asam nukleik,
nukleoprotein, dan sebagainya.
Salah satu manfaat teknik RFLP ini adalah untuk kasus kriminal, yaitu saat
mendeteksi kesamaan DNA tersangka dengan DNA yang ditemukan di TKP. Hal ini
bertujuan untuk menyelesaikan sebuah kasus kriminal di mana terdapat banyak
tersangka yang berpotensi sebagai pelaku kriminal. Selain itu, teknik RFLP juga
dapat digunakan pada kasus saat mendeteksi silsilah keluarga seperti menilai mana
yang memiliki kemiripan DNA dengan kedua orang tuanya.
6

2.4. Elektroforesis
Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan yang memanfaatkan
medan listrik yang dihasilkan dari elektroda-elektroda untuk memisahkan senyawa-
senyawa yang memiliki muatan berupa kation ataupun anion. Memiliki perbedaan
yang cukup jelas dengan sel elektrokimia, elektroforesis memanfaatkan medan listrik.
Sedangkan elektrokimia memanfaatkan elektroda untuk melakukan reaksi reduksi
dan oksidasi.7
Medan listrik yang dihasilkan berasal dari elektroda-elektroda yang diberikan
energy listrik dari sumber energi seperti arus listrik searah maupun Arus listrik bolak-
balik. Hukum Coulomb menjadi prinsip dasar metode pemisahan elektroforesis yaitu
gaya pada salah satu titik muatan berbanding lurus dengan besar muatannya. Medan
listrik merupakan efek yang dihasilkan oleh muatan listrik seperti elektron, ion atau
proton, dalam ruangan yang ada disekitarnya. Alat elektroforesis terdiri dari medium
pemisah yang terhubung dengan dua elektroda dan kertas saring. Media pemisah
dapat berupa gel Agarosa, pati atau poliakrilamida. Media terdiri dari dua bagian
yang dihubungkan dengan sumbu asbes; satu bagian berisi elektroda platina dan yang
lain kontak dengan medium elektroforesis.7
Elektroforesis terdiri dari beberapa komponen utama dalam penggunaanya.
Yang pertama adalah larutan elektrolit yang berfungsi sebagai pembawa komponen.
Umumnya berupa larutan buffer dengan pH tertentu sesuai dengan karakteristik
senyawa yang akan dipisahkan. Berikutnya media pemisah merupakan tempat proses
pemisahan terjadi. Media pemisah ini berupa kertas (selulosa asetat, selulosa nitrat),
gel kanji, gel polikrilamid, busa poliuretan atau agar-agar. Selanjutnya yang paling
penting adalah elektroda yang berfungsi sebagai penghubung arus listrik dengan
media pemisah dan baterai atau arus listrik sebagai sumber energi (source) pada
rangkaian alat.7
7

BAB III
METODOLOGI

3.1 Isolasi DNA

3.1.1 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan untuk isolasi mukosa pipi adalah sentrifuge, water bath,
micro test tube dan holder, wadah penampung Micropipette 1000 µL Vortex dan
Refrigerator. Sedangkan bahan yang digunakan adalah air mineral, NaCl 0,9%
InstaGene 200 µL, sampel mukosa pipi
Alat yang digunakan untuk isolasi darah adalah Spuit 3cc sentrifuge, micro test
tube dan holder, Micropipette 1000 µL vortex, incubator, kuvet. Sedangkan bahan
yang digunakan adalah sampel darah, cell lysis protein, nuclei lysis solution, etanol
70%, isopropanol 100%, protein precipitation solution dan DNA rehydration solution

3.1.2 Cara Kerja

a. Isolasi DNA mukosa pipi
1. Kumur–kumur rongga mulut dengan menggunakan NaCl 0,9% selama 30
detik, lalu tampung ke dalam wadah
2. Pindahkan hasil kumuran ke dalam micro test tube sebanyak 1 ml
3. Lakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit, sehingga
supernatan dan pelet terpisah. Buang supernatan hingga tersisa 50 µL pada
tube.
4. Homogenisasi dengan menggunakan vortex hingga sampel homogen.
5. Ambil suspensi sampel sebanyak 20 µL dengan menggunakan mikropipet,
lalu masukkan ke dalam tabung yang telah berisi Instagene matrix.
6. Homogenisasi kembali menggunakan vortex
8

7. Inkubasi tabung di dalam water bath pada suhu 56oC selama 10 menit. Setelah
5 menit pertama, lakukan homogenisasi kembali dengan vortex. Lakukan hal
yang sama setelah 5 menit yang kedua.
8. Inkubasi tabung di dalam water bath pada suhu 100oC selama 5 menit.
9. Homogenisasi kembali menggunakan vortex
10. Lakukan sentrifugasi dengan kecepatan 6.000 x g selama 5 menit
11. Tabung hasil ekstraksi DNA mukosa pipi dimasukkan ke kulkas pada suhu
40C sebagai bahan uji lanjutan pada praktikum berikutnya.

b. Isolasi DNA dari darah

1. Masukkan sebanyak 300 µL whole blood ke dalam masing-masing microtube
1,5 ml yang telah berisi 900 µL cell lysis solution.
2. Bahan dicampurkan dengan cara membolak-balikkan tabung 5-6 kali, lalu
diinkubasi selama 10 menit.
3. Lakukan sentrifugasi sehingga supernatan dan pelet terpisah. Kemudian
supernatan dibuang, tetapi sisakan sekitar 10-20 µL,
4. Lakukan homogenisasi dengan vortex hingga sampel homogen.
5. Tambahkan sebanyak 300 µL nuclei lysis solution ke dalam tabung, kemudian
dihomogenkan kembali dengan cara dibolak-balik 5-6 kali.
6. Tambahkan sebanyak 100 µL protein precipitation solution ke dalam tabung,
kemudian homogenisasi dengan vortex selama 10-20 detik.
7. Lakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000-16.000 rpm selama 3 menit
pada suhu ruang.
8. Bagian supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam microtube 1,5 ml yang
telah berisi 300 µL isopropanol.
9. Tabung dibolak-balik supaya tercampur (akan terbentuk benang halus
berwarna putih).
10. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000-16.000 rpm selama 1 menit, kemudian
buang supernatan.
9

11. Pelet ditambahkan 300 µL etanol 70%, kemudian campur dengan membolak
balikkan tabung
12. Sentrifugasi kembali, buang supernatan dan tambahkan 10 µL DNA
rehydration solution.
13. Inkubasi overnight pada suhu 4oC.

3.2 Amplifikasi DNA dengan teknik PCR

3.2.1 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan untuk amplifikasi DNA yaitu mikropipet serta
thermalcycler. Bahan yang dibutuhkan antara lain cetakan DNA (DNA hasil isolasi
sebelumnya), primer nukleotida, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), ion Mg 2+
sebagai kofaktor enzim DNAse, buffer, dan enzim Taq Polymerase.

3.2.2 Cara Kerja

1. Beri label tube PCR dan letakkan di tube role dengan tatakan fec.
2. Masukkan 20 𝜇l sample DNA ke masing-masing tube PCR yang sudah berisi
master Mix (20𝜇l).
3. Lakukan Up and down sebanyak 2-3 kali dengan menggunakan mikropipet, lalu
tube PCR di tutup dengan rapat.
4. Masukkan tube PCR ke dalam thermocyler untuk diamplifikasi
5. Hasil PCR diinterprestasikan dengan menggunakan elektroforesis.

3.3 DNA Fingerprinting (RFLP)

3.3.1 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah mikropipet single channel 0,1-10 µL, 10-100
µL dan 100-1000 µL, water bath, mesin sentrifugasi, lemari pendingin, elektroforesis,
chamber untuk gel agarose, wadah penampung gel agarose. Bahan yang digunakan
adalah tabung mikro 1,5 mL, tips, campuran enzim (ENZ), crime scene kit, DNA
loading dye (LD), gel agarose, Lambda/HindIII marker, buffer TAE, Fast Blast DNA
Staining.
10

3.3.2 Cara Kerja

1. Siapkan 6 buah tabung mikro berlabel CS, S1, S2, S3, S4, dan S5
2. Masukkan 10 μL serum berisi DNA dari crime scene kit ke dalam masing-masing
tabung mikro berlabel.
3. Tambahkan 10 μL enzim mix ENZ ke masing-masing tabung mikro yang telah
berisi serum DNA dari crime scene kit
4. Lakukan homogenisasi dengan cara up and down dengan mikropipet sebanyak 3x
untuk masing-masing tabung.
5. Masing-masing tabung dilakukan flick secara perlahan agar seluruh campuran
tergabung menjadi satu.
6. Inkubasi seluruh tabung di dalam water bath dengan suhu 37oC selama 45 menit,
7. Inkubasi overnight seluruh tabung di dalam lemari pendingin 4oC.
8. Sentrifugasi tabung mikro yang berisi sampel dengan kecepatan 2000 x g
9. Masukkan sebanyak 5 μL loading dye ke dalam masing-masing tabung
10. Gel agarose disiapkan ke dalam alat elektroforesis, lalu tambahkan buffer TAE
hingga terendam.
11. Ambil sampel dari tabung DNA size marker dan tabung sampel, lalu dimasukkan
ke dalam masing-masing well
Well 1: M, DNA size marker sebanyak 10 μL
Well 2: CS, sebanyak 20 μL
Well 3: S1, sebanyak 20 μL
Well 4: S2, sebanyak 20 μL
Well 5: S3, sebanyak 20 μL
Well 6: S4, sebanyak 20 μL
Well 7: S5, sebanyak 20 μL
12. Elektroforesis dilakukan dengan voltase 100V selama 30 menit.

3.4 Elektroforesis
3.4.1 Alat dan Bahan
11

Visualisasi hasil amplifikasi tersebut digunakan alat-alat yang berupa

apparatus elektroforesis (tray, comb, dan electrophoresis chamber), mikropipet,
sumber arus listrik, dan sumber sinar UV (gel doc). Bahan-bahan yang digunakan,
antara lain bubuk gel agarosa, sampel DNA darah dan mukosa pipi hasil PCR, tips,
tabung microtube, parafilm, sampel
DNA hasil digesti DNA finger printing, DNA loading dye, DNA marker
Lambda/HindIII, DNA marker EZ Load™ Precision Molecular Mass Ruler, buffer
TAE, Fast Blast DNA Staining dan GelRed®.

3.4.2 Cara Kerja

1. Lakukan sentrifugasi hasil PCR mukosa pipi dan darah dengan kecepatan
2000 x g selama 3 detik.
2. Tambahkan 10 𝜇𝑙 loading dye pada tabung yang mengandung produk PCR.
3. Sebanyak 10𝜇𝑙 sampel dimasukkan ke setiap sumuran agarose yang sudah
mengandung staining agent berupa gel red.
4. Tambahkan buffer TAE ke dalam chamber elektroforesis hingga merendam
agarose dan sumuran.
5. Jalankan alat elektroforesis selama 30 menit pada voltase 100V.
6. Hasil divisualisasi di bawah sinar UV.
12

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi DNA

Sebelum tahap amplifikasi dengan Polymerase Chains Reaction (PCR),
diperlukan tahap persiapan meliputi isolasi DNA untuk memperoleh isolat DNA
sebagai DNA target amplifikasi. Prinsip dasar dalam isolasi DNA adalah
memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain
seperti RNA, protein, lipid, enzim dan komponen lain.8

4.1.1 Isolasi DNA dari Sel Darah

Tahapan proses isolasi DNA dengan menggunakan kit Promega dengan
sampel whole blood pada vena. Isolasi DNA pada praktikum ini diawali dengan
penambahan cell lysis solution (CLS) pada sampel darah yang bertujuan untuk
melisis sel darah merah dikarenakan komponen CLS dapat membuat sel dalam
keadaan hipotonik sehingga air dapat masuk ke dalam sel dan membuat tekanan
osmosis (integritas) membrane dalam sel akan meningkat, kemudian sel mengembang
dan pecah. Hasilnya berupa supernatan berisi sel darah merah, organel lain dan
sitosol. Supernatan dibuang.9
Proses pelisisan kembali dilakukan dengan penambahan Nuclei Lysis Solution
(NLS) untuk melisis membrane inti leukosit sehingga DNA dalam inti selnya bisa
diisolasi. NLS mengandung sodium sodecyl sulfate (detergen) yang berfungsi
melisiskan membrane inti sel darah putih. Lisis sel dengan deterjen adalah alternatif
yang mudah untuk mengganggu membran sel. SDS memiliki gugus hidrofobik dan
hidrofilik yang juga dimiliki oleh membrane inti sel darah putih, antara sisi
hidrofobik detergen dengan lipid pada membran sel membentuk senyawa lipid
detergen kompleks sehingga struktur membran sel darah putih akan rusak dan
melisiskan isi sel.9,10 Apabila pelisisan sel tidak sempurna, maka DNA tidak akan
terekstraksi dan proses amplifikasi dengan PCR tidak dapat berjalan.
13

Tahap presipitasi protein dilakukan dengan penambahan protein precipitation

solution (PPS) yang mengandung ammonium asetat. PPS dapat mengikat protein
sehingga ketika di sentrifugasi, protein akan mengendap. Hasilnya pelet berisi
protein-protein yang terendapkan oleh PPS dan sisanya Hb sehingga warna pellet
keruh. Pelet dibuang, supernatant berisi DNA oleh karena itu, supernatant
dipindahkan ke tabung baru.
Tahap bind (pemekatan) DNA dilakukan dengan penambahan isopropanol.
DNA tidak dapat larut dalam isopropanol, sehingga saat ditambahkan dengan
isopropanol DNA akan terpekatkan dengan bantuan sentrifugasi. Hal ini bisa dilihat
dari terbentuknya pelet putih di dasar tabung ketika dilakukan sentrifugasi. Tahap
pencucian DNA menggunakan larutan etanol 70% yang berfungsi menghilangkan
sisa sisa pengotor yang masih tertinggal pada proses pemekatan DNA. Alkohol
merupakan senyawa organik yang digunakan untuk menarik zat-zat pengotor yang
ada dalam DNA tersebut. DNA dipisahkan dari pengotornya dengan cara sentrifugasi
sehingga DNA terkumpul pada dasar tabung sebagai pelet.
Tahap terakhir yaitu mengkonsentrasikan DNA genom yang diperoleh dengan
dilarutkan dalam rehydration solution (RS) yang mengandung Tris-
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) pada pH 9,0. Tris-EDTA dalam RS
berfungsi menonaktifkan DNAase, dengan mengkelat kation logam (Mg 2+ atau Ca2+)
yang dibutuhkan oleh enzim ini.11 Hasil akhir dari proses isolasi DNA yaitu
terbentuknya DNA tidak berwarna. Penyimpanan DNA dalam rehydration solution
(RS) pada suhu -20 °C bertujuan untuk menjaga DNA hasil isolasi agar tidak rusak
dan dapat disimpan dalam waktu yang lama.

4.1.2 Isolasi DNA Sel Mukosa Pipi

Tahap isolasi ini menggunakan metode Chelex (Chelating Ion Exchange
Resin), diawali dengan berkumur menggunakan larutan NaCl 0,9%, yang merupakan
larutan garam fisiologis yang bersifat isotonik. Walaupun tidak mempunyai senyawa
biologis aktif, NaCl 0,9% sering digunakan sebagai larutan kumur karena memiliki
toksisitas yang minimal sehingga sel mukosa yang akan diisolasi tidak mengalami
14

lisis atau mengerut akibat perbedaan tekanan osmosis dan DNAnya dapat diisolasi
dengan baik.12 Perlakuan pengumuran tadi juga akan melepaskan sel-sel mukosa pipi
karena sifatnya yang tidak menempel kuat, sehingga sel mukosa pipi terisolasi.
Selanjutnya sample dari sel mukosa pipi tadi disentrifugasi, ini dimaksudkan agar sel-
sel mukosa tadi terkumpul di dasar tabung menjadi pellet
Selanjutnya pelet diresuspensi, dan dimasukkan ke larutan matriks InstaGene.
Matriks InstaGene dibuat dengan resin 6% b/v Chelex 100 yang diformulasikan
secara khusus, membuat preparasi sampel DNA cepat, mudah, hemat biaya, dan
menghasilkan DNA template berkualitas untuk PCR.13
Chelex resin adalah kopolimer stirena divinilbenzena yang mengandung ion
iminodiasetat berpasangan, yang bertindak sebagai gugus pengkhelat dalam mengikat
ion logam polivalen. Resin Chelex digunakan untuk mengekstrak DNA dengan cara
memanaskannya pada suhu tertentu (hot shock). Selama proses ekstraksi, resin
Chelex mampu melindungi sampel dari enzim DNAse yang mungkin tetap aktif
selama proses ekatraksi. Hal ini dilakukan melalui pengikatan ion dan kation, salah
satunya adalah pengikatan ion Magnesium (Mg2+). Secara alami, enzim DNAse
terdapat pada semua jaringan tubuh. Enzim ini mampu memotong DNA menjadi
fragmen kecil, hingga mampu menghancurkan DNA, sehingga keberadaan cnzim ini
dapat mengurangi kuantitas ekstrak DNA yang dihasilkan. Jika jumlah DNA di dalam
ekstrak DNA kurang, maka hal ini akan berpengaruh terhadap keberbasilan proses
selanjutnya yaitu proses PCR (Polymerase Chain Reaction).
Terkait dengan ion Magnesium (Mg2+), Mg2+ adalah kofaktor penting untuk
DNAse. Resin Chelex akan mengikat erat ion dan kation yang terlarut dalam larutan
resin tersebut, termasuk ion Mg2+. Dengan pengikatan tersebut, resin Chelex
membuat DNAse tidak bereaksi, sehingga akan melindungi DNA dari aktivitas
enzim.13
Proses selanjutnya yaitu inkubasi pada suhu 56 oC, suhu ini akan
menginaktifkan DNAse yang akan menghidrolisis DNA, melonggarkan jaringan ikat
sel mukosa, dan menghilangkan gumpalan-gumpalan DNA. Selanjutnya dilakukan
inkubasi kedua pada suhu 100oC, disini DNAse dan protein-protein lain akan
15

terdenaturasi, membran sel akan rusak, dan DNA akan keluar dari inti sel. DNA yang
telah dimurnikan dan dipresipitasikan dengan matriks InstaGene™ tersebut akan
berada pada supernatan setelah disentrifugasi dan bisa digunakan untuk analisis
selanjutnya. DNA disimpan dengan suhu dingin dengan matriks InstaGene setelah
sampel dipanaskan, hal ini bertujuan agar memperlambat aktivitas enzim yang tersisa
yang dapat merusak DNA dan juga memperlambat pertumbuhan bakteri.

4.2 Pengukuran Kadar dan Kemurnian DNA

4.2.1 Hasil
Pengukuran kadar DNA dilakukan dengan metode spektrofotometri. Panjang
gelombang 260 nm merupakan panjang gelombang optimum untuk mengukur
absorbans akibat resonansi ikatan rangkap pada basa purin dan pirimidin, sedangkan
panjang gelombang 280 nm merupakan panjang gelombang yang biasa digunakan
untuk mengukur absorbans protein (aromatik).

Tabel 3.1. Hasil Pengukuran Serapan Sampel DNA Darah pada λ = 260 dan 280 nm

λ (nm) Larutan Serapan

230 Darah 0,004
Pipi 0,046
260 Darah 0,062
Pipi 0,028
280 Darah 0,021
Pipi 0,017

μg
[ DNA sel darah]= A 260 ×50 × faktor pengenceran
mL
μg μg
¿ 0,062 ×50 × 25=77,5
mL mL

A 260 0,062
Kemurnian DNA sel darah= = =2,9
A 280 0,021
16

μg
[ DNA sel mukosa pipi]= A 260 ×50 × faktor pengenceran
mL
μg
¿ 0,028 ×50 × 50
mL
μg
¿ 28
mL
A 260 0,028
Kemurnian DNA sel mukosa pipi pada A280 = = =1,64
A 280 0,017

4.2.2 Pembahasan
Pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA hasil isolasi dilakukan melalui
spektrofotometer yang didasarkan pada prinsip iradiasi sinar ultraviolet yang diserap
oleh nukleotida dan protein dalam larutan. Penyerapan iradiasi sinar UV secara
maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan
penyerapan oleh protein pada panjang gelombang 280 nm. Perbandingan absorbansi
pada 260 nm dan 280 nm (A260/A280) dapat memberikan validasi kemurnian DNA.
Hasil isolasi DNA dikatakan murni jika nilai rasio A260/280 antara 1,8-2,0. Nilai
rasio yang lebih rendah dari 1,8 menunjukkan adanya kontaminasi protein sedangkan
nilai rasio melebihi 2,0 menunjukkan adanya kontaminasi RNA.14
DNA yang diisolasi dari sel darah juga kemurniannya kurang bagus, bisa dilihat
dari rasio A260/A280 menunjukkan nilai 2,9 yang artinya banyak kontaminan
terutama dari RNA karena nilainya di atas 2,0. Kontaminasi dari RNA bisa
disebabkan karena tahap yang dikerjakan tidak menggunakan RNAse sehingga resiko
kontaminasi terhadap RNA sangat tinggi.14
Hasil pengukuran kemurnian DNA dengan rasio A260/A280 dari sel mukosa
menunjukkan nilai 1,64 yang artinya DNA dari sel mukosa masih terkontaminasi
protein. Protein kontaminan bisa berasal dari kondisi mulut yang mengandung
banyak protein serta tahapan pemisahan protein DNA dan presipitasi protein yang
kurang baik, bisa juga terdapat protein dalam jumlah sedikit namun dengan residu
17

asam amino aromatik yang banyak, sehingga meningkatkan nilai serapan A280 yang
mengakibatkan rasio A260/A280 menjadi kecil.14
Konsentrasi DNA merupakan banyaknya jumlah DNA yang didapat melalui
tahap pelisisan. Hasil yang didapatkan untuk kadar DNA sel darah adalah 77,5 μg/mL
sedangkan untuk kadar DNA mukosa adalah 28 μg/mL. Perbedaan nilai konsentrasi
DNA dari masing-masing sampel yang dihasilkan dalam proses isolasi DNA genom
disebabkan oleh beberapa faktor. Faktor pertama terkait cara pengumpulan sampel.
Proses pengumuran berpengaruh dalam pengumpulan sel mukosa pipi untuk isolasi
DNA. Jika pengumuran tidak efektif, sehingga pada saat ekstrasi DNA yang
dihasilkan juga sedikit. Faktor kedua terkait kecepatan ekstraksi. Pada tahap lisis sel
dan presipitasi, pengambilan supernatan dilakukan secara bergiliran sehingga
memungkinkan terjadi pengendapan. Faktor ketiga yaitu homogenisasi dengan
larutan-larutan yang digunakan untuk ekstraksi DNA.14

4.3 Amplifikasi DNA dengan teknik PCR

Reaksi polimerase berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction
(PCR) merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida
secara in vitro. Penggunaan metode PCR dapat menghasilkan DNA dalam jumlah
besar dengan waktu relatif singkat.15
Tahap awal pembuatan master mix dengan komposisi primer, dNTPs (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP), Buffer PCR dan MgCl2, dan enzim Tag Polimerase. Primer
adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi
sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Primer
berperan sebagai titik awal terjadinya amplifikasi DNA. Dalam proses PCR dNTPs
bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA.
dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai
baru yang komplementer dengan untai DNA templat. Primer dalam PCR perlu dibuat
forward dan reverse karena ukuran whole genome panjang sehingga perlu di potong15
Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Fungsi buffer
adalah untuk menjaga pH. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg 2+ ion
18

tersebut berasal dari MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi
menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai
katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR, enzim ini diperlukan
untuk tahap ekstensi DNA.15
Template DNA merupakan urutan DNA yang mengandung daerah yang akan
diamplifikasi. Fungsi DNA template di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan
untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. DNA mukosa pipi dan darah
yang didapat dari hasil isolasi digunakan sebagai tempalate untuk diamplifikasi
menggunakan PCR. Masing-masing template DNA ini kemudian di ambil 20μl dan
kemudian dimasukkan ke dalam tabung PCR yang telah berisi larutan master mix,
kemudian di homogenisasi dengan cara di up and down sebanyak 2 sampai 3 kali,
Kemudian masing-masing tube PCR dimasukkan ke dalam thermal cycler dan
proses PCR berlangsung 40 siklus. Tiap siklus terdiri dalam tiga tahap berulang
(denaturasi, annealing dan extention), dimana pada setiap siklus terjadi duplikasi
jumlah DNA. Denaturasi pada suhu 94ºC. Pada tahap ini DNA untai ganda akan
membuka menjadi DNA untai tunggal, hal ini disebabkan karena suhu denaturasi
yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa nitrogen
komplementer yang saling berikatan. Tahap annealing (penempelan) berlangsung
pada suhu 60°C. Tahap ini terjadi penempelan primer pada daerah DNA untai tunggal
yang sesuai dengan urutan basa primer. Cara menentukan suhu annealing itu dilihat
dari urutan primer yang digunakan, semakin banyak primernya mengandung basa
G+C maka melting poinnya semakin tinggi. Jika suhu penempelan primer terlalu
tinggi dari suhu optimum, menyebabkan primer tidak menempel dengan DNA
cetakan. Sedangkan, jika suhu penempelan primer terlalu rendah dari suhu
penempelan primer optimum menyebabkan mispriming, yaitu penempelan primer
pada tempat yang salah pada DNA cetakan sehingga dihasilkan produk non spesifik.
Primer yang telah menempel pada DNA cetakan akan mengalami pemanjangan pada
sisi 3’ dengan penambahan komponen dNTPs yang komplemen dengan cetakan oleh
DNA polymerase.15,16 Reaksi pemanjangan (extension) polymerisasi terjadi pada suhu
72oC. Produk hasil PCR kemudian dilakukan elektroforesis.
19

4.4 DNA Fingerprinting (RFLP)

4.4.1 Hasil
Praktikum RFLP telah dilakukan dan hasil yang diperoleh dari kelima
suspect yaitu DNA suspect 3 (S3) memiliki kemiripan pola pita dengan sampel DNA
dari crime scene (Gambar 4.1). Oleh karena itu dapat ditarik kesimpulan bahwa S3
ialah pelaku kejahatannya. Hasil dari elektroforesis yang divisualisasikan kemudian
ditentukan ukurannya menggunakan kurva standar (Gambar 4.2) dengan ukuran serta
jumlah DNA pada setiap fragmennya diketahui melalui nilai jarak (Sumbu X) yang
dimasukkan pada setiap persamaannya (Lampiran 1).

M CS S1 S2 S3 S4 S5

Gambar 4.1 Hasil elektroforesis RFLP. Kedua kotak bewarna merah menunjukkan
kesamaan pita yang dihasilkan antara suspect 3 dengan sampel yang
diperoleh dari crimescene. Hal ini menunjukkan bahwa suspect 3
dicurigai sebagai pelaku kejahatannya.
20

Kurva Standar HindIII Kurva Semilog DNA

1.5 3000
Log 10 Size bp

Base pair (Bp)

1 f(x) = 20.39 x − 0.53 2000
R² = 0.99
1000 f(x) = − 122.42 x + 2918.75
0.5
R² = 0.67
0 0
0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 10 12 14 16 18 20 22 24 26
1/Distance (mm) Distance (mm)

Gambar 4.2 Kurva standar migrasi DNA. Kurva Standar HindIII diperoleh y=20,39x-
0,5305 dengan nilai R2= 0,99 yang menandakan data terdapat korelasi
yang kuat antara kedua variabel. Kurva semilog DNA menunjukkan
nilai y=-122,42x+2918,7 dengan R2= 0,67 yang menunjukkan
rendahnya korelasi antar kedua variabel.

4.4.2 Pembahasan
Hasil praktikum RFLP menyatakan bahwa S3 merupakan pelaku
kejahatannya. Hal tersebut dapat dilihat dari kesamaan posisi dan jumlah pita yang
terbentuk dengan sampel yang didapatkan pada crime scene. Restriction Fragment
Length Polymorphism (RFLP) merupakan suatuk teknik yang memanfaatkan
polimorfisme (variasi urutan DNA homolog) untuk membedakan individu berbeda
dalam spesies yang sama. Analisis RFLP adalah teknik profil DNA pertama yang
murah untuk diterapkan secara luas. Analisis RFLP digunakan dalam melakukan
pemetaan genom, lokalisasi gen untuk kelainan genetik, penentuan risiko penyakit,
dan pengujian paternitas. Analisis RFLP dilakukan dengan memotong sampel DNA
menjadi fragmen menggunakan enzim restriksi, dan selanjutnya fragmen dilarikan
pada elektroforesis gel sesuai dengan ukurannya. Polimorfisme panjang fragmen
restriksi dikatakan terjadi ketika panjang fragmen yang terdeteksi bervariasi antar
individu, menunjukkan homologi urutan yang tidak identik. Setiap panjang fragmen
dianggap sebagai alel, apakah itu benar-benar mengandung daerah pengkode atau
tidak, dan dapat digunakan dalam analisis genetik selanjutnya.17-19
21

4.5 Elektroforesis
4.5.1 Hasil
Praktikum elektroforesis sampel darah dan mukosa pipi telah dilakukan dan
hasil yang diperoleh yaitu sampel darah tidak mengandung elemen Alu (homozigot
-/-) sedangkan sampel mukosa pipi merupakan homozigot +/+ (Gambar 4.3).

M +/+ -/- +/- darah pipi

Gambar 4.3 Hasil elektroforesis hasil PCR sampel darah dan mukosa pipi. Kotak
kuning menunjukkan hasil pita sampel mukosa pipi yang sejajar dengan
marker Alu homozihot (+/+). Hal ini menunjukkan bahwa sampel
mukosa pipi memiliki gen Alu. Kotak merah menunjukkan hasil pita
sampel darah yang sejajar dengan marker Alu homozihot (-/-). Hal ini
menunjukkan bahwa sampel darah tidak memiliki gen Alu.

4.5.2 Pembahasan
Hasil praktikum elektroforesis hasil PCR sampel darah dan mukosa pipi
diperoleh sampel darah tidak mengandung elemen Alu (homozigot -/-) sedangkan
sampel mukosa pipi merupakan homozigot +/+. Elemen Alu merupakan elemen
transposable. Elemen transposable adalah urutan DNA langka yang dapat
memindahkan (atau mentranspos) dirinya sendiri ke posisi baru dalam genom sel
tunggal. Elemen Alu panjangnya sekitar 300 basa dan ditemukan di seluruh genom
manusia. Ukurannya yang tipis dikombinasikan dengan mekanisme "salin dan
tempel" dan penyisipan elemen Alu di wilayah genom tertentu adalah tidak biasa.
Oleh karena itu, dapat diasumsikan bahwa ketika dua individu berbagi penyisipan
22

elemen Alu tertentu kemungkinan karena nenek moyang yang sama.20 Pada
praktikum ini produk PCR yang terbentuk untuk homozigot Alu berkisar 900bp,
sedangkan homozigot negatifnya berkisar 600bp. Produk heterozigot Alu muncul
dengan dua pita dengan berat molekul yang berkisar 900 bp dan 600 bp.
Hasil amplifikasi DNA pada praktikum ini dibaca menggunakan
elektroforesis. Elektroforesis adalah istilah umum yang menggambarkan migrasi dan
pemisahan partikel bermuatan (ion) di bawah pengaruh medan listrik. Sistem
elektroforesis terdiri dari dua elektroda dengan muatan berlawanan (anoda, katoda),
dihubungkan oleh media penghantar yang disebut elektrolit. Mobilitas partikel ionik
ditentukan oleh ukuran partikel, bentuk, dan muatan, dan suhu selama pemisahan, dan
konstan di bawah kondisi elektroforesis yang ditentukan. Kondisi elektroforesis
dicirikan oleh parameter listrik (arus, tegangan, daya), dan faktor-faktor seperti
kekuatan ionik, nilai pH, viskositas, ukuran pori, dll., yang menggambarkan media
tempat partikel bergerak.21
23

BAB V
KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa:

1. Konsentrasi DNA hasil isolasi dari darah sebesar 77,5 μg/mL dengan
kemurnian 2,9. Sedangkan konsentrasi DNA hasil isolasi mukosa pipi sebesar
28 μg/mL dengan kemurnian 1,64.
2. Sampel darah tidak mengandung elemen Alu homozigot (-/-) sedangkan
sampel mukosa pipi merupakan homozigot (+/+).
3. Identifikasi DNA fingerprinting pada suatu skenario kejahatan menunjukkan
bahwa pelaku kejahatan merupakan suspect 3 (S3) karena memiliki kemiripan
pola pita dengan sampel DNA dari crime scene.
24

DAFTAR PUSTAKA

1. Gupta N. DNA Extraction and Polymerase Chain Reaction. J Cytol.

2019;36(2):116-117.
2. Pooniya S, Lalwani S, Raina A, Millo T, Dogra TD. Quality and quantity of
extracted deoxyribonucleic Acid (DNA) from preserved soft tissues of putrefied
unidentifiable human corpse. J Lab Physicians. 2014;6(1):31-35.
3. Joy B, Linda B, Zoe B, Ashil D, Jane DM, Olaf D, Dadna H, Andrew S,
Michelle S, April S, DNA analysis and its application to forensic investigations
at the victorian institute of forensic medicine. Pathology. 2011,43(1)23.
4. Murtiyaningsih H. Isolasi DNA genom dan identifikasi kekerabatan genetik
nanas menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic DNA). Agritop.
2017; 15(1): 83- 93.
5. V.W. Rodwel, D.A. Bender, K.M. Botham, P.J.Kennelly, P.A. Weil. Biokimia
Harper 30th edition. Jakarta : EGC. 2014. p. 379-82
6. O’Connor C. Investigations in Molecular Cell Biology. Boston College
University Libraries. Boston. 2011; p. 95-6
7. CIRCUIT: Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro, Vol.2, No.1, Februari 2018,
p. 21-26.
8. Chacon-Cortes D, Griffiths L. Methods for extracting genomic DNA from whole
blood samples: current perspectives. Journal of Biorepository Science for
Applied Medicine. 2014; 1-9. 10.2147/BSAM.S46573.
9. Rachmawati Y Khoiriyah R. Comparison of DNA Isolation Results with Simple
Methods and Kits in Samples of Psidium guajava Leaves. Biotropic : The Journal
of Tropical Biology; 2018. (2). 93-99. 10.29080/biotropic.2018.2.2.93-99.
10. Chattopadhyay A, Rao B. Solubilization of G protein-coupled receptors: A
convenient strategy to explore lipid-receptor interaction. Methods in
Enzymology, 2015; 557, 122. https://doi.org/10.1016/bs.mie.2015.01.001
25

11. El-Ashram S, Al Nasr I., Suo X. Nucleic acid protocols: Extraction and
optimization. Biotechnology Reports, 2016; 12, 33–39.
https://doi.org/10.1016/j.btre.2016.10.001
12. Li H., Sun SR., Yap JQ, Chen J,. Qian Q.0.9% saline is neither normal nor
physiological. Journal of Zhejiang University. Science. B, 17(3), 2016; 181–187.
https://doi.org/10.1631/jzus.B1500201
13. Marwayana O. Ekstraksi Asam Deoksiribonukleat (DNA) dari Sampel Jaringan
Otot. LIPI - OSEANA. XI. 2015; 1-9.
14. Abdel-Latif, A, Osman G. Comparison of three genomic DNA extraction
methods to obtain high DNA quality from maize. Plant Methods. 2017; 13(1), 1–
2. https://doi.org/10.1186/s13007-016-0152-4
15. Thermo Fisher. Real-time PCR handbook. Waltham: Life Technologies, 2014.
16. BioRad. Real-Time PCR Applications Guide. Bio-Rad Laboratories, Inc. 2006.
https://doi.org/10.1016/j.mod.2004.07.009
17. Parson W. Age Estimation with DNA: From Forensic DNA Fingerprinting to
Forensic (Epi)Genomics: A Mini-Review. Gerontology. 2018;64(4):326-332.
doi:10.1159/000486239
18. Roper SM, Tatum OL. Forensic aspects of DNA-based human identity testing. J
Forensic Nurs. 2008;4(4):150-156. doi:10.1111/j.1939-3938.2008.00026.x
19. Mori C, Matsumura S. Current issues for mammalian species identification in
forensic science: a review. Int J Legal Med. 2021;135(1):3-12.
doi:10.1007/s00414-020-02341-w
20. Cabana GS, Hulsey BI, Pack FL. Chapter 16 - Molecular Methods. In: DiGangi
EA, Moore MKBT-RM in HSB, eds. Academic Press; 2013:449-480.
doi:https://doi.org/10.1016/B978-0-12-385189-5.00016-9
21. Fritsch RJ, Krause I. ELECTROPHORESIS. In: Caballero BBT-E of FS and N
(Second E, ed. Academic Press; 2003:2055-2062. doi:https://doi.org/10.1016/B0-
12-227055-X/01409-
26

Lampiran 1

Focus Questions
Lesson 1. DNA Template Preparation

1. Why is it necessary to chelate the metal ions from solution during the
boiling/lysis step at 1000C? What would happen if you did not use a chelating
agent such as the InstaGene matrix?
InstaGene merupakan kit yang digunakan untuk menangkap ion-ion logam
dari suatu larutan. Pemanasan yang dilakukan pada suhu 100 0C bertujuan
untuk merusak sel sehingga materi seperti organel dan DNA dari dalam sel
akan keluar. Ion Mg2+ akan di ikat oleh Insta Gene, karena ion tersebut
merupakan kofaktor bagi DNAse. DNAse merupakan enzim yang akan
merusak/ mencerna DNA. Apabila InstaGene tidak digunakan, maka DNA
dapat dirusak oleh DNAse selama terjadinya proses lisis dari sel.

2. What is needed from the cells for PCR?

Proses PCR memerlukan template DNA yang berasal dari DNA pada sel.

3. What structures must be broken to release the DNA from a cell?

Struktur yang dirusak agar DNA keluar dari dalam sel ialah membran intisel
dan membran plasma sel.

4. Why do you think the DNA is stored cold with InstaGene matrix after boiling
the samples?
Penyimpanan dalam suhu rendah bertujuan agar struktur DNA tetap terjaga
dan tidak terjadi proses enzimatik yang menyebakan degradasi dari DNA.
27

Lesson 2. PCR Amplification

1. Why is it necessary to have a primer on each side of the DNA segment to be
amplified?
Primer forward dan reverse sangat diperlukan dalam amplifikasi DNA
karena primer tersebut merupakan titik dimulainya sintesis DNA sebelum
nantinya dilanjutkan oleh DNA polimerase untuk proses elongasi untaian
DNA. Selain itu, primer dibutuhkan pada setiap ujung segmen DNA karena
DNA hasil isolasi masih bersifat whole genome yang ukurannya sangat besar
sehingga polimerisasinya perlu dihentikan untuk mendapatkan amplifikasi
sekuens DNA yang dibutuhkan saja agar hasil PCRnya dapat dibaca pada
running gel elektroforesis.

2. How did Taq DNA polymerase acquire its name?

Taq DNA polymerase mendapatkan namanya dari asal enzim tersebut
diisolasi yaitu dari bakteri Thermus aquaticus yang mampu bertahan hingga
mencapai suhu 940C.

3. Why are there nucleotides (A, T, G, and C) in the master mix? What are the
other components of the master mix, and what are their functions?
Nukleotida yang ditambahkan pada master mix merupakan bahan utama
untuk sintesis DNA. Komponen lain yang terdapat di dalam master mix yaitu
ion magnesium yang merupakan kofaktor bagi DNA polimerase; dan buffer
yang berfungsi dalam mempertahankan lingkungan yang optimum selama
proses reaksi PCR.

4. Describe the three main steps of each cycle of PCR amplification and what
reactions occur at each temperature.
Tahap awal yaitu denaturasi yang bertujuan untuk merusak ikatan hidrogen
sehingga melepaskan untai ganda DNA menjadi untai tunggal. Denaturasi
dilakukan pemanasan pada suhu 940C selama 1 menit.
28

Tahap selanjutnya yaitu annealing yang merupakan tahap penempelan primer

oligonukleotida pada setiap untai DNA sehingga DNA polimerase dapat
mengenali situs awal sintesis DNA. Tahap ini dilakukan pada suhu 600C
dengan waktu yang disesuaikan dengan kemampuan primer yang digunakan.
Primer yang digunakan akan menentukan melting point pada tahap PCR
yang mana apabila sekuens pada primer banyak mengandung ikatan basa G-
C maka memerlukan melting point yang tinggi karena pasangan G-C
dibentuk dari tiga buah ikatan hidrogen. Sedangkan pasangan A-T hanya
dibentuk dari dua ikatan hidrogen. Primer yang baik memiliki melting point
dengan rentang 52-58oC, sedangkan diatas 65oC memerlukan secondary
annealing.

Tahap akhir yaitu ekstensi yang merupakan tahap polimerisasi dari

nukleotida (A, T, G, dan C) oleh DNA polimerase sepanjang DNA template
hingga terbentuk salinan DNA komplementer. Tahap ini dilakukan pada suhu
720C dengan waktu yang disesuaikan.

5. Explain why the precise length target DNA sequence doesn’t get amplified
until the third cycle. You may need to use additional paper and a drawing to
explain your answer.
Siklus awal PCR terjadinya terdenaturasi molekul DNA dan annealing dari
primer, selanjutnya elongasi yang dilakukan oleh Taq polimerase sehingga
menghasilkan sekuens target komplemen baru dan masing-masing
mengandung primer reverse dan forward namun masih memiliki ukuran yang
lebih panjang dibanding sekuens target yang diinginkan (belum presisi).
Siklus kedua, terbentuk dua jenis cetakan hasil dari siklus pertama setelah
proses denaturasi yaitu cetakan DNA asli dan cetakan DNA target yang
belum presisi. Cetakan DNA asli akan mengalami proses yang sama seperti
yang terjadi pada siklus pertama, sedangkan cetakan DNA target belum
29

presisi mengalami annealing dan terekstensi hingga ujung 3’ target, sehingga

diperoleh untai komplemen DNA target.
Siklus ketiga akan dimulainya proses amplifikasi dengan menggunakan
cetakan DNA yang ukurannya sesuai target yang diinginkan.

Lesson 3. Gel Electrophoresis of Amplified PCR Samples

1. Explain the difference between an intron and an exon
Intron merupakan sekuens DNA maupun RNA yang tidak mengkode protein
sehingga akan dihilangkan sebelum pembentukan mRNA.
Ekson merupakan sekuens DNA maupun RNA yang mengkode protein
sehingga tidak dihilangkan melalui proses splicing. mRNA nantinya akan
mengandung sekuens yang mampu ditranslasikan menjadi protein.

2. Why do the two possible PCR products differ in size by 300 base pairs?
Perbedaan ukuran dari produk PCR bergantung terhadap titik dan jumlah
potongan sekuens DNA sehingga jumlah intron yang terdapat dalam produk
juga berbeda-beda.

3. Explain how agarose electrophoresis separates DNA fragments. Why does a

smaller DNA fragment move faster than larger one?
Elektroforesis adalah teknik pemisahan fragmen DNA yang berbasis ukuran
molekul dengan dialiri arus listrik. Fragmen DNA yang bermuatan negatif
akan bergerak menuju kutub positif dengan melewati pori-pori dari gel
30

agarosa. Pori pada agaros tersebutlah yang akan memisahkan fragmen DNA
berdasarkan ukurannya dari yang terbesar hingga terkecil. Semakin kecil
ukuran suatu molekul maka akan semakin cepat geraknya melewati pori gel
agarosa.

4. What kind of controls are run in this experiment? Why are they important?
Could others be used?
Kontrol yang digunakan pada praktikum ini yaitu marker Lamda/HindIII.

Lesson 4 Analysis and Interpretation of Results

Focus Questions
1. What is your genotype for the Alu insert in your PV92 region?
Sampel darah tidak mengandung elemen Alu homozigot (-/-) sedangkan sampel
mukosa pipi merupakan homozigot (+/+)

2. What are the genotypic frequencies of +/+ and -/- in your class population? Fill
in the table below with your class data.
Table 1. Observed Genotypic Frequencies for the Calss
Category Number Frequency (# of genotype/total
Homozygous (+/+) 1 0.5
Heterozygous (+/-) - -
Homozygous (-/-) 1 0.5
Total=2 =1

3. What are frequency of each allele in your class sample? Fill in the table below
with your class data. Remember, a class of 32 student (N) will have a total of 64
(2N) instances of each locus.
Table 2. Calculated Allelic Frequencies for the Calss
Category Number Frequency (# of genotype/total
(+) alleles 1 p=0.5
(-) alleles 1 q=0.5
Total alleles= 2 = 1.00
4. The following table presents data from a USA-wide random population study.
31

Table 3. Genotypic Frequencies for Alu in a USA Sample

Category Number Frequency (# of genotype/total
Homozygous (+/+) 2,422 0.24
Heterozygous (+/+) 5,528 0.55
Homozygous (-/-) 2,050 0.21
Total= 10,000 =1.00

Now, using the data above, calculater the allelic frequencies for the USA data as you
did for your class population.
Table 4. Calculated Allelic Frequencies for USA
Category Number Frequency (# of genotype/total
(+) alleles 10372 p= 0.52
(-) alleles 9628 q=0.48
Total alleles= 20000 = 1.00

5. How do your actual class data for genotypic and allelic frequencies compare with
those of random sampling of the USA population? Would you expect them to
match? What reason can you think of the explain the differences or simillarities?
Data kelas yang diperoleh berbanding terbalik dengan data populasi USA.
Harapan hasil yang diperoleh seharusnya sama. Hal tersebut dikarenakan jumlah
data yang tidak besar dan tidak teracak sempurna.

6. Using the values for p and q that you calculate in Table 2 for your class
population, calculate p2, 2pq and q2. Do they come out to be the same as the
genotype frequencies that you found in the Table 1? If they do, your class
resembles a Hardy-Weinberg genetic equlibrium. If your obsrved (actual)
genotype frequencies are not the same as the expected values, what might be some
of the reason(s) for the difference?
Au ah gelap.

7. Using the values for p and q that you calculate in Table 4 for the USA population
sample, calculate p2, 2pq and q2. Do they come out to be the same as the genotype
32

frequencies that you found in the Table 3? Does this USA-wide sample suggest
that the population of the USA is in Hardy-Weinberg genetic equlibrium?
Au ah gelap.

Pre-Lab Focus Questions: Introduction to DNA Fingerprinting

Consideration What is the structure of DNA?

1. Compare the “backbone” of the sugar-phosphate arrangement in the side

chains of all three figures. Are there any differences?
Tidak ada perbedaan diantara struktur ketiganya

2. In the above figure, do all three samples contain the same bases? Describe
your observations.
Komponen basa pada ketiga sampel sama, yaitu Adenin, Timin, Guanin,
dan  Cytosine  (A, T, G, C)

3. Are the bases paired in an identical manner in all three sample? Describe the
pattern of the base pair bonding.
Pada ketiga sampel, basa nitrogen dipasangkan secara identic dengan pola
Adenin-Timin dan Guanin-Cytosine
33

4. In your attempt to analyze DNA samples from three different individual, what
conclusions can you make about the similarities and differences of the DNA
samples?
Persamaan: setiap individu memiliki struktur DNA yang terdiri dari gula
pentosa, gugus phospat, dan basa nitrogen. Perbedaan: antar individu
terletak hanya pada susunan basa nitrogennya

5. What will you need to compare between these DNA samples to determine if
they are identical or non-identical?
Urutan basa DNA dari setiap sampel bisa digunakan untuk membandingkan
apakah sampel berasal dari kembar identic atau bukan.

Lesson 1 Restriction Digestion of DNA Samples

1. How many pieces of DNA would result from this cut?
Dua

2. Write the base sequence of the DNA fragments on both the left and right side
of the “cut”.
5’ ATGAATTCTCAATTACCT 3’
3’ TACTTAAGAGTTAATGGA 5’

Kiri Kanan
5’ ATG AATTCTCAATTACCT 3’
3’ TACTTAA GAGTTAATGGA 5’

3. What differences are there in the two pieces?

Jumlah fragmen DNA atau jumlah pasangan basa dalam fragmen tersebut.
34

4. DNA fragment size can be expressed as the number of base pairs in the
fragment. Indicate the size of the fragments [mention any discrepancy you
may detect].
a. The smaller fragment
3 base pairs
b. What is the length of the longer fragment
11 base pairs

5. Consider the two samples of DNA shown below – single strands are shown
for simplicity:
Sample #1
CAGTGATCTCGAATTCGCTAGTAACGTT
Sample #2
TCATGAATTCCTGGAATCAGCAAATGCA
If both samples are treated with the restriction enzyme EcoRI [recognition
sequence GAATTC] the indicate the number of fragment and the size of each
fragment from each sample of DNA.
Sample #1: Memiliki 2 potong DNA. Potongan terbesar 17 basa , potongan
terkecil 11 basa.
Sample #2: Memiliki 2 potong DNA. Potongan terbesar 23 basa, potongan
terkecil 5 basa.

Lesson 1 Restriction Digestion of DNA Samples

Review Questions
1. Before you incubated your samples, describe any visible signs of change in
the
contents of the tubes containing the DNA after it was combined with the
restriction enzymes.
35

Tidak ada tanda-tanda perubahan yang terlihat pada sampel setelah

ditambahkan dengan enzim restriksi. Sampel terlihat jernih dan tidak
berwarna

2. Can you see any evidence to indicate that your samples of DNA were
fragmented or altered in any way by the addition of EcoRI/ PstI? Explain.
Tidak ada perubahan yang terlihat secara visual pada sampel DNA yang
berada pada masing-masing tabung.
3. In the absence of any visible evidence of change, is it still possible that the
DNA
samples were fragmented? Explain your reasoning.
Ya, masih mungkin sampel DNA terfragmentasi. DNA yang mengalami
fragmentasi dikarenakan pada setiap sampel diberikan enzim restriksi yang
memotong sekuens DNA sesuai situs restriksinya Proses terpotong atau
tidaknya DNA tidak dapat dilihat langsung secara visual pada tabung

4. (Answer the next day – after the restriction digest) After a 24 hour incubation
period, are there any visible clues that the restriction enzymes may have in
some way changed the DNA in any of the tubes? Explain your reasoning
Tidak ada tanda tanda yang terlihat bahwa enzim restriksi mungkin telah
mengubah DNA di salah satu tabung. Reaksi terjadi pada tingkat molekul,
sehingga terlalu kecil untuk dapat dilihat secara visual

Lesson 2 Agarose Gel Electrophoresis

Review Questions
1. The electrophoresis apparatus creates an electrical field with positive and
negative poles at the ends of the gel. DNA molecules are negatively charged.
To which electrode pole of the electrophoresis field would you expect DNA to
migrated? (+ or -)? Explain.
36

DNA akan bergerak ke kutub positif. Hal ini dikarenakan DNA bermuatan
negatif dengan adanya gugus fosfat pada nukleotida, sehingga saat
dijalankan pada elektroforesis, DNA akan bergerak dari kutub negatif ke
kutub positif.

2. What color represents the negative pole? Hitam

3. After DNA samples are loaded into the sample wells, they are “forced” to
move through the gel matrix. What size fragments (large vs small) would you
expect to move toward the opposite end of the gel most quickly? Explain.
DNA yang berukuran kecil akan bergerak lebih cepat ke arah kutub positif,
karena molekul DNA akan lebih mudah melewati pori-pori gel agarose

4. Which fragment (large vs small) are expected to travel to the shortest distance
from the well? Explain.
Pergerakan kecepatan DNA dalam gel agarose dipengaruhi oleh ukuran
fragmen DNA tersebut. Jika ukuran fragmen DNA besar, maka kecepatan
akan melambat akibat hambatan dari pori-pori gel agarose yang kecil.

Post-Lab: Thought Questions

1. What can you assume is contained within each band?
Fragmen DNA dengan sekuens nukleotida tertentu yang terpotong sesuai
situs
restriksi.

2. If this were a fingerprinting gel, how many samples of DNA can you assume
were placed in each separate well?
Sebanyak satu sampel DNA yang diletakkan pada setiap well
37

3. What would be a logical explanation as to why there is more than one band of
DNA for each of the samples?
Terdapat lebih dari satu pita DNA untuk setiap sampel karena setiap sampel
DNA mengalami pemotongan oleh enzim restriksi sesuai situs restriksinya

4. What caused the DNA to become fragmented?

DNA mengalami fragmentasi dikarenakan pada setiap sampel diberikan
enzim restriksi yang memotong sekuens DNA sesuai situs restriksinya. Enzim
tersebut memotong DNA pada urutan basa tertentu yang spesifik.

5. Which of the DNA samples have the same number of restriction sites for the
restriction endonucleases use? Write the lane numbers
Sampel DNA memiliki jumlah situs restriksi yang sama terdapat pada sampel
CS dan S3 (lane 1 dan 4)
6. Which sample has the smallest DNA fragment?
Sampel yang memiliki fragmen DNA terkecil terdapat pada sampel S4
7. Assuming a circular piece of DNA (plasmid) was used as starting material,
how many restriction sites were there in lane three?
Sebanyak 3 situs restriksi pada lane 3
8. From the gel drawing on page 35, which DNA samples appear to have been
“cut” into the same number and size of fragments?
CS dan S3 (lane 1 dan 4) merupakan sampel DNA yang dipotong menjadi
jumlah dan ukuran fragmen yang sama
9. Based on your analysis of the example gel drawing on page 35, what is your
conclusion about the DNA samples in the drawing? Do any of the samples
seem to be from the same source? If so, which ones? Describe the evidence
that supports your conclusion
38

Terdapat sampel yang berasal dari sumber yang sama yaitu pada sampel CS
dan S3. Hal tersebut dapat dilihat dari kesamaan posisi dan jumlah pita
yang terbentuk dengan sampel yang didapatkan pada crime scene Sehingga
dapat disimpulkan bahwa S3 merupakan pelaku kejahatannya.

Post Lab: Interpretation of Results

1. What are we trying to determine? Restate the central question
Menentukan pelaku kejahatan berdasarkan sample DNA suspek dengan
sample DNA yang ada pada tempat kejadian.
2. Which of your DNA samples were fragmented? What would your gel look
like if the DNA were not fragmented?
Pada praktikum ini seluruh sampel DNA terfragmentasi.
3. What caused the DNA to become fragmented?
Fragmentasi DNA genom disebabkan karena adanya enzim restriksi, enzim
ini dapat mengenali dan memotong DNA di mana terjadi urutan spesifik
pendek dalam proses yang disebut restriction digestion.
4. What determines where a restriction endonuclease will cut a DNA molecule?
Enzim restriksi akan memotong DNA di daerah palindrom yaitu daerah yang
terdiri dari basa nukleotida yang jika dibaca dari 5’ ke 3’ atau sebaliknya
tetap sama.
5. A restriction endonuclease cuts two DNA molecules at the same location.
What can you assume is identical about the molecules at that location?
Kedua situs rekstriksi tersebut menunjukkan keidentikan.
6. Do any of your suspect samples appear to have EcoRI or PstI recognition sites
at the same location as the DNA from the crime scene?
Iya, DNA suspek 3 memiliki situs restriksi yang spesifik dengan DNA dari
crime scene.
39

7. Based on the above analysis, do any of the suspect samples of DNA seem to
be from the same individual as the DNA from the crime scene? Describe the
scientific evidence that supports your conclusion.
Identifikasi DNA fingerprinting pada skenario kejahatan menunjukkan bahwa
pelaku kejahatan merupakan suspek 3 (S3) karena memiliki kemiripan pola
pita dengan sampel DNA dari crime scene.
1

Lampiran 2 Ukuran DNA dan jarak migrasi pada gel Agarose

Lamba/HindIII
CS S1 S2 S3 S4 S5
Size Marker

Actual Distanc Approx Distanc Approx Distanc Approx. Distanc Approx. Distanc Approx.
Distance Distance Approx.
Band size e . size e . size e size e size e size
(mm) (mm) size (bp)
(bp) (mm) (bp) (mm) (bp) (mm) (bp) (mm) (bp) (mm) (bp)

1 11 23,130 19 3,679 21 2,817 21 2,817 19 3,679 21 2,817 21 2,817

2 13 9,416 20,5 2,817 23,5 1,191 25 1,700 20,5 2,817 29,5 1,093 24 1,986

3 15 6,557 32 820 30,5 949 28,5 1,159 32 820 29,5 1,093

4 18 4,361

5 23 2,322

6 24 2,027