Metode Spektrofotometri

a. Prinsip

Spesimen atau hasil destilasi uap jaringan di destilasi secara langsung dalam

larutan asam tungstat untuk mengendapkan protein. Cairan dari destilat dicampur

dengan sejumlah tertentu larutan standar kalium dikromat dalam larutan asam sulfat

sehingga mencapai keasaman 15 N dan dioksidasi pada suhu 100°C. Residu ini diukur

dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 450 nm dan konsentrasi alkohol

pada spesimen dihitung dari kurva kalibrasi atau table yang disiapkan dari larutan yang

diketahui kadar alkoholnya.

b. Alat

1) Peralatan destilasi uap dari Dubowski dan Shupe (Sciensifiglass apparatus)

2) Penangas air elektrik pada suhu 100°C atau pada suhu yang konstan pada 100°C

dengan cairan yang mudah larut (cairan UCON 50-HB-280X)

3) Spektrofotometer (450 nm)

4) Pipet

5) Labu ukur yang bertutup gelas

c. Reagen

1) Reagen pengoksidasi : 0.0214 N kalium dikromat 1.0500 g K2Cr2O7 dalam 1 liter

dari 50% volume asam sulfat (1 ml dari reagen setara dengan 0.247 mg etil alcohol)

2) Larutan Natrium tungstat 10% w/v

3) Asam sulfat 2/3 N

4) Larutan Asam tartrat 10% w/v

d. Cara Kerja

Spesimen darah, urin, saliva, cairan serebrospinal, destilasi jaringan

1) Masukkan spesimen dan reagen ke dalam labu destilasi 125 ml.

2) Sedangkan untuk spesimen darah digunakan tabung 250 ml, masukkan 10 ml

akuades (untuk analisa darah 20 ml), 2 ml spesimen (1 ml spesimen dapat dianalisa

dengan mengumpulkan hasil destilat dalam labu ukur 5 ml dilanjutkan dengan

langkah c hingga e), 5 ml asam sulfat 2/3 N dan 5 ml natrium tungstat 10%. Campur

isi labu dengan memutar labu dan pasang pada alat destilasi. Destilasi dimulai ketika

darah sudah terkoagulasi sempurna dan berubah menjadi warna coklat gelap.

3) Destilasi pelan-pelan di dalam labu ukur bertutup gelas 10 ml, hingga volume kurang

dari 10 ml selama 8-10 menit, menggunakan mikroburner dengan api 2.5-4 cm,

volume diatur sampai garis tanda 10 ml dengan akuades, tutup dan campur dengan

baik.

4) Ke dalam tabung reaksi gelas borosilikat bertutup ulir dari teflon, masukkan 1 ml

destilat dan 5 ml reagen pengoksidasi, campur dengan pemutaran yang kuat. Segera

tutup tabung dan panaskan selama 8 menit dalam penangas air elektrik 100°C,

masukkan tabung di atas level cairan.

5) Dinginkan tabung pada suhu kamar (25°C atau kurang), di bawah air mengalir atau

dalam icebath, campur dengan memutar dan pindahkan cairan ke dalam kuvet. Baca

pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 450 nm, setelah alat dipasang

pada 100% transmitant dengan kuvet yang berisi akuades.

6) Konsentrasi alkohol dalam sampel (%w/v) diketahui dengan table kalibrasi atau kurva

yang disiapkan dari beberapa seri spesimen yang kadar alkoholnya telah diketahui.