LAPORAN PRAKTIKUM
PEMBUATAN MEDIA, STERILISASI,
DAN KULTIVASI MIKROBA -
MIKROBIOLOGI KEHUTANAN
Sulthan Azhar Idrus
Oleh:
Muhammad Yunus Sulthan Azhar Idrus | 11518053
Kelompok 6
Asisten:
Faza Meidina | 11517027
17 Februari 2021
I. LATAR BELAKANG
Pertumbuhan mikroorganisme sangat bergantung pada kandungan nutrisi
yang terdapat dalam lingkungan sekitarnya. Dalam melakukan kultivasi bakteri
pada suatu media, diperlukan persyaratan yaitu semua unsur hara yang
dibutuhkan mikroorganisme harus terpenuhi pada media agar mikroorganisme
yang tumbuh dapat berkembang dengan optimal pada media. Kultivasi bakteri
adalah metode untuk melipatgandakan jumlah mikroba dengan membiarkan
mereka berkembang biak dalam media biakan yang telah disiapkan dalam
kondisi yang terkendali. Menurut Suriawati (2005), media harus memiliki
tekanan osmosis, tegangan permukaan, dan pH yang sesuai dengan kebutuhan
dari mikroba, zat penghambat pertumbuhan organisme harus dihilangkan pada
media, dimana media harus steril sehingga kultur mikroba yang tumbuh tidak
terkontaminasi.
Sterilisasi digunakan untuk menghilangkan gangguan yang dapat
disebarkan oleh mikroorganisme atau kontaminasi dan meminamilisir
penurunan kualitas inokulasi (Dewi et al., 2017). Sterilisasi terhadap alat dan
bahan sebelum pelaksanaan kegiatan praktikum mikrobiologi membantu hasil
atau identifikasi yang akurat terhadap pemeriksaan mikrobiologi. Dengan
melakukan praktikum ini, diharapkan kultivasi bakteri dan pembuatan media
dapat membantu memasok bakteri untuk bidang Rekayasa Kehutanan.
II. TUJUAN
1. Menentukan perbedaan komposisi media pertumbuhan untuk bakteri dan
jamur
2. Menentukan fungsi dan prinsip dasar dari sterilisasi panas menggunakan
autoklaf
3. Menentukan fungsi dan prinsip dasar dari sterilisasi fisik menggunakan
teknik filtrasi
4. Menentukan fungsi dan prinsip dasar dari sterilisasi kimia menggunakan
alkohol 70%, antibiotik, dan antifungi
5. Menentukan perbedaan dan fungsi dari teknik-teknik isolasi dan purifikasi
mikroba
6. Menentukan perbedaan dan fungsi dari teknik-teknik kultivasi mikroba
MODUL III – MUHAMMAD YUNUS SULTHAN AZHAR IDRUS – 11518053
III. HIPOTESIS
1. Perbedaan komposisi media pertumbuhan untuk bakteri dan jamur adalah
pada media pertumbuhan bakteri komposisinya dari ekstrak daging dan
ekstrak ragi, sedangkan komposisi media pertumbuhan jamur utamanya
berupa ekstrak kentang.
2. Prinsip sterilisasi panas dengan autoklaf adalah menggunakan panas dan
tekanan uap air yang dihasilkan untuk membunuh bakteri setelah
dipanaskan.
3. Prinsip sterilisasi fisik dengan teknik filtrasi adalah menfiltrasi atau
menyaring cairan dengan suatu saringan dengan ukuran pori-pori yang
sangat kecil sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut.
4. Sterilisasi kimia menggunakan alkohol 70%, antibiotik, dan antifungi
berfungsi untuk membersihkan atau mensterilisasi secara kimia. Alkohol
70% mampu mematikan mikroorganisme secara umum, antibiotik mampu
mematikan bakteri, dan antifungi mampu mematikan jamur.
5. Teknik isolasi dan purifikasi berfungsi untuk memisahkan atau
memindahkan mikroba. Pada teknik isolasi bakteri dipisahkan/dipindahkan
dari lingkungan aslinya, sedangkan pada purifikasi bakteri dipisahkan/
dipindahkan dari koloninya.
6. Fungsi teknik kultivasi mikroba metode tusuk, gesek, dan tanam adalah
untuk budidaya mikroba. Perbedaan ketiga metode tersebut adalah pada cara
meletakkan/memasukkan mikroba pada media tumbuh.
tabung reaksi, medium PDA dalam cawan petri, mikropipet, NA cair, plat
NA miring dalam tabung reaksi, plat NA tegak dalam tabung reaksi, plat
PDA dalam cawan petri, suntik steril, dan tabung reaksi. Meja, tangan, serta
peralatan yang akan digunakan harus dibersihkan terlebih dahulu
menggunakan alkohol 70% untuk meminimalisir terjadinya kontaminasi.
2. Penggunaan Mikropipet
Mikropipet dipegang dengan cara digenggam. Jempol berada pada
tombol stopper dan keempat jadi lainnya berada pada layar volume di
bagian samping. Untuk mengambil cairan, digunakan stop 1 yaitu stopper
ditekan dan ditahan. Jika ingin menuang cairan, maka stopper ditekan sekali
lagi. Jika ingin mengubah volume pada mikropipet, stopper ditarik dan
diputar searah jarum jam untuk menambah dan berlawanan arah jarum jam
untuk mengurangi volume. Setiap ukuran mikropipet memiliki jenis tips
(bagian ujung yang berfungsi sebagai pipet) khusus. Untuk mengambil tips,
ujung mikropipet (bagian hitam) dimasukkan ke dalam tips yang sesuai,
kemudian jika sudah masuk, tips diangkat bersamaan dengan mikropipet.
Untuk melepaskan tips, tombol sebelah stopper ditekan.
tegak dengan cara tusuk. Ditusuk hingga setengah media. Lalu batang oose
dipanaskan kembali dan diinkubasi selama 24-48 jam.
V. HASIL PENGAMATAN
1. Proses Sterilisasi
2. Isolasi
3. Inokulasi
VI. PEMBAHASAN
Pembiakan mikroba dalam laboratorium memerlukan media yang berisi
zat-zat hara atau nutrien serta lingkungan pertumbuhan sesuai dengan
mikroorganisme (Rahayu, 2014). Nutrisi yang diperlukan mikroorganisme
seperti bakteri dan jamur biasanya berupa senyawa sederhana yang tersedia
secara langsung atau berasal dari senyawa kompleks yang kemudian dipecah
oleh mikroorganisme menjadi senyawa yang sederhana melalui proses
enzimatik. Medium adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrisi yang
dibuat dengan tujuan sebagai tempat tumbuh mikroba. Selain berfungsi untuk
menumbuhkan mikroba, medium juga memiliki peranan yang penting dalam
proses isolasi dan inokulasi mikroba serta untuk uji fisiologi dan biokimia
mikroba. (Hidayati, 2016).
Medium yang digunakan pada praktikum ini diantaranya Nutrient Agar
(NA), Potato Dextrose Agar (PDA), dan Nutrient Broth (NB). NA termasuk ke
dalam jenis media padat yang berfungsi sebagai media yang digunakan untuk
memperlajari koloni bakteri dengan menumbuhkan dan mengembangbiakkan
bakteri. NA dibuat dari ekstrak beef, pepton, ekstrak yeast, NaCl, dan agar
dengan pH netral yaitu 7 (Putri, 2012). Potato Dextrose Agar (PDA) merupakan
media padat yang sering digunakan untuk menumbuhkan dan
mengembangbiakkan jamur, yeast dan kapang (Radji, 2011). Berdasarkan
pernyataan Octavia & Wantini (2017), PDA merupakan medium yang terbentuk
dari berbagai komponen yaitu kentang, asam tartarat, glukosa, dan agar.
Kemudian, Wahyuningsih et al. (2018) menyatakan bahwa Nutrient Broth (NB)
termasuk ke dalam media cair dan media yang umum digunakan untuk
menumbuhkan biakan secara general. Komposisi NB terdiri dari beef extract
sebagai sumber karbon, pepton sebagai sumber nitrogen, ekstrak ragi, dan NaCl.
Berdasarkan fungsinya, medium NA, PDA, dan NB termasuk ke dalam jenis
media umum karena berfungsi untuk menumbuhkan bakteri, jamur, dan ragi
secara umum, bergantung kepada komposisi penyusun medium dan kebutuhan
nutrisi mikroba yang akan ditumbuhkan (Aryal et al., 2019). Ketiga medium ini
juga dikelompokkan sebagai medium kompleks karena dari setiap komponen
MODUL III – MUHAMMAD YUNUS SULTHAN AZHAR IDRUS – 11518053
yang ditakar tidak diketahui secara spesifik kandungannya apa saja dan bisa
berbeda antara komponen penyusun yang satu dengan lainnya.
Autoklaf adalah suatu alat pemanas tertutup yang digunakan untuk
mensterilkan suatu alat dan benda dengan menggunakan uap bersuhu dan
bertekanan tinggi. Pada proses sterilisasi menggunakan autoklaf, temperatur
yang digunakan yaitu 121°C dengan tekanan uap sebesar 15 lbs. Dapat diartikan
bahwa tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap
inchi persegi (15 Psi = 15 pounds per square inch) yang dilakukan selama
kurang lebih 15 menit. Peningkatan tekanan tersebut dimaksudkan untuk
meningkatkan temperatur yang membuat air mendidih dan memberikan
kekuatan lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Suhu
yang tinggi inilah yang akan membunuh mikroorganisme, dimana autoklaf
terutama ditujukan untuk membunuh endospora, yaitu sel resisten yang
diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan
antibiotik. Sejalan dengan pernyataan Nurhabibah (2014), yaitu pada suhu
121°C endospora dapat dibunuh dalam waktu 4-5 menit, di mana sel vegetatif
bakteri dapat dibunuh hanya dalam waktu 6-30 detik pada suhu 65°C.
Berdasarkan hasil pengamatan yang dapat dilihat pada Gambar 5.1, dapat
dilihat bahwa tabung yang disterilisasi menggunakan autoklaf terlihat lebih
jernih dibandingkan dengan tabung yang tidak distrerilisasi dengan autoklaf,
dimana terdapat bintik putih dan keruh. Hal ini menunjukkan bahwa sterilisasi
menggunakan autoklaf terbukti ampuh untuk meminimalisir kontaminan karena
bakteri akan mati pada suhu tinggi.
Dalam metode sterilisasi dengan teknik filtrasi di praktikum ini, digunakan
membran nitroselulosa dengan pori yang berukuran 0,2 μm. Diameter pori-pori
dapat berukuran 0,2 μm; 0,45 μm; 0,65 μm; dll (Hafsan, 2014). Pori pada
membran nitroselulosa yang berukuran 0,2 μm ini berfungsi untuk menyaring
materi partikulat dan bakteri yang dapat mengontaminasi medium kultur selama
proses pembuatan. Ukuran pori-pori dapat mempengaruhi tingkat sterilitas dari
suatu hal, maka dari itu membran nitroselulosa dipilih sebagai membran untuk
filtasi dikarenakan pori-pori membrane cukup untuk menyaring kontaminan.
Berdasarkan hasil pengamatan yang dapat dilihat pada Gambar 5.2, terlihat
MODUL III – MUHAMMAD YUNUS SULTHAN AZHAR IDRUS – 11518053
pada Gambar 5.5, sterilisasi dengan antibiotik pada PDA setelah 24 jam dan 48
jam teramati fungi berwarna putih pada kultur Rhizopus oligosporus. Pada
Gambar 5.6, sterilisasi dengan antibiotik pada NA setelah 24 jam dan 48 jam
juga teramati fungi berwarna putih pada kultur Rhizopus oligosporus. Hal
tersebut menunjukkan bahwa pemberian antibiotik dalam medium NA ataupun
PDA terbukti ampuh dalam membunuh bakteri. Hal ini dikarenakan antibiotik
efektif untuk mencegah pertumbuhan mikroorganisme pada Gram negatif,
karena Rhizopus oligosporus adalah Gram positif maka terlihat jamur tumbuh,
sesuai dengan pernyataan Najibah (2014) yaitu antibiotik efektif untuk bakteri
Gram negatif. Sedangkan pada sterilisasi dengan antifungi pada PDA yang
dapat dilihat pada Gambar 5.7, terdapat fungi berwarna putih di
Staphylococcus aureus setelah 24 jam dan 48 jam. Pada Gambar 5.8, sterilisasi
dengan antifungi pada NA teramati fungi berwarna putih besar di
Staphylococcus aureus dan juga terdapat Rhizopus oligosporus setelah 24 jam
dan 48 jam. Hal tersebut terjadi karena nystatin hanya akan diikat oleh
jamur/ragi yang sensitif, maka dari itu tumbuh jamur pada kedua kultur tersebut
karena bukan jamur yang sensitif, sesuai dengan pernyataan Retnaningsih
(2017) bahwa nystatin hanya akan diikat oleh jamur atau ragi yang sensitif.
Isolasi bakteri merupakan proses mengambil bakteri dari medium atau
lingkungan asalnya yang harus dilakukan secara aseptik dan menumbuhkannya
di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni. Menurut Singleton
dan Sainsbury (2006), aseptik berarti bebas dari sepsis yaitu kondisi
terkontaminasi karena mikroorganisme lain. Populasi bakteri dapat diisolasi
menjadi biakkan atau kultur murni, terdiri dari satu jenis bakteri yang dapat
dipelajari morfologi, sifat, dan kemampuan biokimianya. Beberapa teknik
isolasi antara lain yaitu 4 way streak, sebar/spread, dan tuang/pour. Isolasi 4
way streak merupakan teknik penggoresan dengan 4 kuadran. Daerah kuadran
1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel
mikroorganisme. Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari
goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisahpisah
menjadi koloni tunggal. Metode gores umumnya digunakan mengisolasi koloni
mikroba pada cawan agar sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan
MODUL III – MUHAMMAD YUNUS SULTHAN AZHAR IDRUS – 11518053
biakan murni (Irianto, 2012). Berdasarkan hasil pengamatan yang dapat dilihat
pada Gambar 5.11, sampel yang diinkubasi selama 24 jam tidak memiliki
koloni tunggal atau masi bercampur dengan par mulatikel yang lain, tetapi dapat
dilihat juga bahwa setelah melewati proses inkubasi selama 48 jam sampel
mulai memisahkan diri untuk membentuk koloni murni dengan ciri-ciri seperti
sebaran berwarna merah.
Isolasi sebar/spread merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara
menginokulasi kultur mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar
yang telah memadat. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur
mikroba. Karena konsentrasi sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui,
maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap, sehingga sekurang-
kurangnya ada satu dari pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah.
Koloni mikrobia yang terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung.
(Ngalih, 2013). Berdasarkan hasil pengamatan yang dapat dilihat pada Gambar
5.10, terdapat seperti kubangan berwarna merah yang menandakan bakteri
sedang ada di fase logaritmik setelah diinkubasi selama 24 jam, kemudian
setelah diinkubasi selama 48 jam jumlah koloni mulai sedikit karena bakteri
sedang ada dalam fase stagnan yang dapat dilihat pada wadah yang dimana
koloni bakteri sebelumnya jauh lebih menyebar menjadi seperti sebaran titik-
titik saja. Isolasi tuang/pour merupakan isolasi bakteri dengan cara penuangan
yang bertujuan untuk menentukan perkiraan jumlah bakteri hidup dalam suatu
cairan. Hasil perhitungan jumlah bakteri pada cara penuangan dinyatakan dalam
koloni (Irianto, 2012). Berdasarkan hasil pengamatan yang dapat dilihat pada
Gambar 5.9, teramati koloni tunggal yang tersebar sebar pada permukaan
cawan berwarna merah tipis, dan setelah 48 jam teramati koloni yang tersebar
pada permukaan cawan dan menutupi cawan petri berwarna merah pekat. Hasil
pengamatan ini sesuai dengan pernyataan Irianto (2012) bahwa metode isolasi
tuang ini memungkinkan pengamat untuk menghitung jumlah bakteri yang
dinyatakan dalam koloni.
Inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama
ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk
melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan agar semua
MODUL III – MUHAMMAD YUNUS SULTHAN AZHAR IDRUS – 11518053
alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar
menghindari terjadinya kontaminasi (Surbakti, 2010). Inokulasi sendiri
memiliki perbedaan dengan isolasi, dimana inokulasi bertujuan untuk menanam
bakteri ke medium baru sedangkan isolasi bertujuan untuk mendapatkan kultur
murni yang nanti dapat digunakan untuk penelitian. Teknik inokulasi sendiri
terbagi menjadi beberapa metode, pada praktikum kali ini akan digunakan
metode gesek, tusuk, dan tanam. Metode gesek merupakan metode yang
digunakan untuk menumbuhkan bakteri aerob. Pada metode ini kawat oose yang
sudah disentuhkan pada kultur lama digesek pada medium NA baru dengan cara
gesek zig-zag (Prescott, 2014). Dapat dilihat pada Gambar 5.12 dan Gambar
5.13 bahwa koloni bakteri hasil inokulasi dengan metode gesek bakteri
Staphylococcus aureus dan Serratia marcescens sudah muncul pada waktu
inkubasi selama 24 jam dan menjadi semakin banyak pada 48 jam. Sedangkan
pada Gambar 5.18 dan Gambar 5.19, inokulasi metode gesek jamur
Penicillium sp. dan Rhizopus oligosporus teramati miselium sudah tumbuh
sejak waktu inkubasi 24 jam dan bertambah banyak pada waktu inkubasi 48 jam
serta menutupi keseluruhan permukaan wadah. Selanjutnya, metode tusuk
merupakan metode untuk pengujian motilitas dengan cara menusukkan kawat
oose yang telah terdapat kultur bakteri kedalam medium NA baru secara tegak
lurus permukaan medium. Dapat dilihat pada Gambar 5.14 dan Gambar 5.15,
bahwa koloni bakteri hasil inokulasi dengan metode tusuk bakteri
Staphylococus aureus dan Serratia marcescens sudah muncul sejak masa
inkubasi 24 jam. Metode tanam merupakan metode untuk memindahkan biakan
mikroba dengan cara menempelkan kultur murni yang telah dipotong ke dalam
medium baru (Prescott, 2014). Pada pengamatan inokulasi metode tanam jamur
Penicillium sp. yang dapat dilihat pada Gambar 5.16, teramati bahwa miselium
sudah tumbuh pada waktu inkubasi selama 24 jam dan pada waktu inkubasi 48
jam miselium sudah menutupi seluruh. Sedangkan pada pengamatan inokulasi
metode tanam jamur Rhizopus oligosporus yang dapat dilihat pada Gambar
5.17, teramati miselium jamur telah tumbuh pada waktu inkubasi 24 jam dan
paling banyak pada saat wadah diinkubasi selama 48 jam dimana miselium
menutupi seluruh permukaan wadah.
MODUL III – MUHAMMAD YUNUS SULTHAN AZHAR IDRUS – 11518053
Prescott, L., John, P.H., & Donald, A.K. (2014). Microbiology. McGraw-Hill
Radji, M. (2011). Buku ajar mikrobiologi panduan mahaisiwa farmasi &
kedokteran. Penerbit Buku kedokteran EGC
Rahayu, W. (2014). Analisis pengaruh injeksi mikroorganisme potensial pada
parameter kompresibilitas tanah gambut kayu agung Sumatera Selatan.
Proceeding of 18th Annual National Conference on Geotechnical
Engineering, 97-103
Retnaningsih, A., Saputri, G., dan Sari, E. (2017). Uji daya hambat daun sukun
(Artocarpus altilis folium) terhadap Candida albicans dan Bacillus subtilis
dengan metode difusi. Jurnal Analis Farmasi, 2(3), 195-200
Singleton, P., dan Sainsbury, D. (2006). Dictionary of Microbiology and
Molecular Biology (Edisi ke-3). John wiley & Sons Ltd. 228-229.
Surbakti, T. (2011). Inokulasi mikroba mikrobiologi. Trianda Surbakti.
https://triandasurbakti.wordpress.com/2011/01/05/inokulasi-mikroba-
mikrobiologi/. Diakses 22 Februari 2021
Suriawati, Unus. (2005). Mikrobiologi dasar (Edisi 1). Papas Sinar Sinanti.
Susatyo & Jojok, H. (2016). Perbedaan pengaruh pengolesan dan perendaman
alkohol 70% terhadap penurunan angka hitung kuman pada alat
kedokteran gigi. Jurnal Vokasi Kesehatan, 2(1), 1-9
Wahyuningsih, N. & Zulaika, E. (2018). Perbandingan pertumbuhan bakteri
selulolitik pada media nutrient broth dan carboxy methyl cellulose. Jurnal
Sains Dan Seni ITS, 7(2), 36-38