JurnalPra-bukti

Mekanismegatal pada dermatitis stasis: Peran signifikan IL-31 dari makrofag

Takashi Hashimoto, MD, PhD, Christina Dorothy Kursewicz, BS, Rachel Alison
Fayne, BA, Sonali Nanda, MS, Serena Maya Shah, kandidat BS, Leigh Nattkemper,
PhD, Hiroo Yokozeki, MD, PhD, Gil Yosipovitch, MD
PII: S0022-202X (19) 33304-4
DOI: https://doi.org/10.1016/j.jid.2019.09.012
Referensi: JID 2165

Dimunculkan di: The Journal of Investigative Dermatology

Received Date: 29 June 2019

Revised Date: 24 September 2019
Accepted Date: 30 September 2019

Harap mengutip artikel ini sebagai: Hashimoto T, Kursewicz CD, Fayne RA, Nanda S, Shah SM,
Nattkemper L , Yokozeki H, Yosipovitch G, Mekanisme gatal pada dermatitis stasis: Peran signifikan IL-
31 dari makrofag, The Journal of Investigative Dermatology (2019), doi: https://doi.org/10.1016/
j.jid.2019.09. 012.

Ini adalah file PDF dari artikel yang telah mengalami penyempurnaan setelah diterima, seperti
penambahan halaman sampul dan metadata, serta pemformatan agar terbaca, tetapi ini belum menjadi
versi rekaman definitif. Versi ini akan menjalani penyalinan, penyusunan huruf, dan tinjauan tambahan
sebelum dipublikasikan dalam bentuk akhirnya, tetapi kami menyediakan versi ini untuk memberikan
visibilitas awal artikel. Harap dicatat bahwa, selama proses produksi, kesalahan dapat ditemukan yang
dapat mempengaruhi konten, dan semua penafian hukum yang berlaku untuk jurnal yang bersangkutan.

© 2019 Penulis. Diterbitkan oleh Elsevier, Inc. atas nama Society for Investigative Dermatology.
JUDUL: Mekanisme gatal pada dermatitis stasis: Peran signifikan IL-31 dari makrofag

PENULIS: Takashi Hashimoto, MD, PhD1), 2) *, Christina Dorothy Kursewicz, BS1), Rachel

Alison Fayne, BA1), Sonali Nanda , MS1), Serena Maya Shah, kandidat BS1), Leigh Nattkemper,

PhD1), Hiroo Yokozeki, MD, PhD2), Gil Yosipovitch, MD1) *.

1) Miami Itch Center, Dr. Phillip Frost Department of Dermatology and Cutaneous Surgery,

Miller School of Medicine, University of Miami, Miami, FL, US

2) Department of Dermatology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical

and Dental University , Tokyo, Jepang

* Penulis korespondensi
ORCID:

Takashi Hashimoto, 0000-0001-6779-5598

Christina Dorothy Kursewicz, 0000-0001-5135-6865

Rachel Alison Fayne, 0000-0002-9350-9812

Sonali Nanda, 0000-0001- 5501-8193

Serena Maya Shah, 0000-0002-0981-7792

Leigh Nattkemper, 0000-0003-0895-7985

Hiroo Yokozeki, 0000-0002-5773-9485

Gil Yosipovitch, 0000-0001-6303-1822

PENULIS KORESPONDING:

Gil Yosipovitch, MD

1600 NW 10th Ave, RMSB 2067B, Miami, FL 33136

Telp: 305-213-5824

Fax: 305-243-6191

1
Email: gyosipovitch@med.miami.edu

Takashi Hashimoto, MD, PhD

1-5-45, Yushima, Bunkyo-ku , Tokyo 113-8519, Jepang

Telp: 81-3-5903-5286

Fax: 81-3-5803-5289

Email: hashderm@tmd.ac.jp

JUDUL SINGKAT: IL-31 yang diturunkan dari makrofag pada dermatitis stasis gatal

SINGKATAN: IKLAN (dermatitis atopik), Arg-1 (arginase-1), CCR4 (reseptor kemokin CC

tipe 4), CXCR3 (reseptor kemokin CXC tipe 3), IL (interleukin), MOMA-2 (monosit /

makrofag), NK1R (neurokinin- 1 reseptor), OSMRβ (reseptor oncostatin M β), PAR-2 (reseptor

yang diaktifkan oleh protease 2), pM (makrofag peritoneal), RBC (sel darah merah), SD
(dermatitis stasis), SP (Zat P), Th (T helper), TRPA1 (transient receptor potential ankyrin-1),

TRPV1 (transient receptor potential vanilloid-1), TSLP (thymic stromal lymphopoietin).

2
ABSTRAK

Dermatitis statis (SD) merupakan penyakit yang sering terjadi pada penduduk lanjut usia, dengan

pruritus sebagai salah satu gejala yang mengganggu. Namun, ada beberapa modalitas terapeutik

yang tersedia untuk gatal terkait SD karena sedikit yang diketahui tentang mekanisme

patofisiologisnya. Oleh karena itu, kami berusaha untuk menyelidiki mediator gatal di SD

menggunakan studi imunofluoresensi pada lesi pasien yang berfokus pada IL-31. ex vivo Studi

stimulasimenggunakan makrofag peritoneal murine juga digunakan untuk menjelaskan mekanisme

patologis pembentukan IL-31. Pada lesi SD, sel IL-31 (+) yang menginfiltrasi dermal meningkat

jumlahnya dibandingkan dengan kontrol yang sehat, dan mayoritas sel IL-31 (+) adalah makrofag

CD68 (+). Adanya gatal di SD secara bermakna dikaitkan dengan jumlah makrofag CD68 (+) / IL-

31 (+) dan makrofag CD68 (+) / CD163 (+) M2. Jumlah makrofag CD68 (+) / IL-31 (+) berkorelasi

dengan jumlah sel CCR4 (+) Th2 dermal, sel IL-17 (+), basofil, sel zat P (+), dan deposisi dermal

periostin dan hemosiderin. Selanjutnya, makrofag peritoneal murine mengekspresikan penanda M2

arginase-1 dan menghasilkan IL-31 ketika distimulasi dengan kombinasi zat P, periostin, dan lisat
sel darah merah (mewakili hemosiderin). IL-31 dari makrofag mungkin berperan dalam gatal di

SD.

3
PENDAHULUAN

Dermatitis stasis (SD) adalah penyakit umum yang sebagian besar menyerang tungkai

bawah pasien usia lanjut, dengan prevalensi 6,2% di antara mereka yang berusia lebih dari 65 tahun

(Yalçin et al. 2006). Penyebab utama SD adalah insufisiensi vena kronis dan hipertensi vena.

Hipertensi vena meningkatkan akumulasi sel inflamasi (misalnya, sel T dan makrofag) dan

ekstravasasi sel darah merah (RBC) pada kulit yang terkena (Saharay et al. 1997; Thomas et al.

1988). Ekstravasasi dan gangguan sel darah merah diikuti oleh dekomposisi hemoglobin, yang

mengakibatkan besi jaringan yang berlebihan disimpan sebagai hemosiderin (Caggiati et al. 2010).

Hemoglobin dan hemosiderin selanjutnya dapat menginduksi perekrutan monosit / makrofag

melalui reseptor pemulung hemoglobin CD163 (Rubio-Navarro et al. 2015). Akumulasi makrofag

dan sel lain meningkatkan peradangan dan menginduksi gambaran histologis abnormal dari SD

(misalnya, perubahan epidermal spongiotik, pergantian struktur papiler, dan proliferasi kapiler)

sebagian melalui sekresi enzim proteolitik (Sundaresan et al. 2017; Wenk et al. 2001) .

Salah satu gejala mengganggu yang dilaporkan pada SD adalah pruritus. Pada populasi

lansia, dermatosis yang paling sering dilaporkan menyebabkan keluhan gatal adalah SD

(Valdes-Rodriguez et al. 2015). Gatal pada SD tidak hanya mengganggu kualitas hidup pasien,

tetapi juga menyebabkan garukan, yang memperburuk luka dan meningkatkan risiko infeksi
kulit. Sayangnya, ada beberapa modalitas terapeutik yang tersedia untuk gatal karena sedikit

yang diketahui tentang mekanisme patofisiologis dari gatal terkait SD.

Fenomena gatal dibagi menjadi dua sub kelompok yaitu histaminergik dan non histaminergik

(Yosipovitch et al.2018). Gatal pada SD tampaknya non-histaminergik, karena antihistamin

tidak selalu memperbaiki rasa gatal terkait SD. Gatal non-histaminergik melibatkan

4
macam mediator gatal termasuk sitokin / kemokin (misalnya, interleukin [IL] -31), amina,

protease, dan reseptor terkaitnya (misalnya, reseptor-2 yang diaktifkan protease [PAR-2]),

neuropeptida, dan reseptor (misalnya, substansi P [SP] dan reseptor neurokinin-1 reseptor

[NK1R]), saluran ion (misalnya, potensi reseptor transien ankyin-1 [TRPA1] dan vanilloid-1

[TRPV1]), dan sel imun (misalnya, T sel, sel mast, eosinofil, dan basofil).

IL-31, sebuah sitokin pruritogenik terkait T helper (Th) 2, baru-baru ini mendapatkan perhatian

sebagai target terapi potensial untuk kondisi kulit inflamasi dengan rasa gatal (Furue et al. 2018).

IL-31 terlibat dalam gatal pada berbagai penyakit misalnya dermatitis atopik (AD) (Nattkemper et

al. 2018; Sonkoly et al. 2006), prurigo nodularis (Sonkoly et al. 2006), psoriasis (Nattkemper et

al. 2018), dan limfoma sel T kulit (Nattkemper et al. 2016). IL-31 menjalankan fungsinya melalui

kompleks reseptornya, yang terdiri dari IL-31RA dan reseptor oncostatin M β (OSMRβ) (Sonkoly

et al. 2006). Memblokir IL-31RA telah terbukti mengurangi rasa gatal pada DA (Kabashima dkk.

2018). Namun, keterlibatan IL-31 dan kompleks reseptornya pada gatal terkait SD tidak diketahui.

Dengan demikian, kami berusaha untuk menyelidiki mekanisme patofisiologis dari rasa

gatal terkait SD yang berfokus pada IL-31 dan mediator gatal mayor lainnya melalui studi

imunofluoresensi pada lesi pasien. Selain itu, kami berusaha untuk menjelaskan mekanisme

patologis pembentukan IL-31 melalui ex vivo studi stimulasimenggunakan makrofag peritoneal

murine.
 5
HASIL

Makrofag CD68 (+) / CD163 (+) mengekspresikan IL-31 dan berhubungan dengan SD

Pada lesi SD, jumlah sel IL-31 (+) yang menginfiltrasi dermal meningkat secara signifikan

dibandingkan dengan subjek yang sehat (uji-t, P = 0,001), sedangkan ekspresi epidermis tidak (uji-

t, P = 0,80). Selain itu, SD dengan rasa gatal yang parah, yang didefinisikan sebagai tingkat 4 gatal

menggunakan skala likert dari nol (tidak gatal) hingga 4 (gatal parah), menunjukkan infiltrasi sel

IL-31 (+) yang lebih besar di dermis dibandingkan dengan SD tanpa gatal parah, tetapi tidak ada

signifikansi statistik yang ditemukan (uji-t, P = 0,16) (Gambar 1a).

Selanjutnya, kami menyelidiki sumber seluler IL-31. Kami mendeteksi infiltrat kulit

masif yang terdiri dari berbagai jenis sel kekebalan (Gambar 1a dan 3). Paling umum di antara

mereka adalah makrofag CD68 (+), dengan jumlah sel ini meningkat secara signifikan pada lesi

SD dibandingkan dengan kontrol yang sehat (uji-t, P = 0,0016) (Gambar 1a). Oleh karena itu,

kami kemudian memeriksa ekspresi IL-31 oleh makrofag. Seperti yang diharapkan, mayoritas sel

IL-31 (+) adalah sel CD68 (+). Selain itu, jumlah sel IL-31 (+) / CD68 (+) secara bermakna

dikaitkan dengan adanya rasa gatal yang parah sedangkan jumlah sel CD68 (+) kurang lebih sama

pada pasien dengan dan tanpa rasa gatal yang parah (rasio rata-rata sel IL-31 (+) / CD68 (+)

menjadi sel CD68 (+) adalah 88,2% pada pasien dengan gatal parah vs 46,5% pada pasien tanpa

gatal parah; uji-t, P = 0,0096) (Gambar 1b).

Makrofag secara umum dibagi menjadi dua kelompok: M1 dan M2 (Wang et al. 2014). Grup kami

sebelumnya melaporkan bahwa makrofag M2 mampu menghasilkan IL-31 (Hashimoto dkk. 2019b).

Jadi, kami memeriksa ekspresi penanda M2, CD163, oleh sel CD68 (+).

6
Jumlah CD163 (+) / CD68 (+) sel meningkat di SD dengan gatal parah dibandingkan dengan

SD tanpa gatal parah (t-test, P = 0,004) (Gambar 1c).

Ekspresi lesi IL-31RA dan OSMRβ

Ekspresi IL-31RA epidermal dan dermal meningkat pada lesi SD dibandingkan dengan

kontrol yang sehat (uji-t, P <0,0005 dan P = 0,005, masing-masing), tetapi tidak terkait dengan

adanya rasa gatal yang parah (uji-t, P = 0,74 dan 0,58, masing-masing).OSMRβ Ekspresidi

epidermis dan dermis tidak meningkat pada lesi SD dibandingkan dengan kulit sehat (uji-t, P =

0,95 dan 0,086, masing-masing) dan tidak terkait dengan adanya rasa gatal yang parah (uji-t, P =

0,18 dan 0,78, masing-masing) (Gambar 2).

Respon imun Th2 dan Th17 dominan pada lesi SD dan berkorelasi dengan IL-31 ekspresi

oleh makrofag

Kemiringan makrofag M2 erat kaitannya dengan imunitas Th2 (Wang et al. 2014). Jumlah sel

dermal yang mengekspresikan reseptor kemokin CC tipe 4 (CCR4), yang diekspresikan secara

istimewa oleh sel Th2, meningkat pada lesi SD dibandingkan dengan kontrol yang sehat (uji-t, P =

0,0026) dan berkorelasi dengan jumlah CD68 (+) / IL-31 (+) sel (korelasi Spearman, r = 0,453, P =

0,020). Jumlah sel IL-17 (+) juga meningkat pada lesi SD dibandingkan dengan kulit sehat (uji-t, P

= 0,0045) dan berkorelasi dengan jumlah sel CD68 (+) / IL-31 (+) (korelasi Spearman , r = 0,405, P

= 0,040). Sebaliknya, jumlah sel yang mengekspresikan reseptor kemokin CXC tipe 3 (CXCR3),

penanda preferensial untuk sel Th1, tidak berubah antara SD dan kontrol yang sehat (uji-t, P =

0,698) dan tidak berkorelasi dengan jumlah CD68 (+) / IL-31 (+) sel (korelasi Spearman, r = 0,326,

P = 0,104), meskipun ada

7
perbedaan jumlah sel CXCR3 (+) antara lesi SD dengan gatal parah dan yang tidak gatal

parah (uji-t, P = 0,036).

Basofil dan eosinofil terlibat dalam imunitas Th2 (Hashimoto dan Satoh 2018). Jumlah

basofil dermal meningkat pada lesi SD dibandingkan dengan kontrol kesehatan (uji-t, P <0,0005)

dan berkorelasi dengan jumlah sel CD68 (+) / IL-31 (+) (korelasi Spearman, r = 0,603, P = 0,001).

Jumlah eosinofil dermal tidak meningkat pada SD dibandingkan dengan kontrol yang sehat (uji-t,
P = 0,106) atau berkorelasi dengan jumlah sel CD68 (+) / IL-31 (+) (korelasi Spearman, r = 0,145,

P = 0,481) (Gambar 3).

Periostin, substansi P, dan hemosiderin, tetapi tidak TSLP, berkorelasi dengan ekspresi IL-

31 oleh makrofag

Limfopoietin stroma timus (TSLP) dan periostin meningkatkan kemiringan M2 (Furudate

dkk. 2016; Han dkk. 2013) dan generasi IL-31 dari makrofag M2 (Hashimoto dkk. 2019b). Ekspresi

epidermal TSLP tidak meningkat pada lesi SD dibandingkan dengan kontrol yang sehat (uji-t, P =

0,182). Itu juga tidak terkait dengan adanya rasa gatal yang parah (uji-t, P = 0,355) atau dengan

jumlah sel CD68 (+) / IL-31 (+) (korelasi Spearman, r = 0,213, P = 0,295). Sebaliknya, deposisi

dermal perisotin meningkat pada lesi SD dibandingkan dengan kontrol yang sehat (uji-t, P <0,001)

dan berkorelasi dengan jumlah sel CD68 (+) / IL-31 (+) (korelasi Spearman, r = 0,552 , P = 0,003),

tetapi tidak secara langsung berhubungan dengan adanya rasa gatal yang parah (uji-t, P = 0,803).

SP dan hemosiderin juga mampu mendorong kemiringan M2 (Leal et al.2015; Lim et

al.2017; Rubio-Navarro et al.2015). Jumlah sel dermal SP (+) dan deposisi dermal hemosiderin

meningkat pada lesi SD dibandingkan dengan kontrol yang sehat (uji-t, P <0,001 dan P =

8
0,005, masing-masing) dan berkorelasi dengan jumlah CD68 (+) / IL-31 (+) sel (korelasi

Spearman, r = 0,463, P = 0,017 dan r = 0,506, P = 0,008, masing-masing), tetapi tidak terkait

dengan adanya rasa gatal yang parah (uji-t, P = 0,802 dan 0,859 , masing-masing) (Gambar 4).

Makrofag CD68 (+) mengekspresikan NK1R

SP menjalankan fungsinya terutama, tetapi tidak secara eksklusif, melalui reseptor NK1R (Azimi

dkk. 2017; Ständer dan Yosipovitch 2019). SP merangsang sel-sel yang mengekspresikan NK1R,

menghasilkan pelepasan mediator gatal tambahan dan menimbulkan rasa gatal (Yosipovitch et al.

2018). Ekspresi epidermal dan dermal dari NK1R meningkat di SD dibandingkan dengan kontrol

yang sehat (uji-t, P = 0,001 dan P <0,001, masing-masing) tetapi tidak terkait dengan adanya rasa
gatal yang parah (uji-t, P = 0,483 dan 0,559, masing-masing) (Gambar 5a). Dari catatan, hampir

semua makrofag CD68 (+) mengekspresikan NK1R (Gambar 5b).

Persarafan kulit dan mediator gatal lainnya

Serabut saraf intraepidermal (IENF) terlibat dalam gatal (Pereira et al. 2016). Kami menemukan

penurunan kepadatan IENF pada lesi SD dibandingkan dengan kontrol yang sehat (uji-t, P = 0,010)

tetapi tidak ada hubungan antara kepadatan IENF dan adanya rasa gatal yang parah (uji-t, P =

0,28). Sel mast dapat melepaskan berbagai mediator gatal termasuk histamin, prostaglandin, dan

protease (Steinhoff et al. 2018). Jumlah sel mast dermal tidak berubah antara SD dan kontrol sehat,

atau antara SD dengan rasa gatal yang parah dan SD tanpa rasa gatal yang parah. PAR-2 adalah

reseptor representatif untuk gatal non-histaminergik (Steinhoff et al. 2003). Ekspresi epidermal

PAR-2 tidak meningkat pada SD dibandingkan dengan kontrol yang sehat (uji-t, P =

9
0,734) dan berkurang pada SD tanpa rasa gatal yang parah dibandingkan dengan SD dengan

rasa gatal yang parah (uji-t, P = 0,022).

TRPA1 dan TRPV1 adalah saluran ion yang terlibat dalam gatal (Kittaka dan Tominaga 2017).

Ekspresi epidermal TRPA1 dan TRPV1 tidak meningkat di SD dibandingkan dengan kontrol

yang sehat (uji-t, P = 0,071 dan 0,283, masing-masing) atau terkait dengan adanya rasa gatal

yang parah (uji-t, P = 0,375 dan 0,139, masing-masing) ( Gambar Tambahan S1).

Makrofag peritoneal murine menghasilkan IL-31 sebagai respons terhadap kombinasi zat

P, periostin, dan lisat sel darah merah

Untuk menjelaskan mekanisme generasi IL-31 dari makrofag, kami menggunakan ex vivo tes

stimulasidengan makrofag peritoneal murine (pM) (Hashimoto et al. 2019b). pM distimulasi

dengan substansi P, periostin, dan / atau RBC lysate, yang mewakili hemosiderin. Stimulasi dengan
SP saja tidak secara signifikan meningkatkan IL-31 ekspresi mRNApada pM (Supplemental Figure

S2). Sebaliknya, stimulasi dengan periostin saja atau periostin plus SP secara signifikan

meningkatkan IL-31 ekspresi mRNA. Sebagai catatan, stimulasi dengan kombinasi SP, periostin,

ditambah lisat RBC secara dramatis meningkatkan IL-31 ekspresi mRNA(Gambar 6a). Ekspresi

protein IL-31 dikonfirmasi dengan analisis aliran sitometri. Analisis aliran sitometri juga

mengungkapkan bahwa MOMA-2 (+) / IL-31 (+) pM mengekspresikan penanda M2 arginase-1,

yang menunjukkan bahwa makrofag M2 menghasilkan IL-31 sebagai respons terhadap kombinasi

SP, periostin dan hemosiderin (Gambar 6b). , c).

10
PEMBAHASAN

Data saat ini menunjukkan bahwa IL-31 dermal tampaknya memainkan peran penting dalam gatal

pada SD. Khususnya, mayoritas sel pengekspres IL-31 adalah makrofag CD68 (+). Secara umum

ditetapkan bahwa IL-31 dihasilkan terutama oleh sel Th2 yang teraktivasi (Dillon et al. 2004;

Sonkoly et al. 2006). Jenis seluler lainnya juga mampu menghasilkan IL-31, termasuk makrofag

(Marquardt dkk. 2011), eosinofil (Kunsleben dkk. 2015), sel mast (Niyonsaba dkk. 2010), basofil

(Raap dkk. 2017), dan keratinosit (Nattkemper et al. 2016). Di antaranya, makrofag dilaporkan

menjadi sumber seluler utama pada lesi kulit manusia pada kudis (Hashimoto dkk. 2019b), erupsi

cahaya polimorfik (Patra dkk. 2019), dan AD (Kato dkk. 2014).

Pada lesi SD dengan rasa gatal yang parah, sebagian besar makrofag CD68 (+) / IL-31 (+)

mengekspresikan CD163, menunjukkan bahwa mereka adalah makrofag M2. Pada lesi SD tanpa

rasa gatal yang parah, populasi makrofag CD68 (+) yang lebih kecil mengekspresikan CD163.

Temuan ini sejalan dengan penelitian kami sebelumnya pada lesi skabies dengan rasa gatal yang

parah, yang menunjukkan bahwa makrofag M2 yang terakumulasi secara dermal adalah sumber
 seluler utama dari IL-31 (Hashimoto et al. 2019b).

Polarisasi makrofag M2 dipromosikan oleh imunitas Th2 (Wang et al. 2014). Kami

menemukan bahwa sejumlah besar sel CCR4 (+) Th2 dan basofil menyusup ke lesi SD. Deposisi

dermal periostin, protein terkait Th2 (Masuoka et al. 2012), juga meningkat. Temuan ini

menunjukkan dominasi imunitas Th2 pada lesi SD. Meskipun faktor-faktor ini tidak secara

langsung terkait dengan munculnya gatal, namun secara signifikan berkorelasi dengan jumlah sel

CD68 (+) / IL-31 (+).

11
Menariknya, jumlah sel IL-17 (+) meningkat pada lesi SD, menunjukkan imunitas Th17

juga dominan pada SD. Jumlah sel IL-17 (+) tidak berhubungan langsung dengan keberadaan

gatal, tetapi berkorelasi signifikan dengan jumlah sel CD68 (+) / IL-31 (+). IL-17 dilaporkan

mempromosikan kemiringan makrofag M2 (Nakai dkk. 2017), dan makrofag M2 dapat mendorong

ekspansi sel Th17 (Haribhai dkk. 2016; Mao dkk. 2016). Dengan demikian, kekebalan Th17

kemungkinan terkait dengan kemiringan makrofag M2.

Jumlah sel SP (+) dan jumlah deposisi dermal hemosiderin tidak berhubungan langsung

dengan gatal, tetapi secara signifikan berkorelasi dengan jumlah makrofag CD68 (+) / IL-31 (+).

Mekanisme overekspresi SP dan periostin di SD tidak jelas. SP diekspresikan oleh serabut saraf

perifer dan berbagai jenis sel termasuk makrofag (Marriott dan Bost 2000) dan sel T (Lai et al.

1998). Sel-sel ini banyak terdapat pada lesi SD dan dapat menjadi sumber SP.

Untuk mengkonfirmasi kemampuan makrofag untuk menghasilkan IL-31, kami melakukan ex vivo

studi stimulasidengan murine pM. Kami sebelumnya menunjukkan bahwa sitokin Th2 kanonik IL-

4 dan IL-13 tidak merangsang pM untuk mengeluarkan IL-31 dalam jumlah yang signifikan.

Sebaliknya, periostin mempromosikan kemiringan M2 dan menginduksi pembentukan IL-31 dari

pM (Hashimoto et al. 2019b). Penelitian saat ini menunjukkan IL-31 ekspresi mRNAmeningkat

secara dramatis sebagai respons terhadap kombinasi periostin, SP, ditambah sel darah merah lisat.

Sebaliknya, lisat SP atau RBC saja tidak meningkatkan ekspresi. Sebagai catatan, makrofag
 penghasil IL-31 mengekspresikan arginase-1, yang menunjukkan bahwa mereka adalah makrofag

M2. Makrofag manusia dan tikus mengekspresikan reseptor SP NK1R, reseptor hemosiderin

CD163, dan reseptor periostin integrin αV (Hashimoto et al. 2019b; Siebenhaar et al.2007). Secara

kolektif, SP, hemosiderin, dan periostin pada lesi SD pada dasarnya dapat terlibat dalam

pembentukan IL-31 dari makrofag M2. SP / NK1R jalur juga dapat

12
terlibat dalam generasi IL-31 oleh populasi lain sel seperti eosinofil (Hashimoto et al. 2019a).

Kami juga menyelidiki mediator gatal lainnya dan kepadatan IENF di SD. Kepadatan

IENF yang menurun dilaporkan terlibat dalam gatal kronis pada banyak penyakit kulit

sepertiDA, psoriasis, dan prurigo nodularis (Schuhknecht et al. 2011; Tan et al. 2019).

Kepadatan IENF juga berkurang pada lesi SD. Tidak ada perubahan signifikan yang diamati

pada jumlah sel mast dan ekspresi PAR-2, TRPA1, dan TRPV1 antara SD dan kontrol yang

sehat. Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa faktor-faktor ini tidak berkontribusi secara

signifikan terhadap rasa gatal pada SD.

IL-31 secara langsung merangsang serabut saraf perifer melalui IL-31RA dan OSMRβ (Cevikbas

et al. 2014). Selain itu, IL-31 menstimulasi sel pengekspres IL-31RA, termasuk makrofag, basofil,

dan keratinosit, untuk meningkatkan inflamasi (Nakashima et al. 2018). Studi kami menunjukkan

ekspresi berlebih dari IL-31RA, tetapi tidak menunjukkan OSMRβ, baik di epidermis dan dermis.

Menargetkan IL-31 itu sendiri atau IL-31RA mungkin bermanfaat dalam mengobati gatal pada SD.

Makrofag juga bisa menjadi target terapi potensial, selain SP dan NK1R, periostin, dan

hemosiderin. Namun, target ini membutuhkan pertimbangan lebih lanjut. Di lokasi luka, makrofag

M2 berkontribusi pada penyembuhan luka melalui promosi fibrosis dan angiogenesis (Kim dan

Nair 2019; Snyder et al. 2016). SD sering disertai luka dan ulkus vena kronis (Sundaresan et al.

2017). Penghambatan M2-skewing dapat menyebabkan penyembuhan luka tertunda. Poin ini harus

diperiksa dalam studi selanjutnya.

Batasan utama dari penelitian ini adalah kurangnya skor skala penilaian numerik pasien

untuk gatal dan kami tidak dapat menghitung korelasi antara ekspresi protein dan tingkat
keparahan gatal. Namun, penelitian ini memberikan wawasan tentang mekanisme patofisiologis

gatal pada SD. IL-31 dan IL-31RA dapat menjadi target terapi yang berguna untuk gatal pada

SD.

13
BAHAN DAN METODE

Sampel

Spesimen biopsi lesi kulit dan data klinis diperoleh dari 20 pasien SD (usia, 42-93 tahun; 5

pria dan 15 wanita) dan dari 6 subjek kontrol sehat yang tidak gatal (usia, 25-62; 4 pria dan 2

wanita). ) di Rumah Sakit Universitas Kedokteran dan Gigi Tokyo dan Rumah Sakit Universitas

Miami. Diagnosis mereka dikonfirmasi berdasarkan temuan klinis dan histologis. Penelitian ini telah

disetujui oleh komite etik dari Tokyo Medical and Dental University (# M2018-033; persetujuan

tertulis tidak diperlukan karena spesimen tidak teridentifikasi) dan University of Miami (tidak ada

nomor IRB; persetujuan tertulis yang diinformasikan tidak diperlukan sebagai jaringan dikumpulkan

dari repositori yang tidak teridentifikasi dan dianggap sebagai penelitian non-manusia). Berdasarkan

adanya gatal-gatal menurut keterangan medisnya, subjek dibagi menjadi dua kelompok yaitu dengan

rasa gatal yang parah (n = 9; umur, 44-93; 3 laki-laki dan 6 perempuan) dan tanpa rasa gatal yang

parah (n = 11; umur, 42-85; 2 laki-laki dan 9 perempuan). Gatal parah didefinisikan sebagai skala 4

dalam skala Likert dari nol (tidak gatal) hingga 4 (paling buruk), dan tanpa gatal parah didefinisikan

sebagai skala nol hingga 3. Semua pasien tidak memiliki gangguan kulit pruritik lainnya.

Tikus

Tikus C57BL / 6 betina berumur tujuh minggu diperoleh dari Sankyo Lab Service

(Tokyo, Jepang). Tikus dipelihara dalam kondisi bebas patogen spesifik di fasilitas hewan kami.

Semua hewan percobaan telah disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan

Institusional dari Universitas Kedokteran dan Gigi Tokyo (Protokol A2018-299A, A2018-199A,

A2018-298A, dan A2018-237A) dan dilakukan di Universitas Kedokteran dan Gigi Tokyo.
 14
Antibodi

Abs yang digunakan dalam penelitian ini tercantum dalam Bahan Pelengkap.

Imunofluoresensi dan pewarnaan besi

Sampel yang tertanam parafin dengan formalin (5-µm) dihilangkan dan diberi perlakuan awal

dengan larutan pengambilan target DAKO (Dako, Glostrup, Denmark) pada suhu 60ºC semalam.

Slide kemudian diolah dengan larutan buffer fosfat dengan 5% serum keledai normal dan 0,2%

Triton X-100 selama 2 jam pada suhu kamar. Selanjutnya, bagian diinkubasi dengan Abs primer

pada suhu 4ºC semalam diikuti oleh reaksi dengan Abs sekunder terkonjugasi Alexa Fluor 488

atau 594 (Molecular Probes, Eugene, OR). Kemudian, sampel dipasang dengan Vectashield

dengan DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Untuk deteksi hemosiderin, pewarnaan

biru Prusia digunakan.

Hitungan

Fotomikrograf ditangkap dengan mikroskop CTR6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Jerman)

pada perbesaran 20X dan tiga gambar dari masing-masing subjek dianalisis. Untuk deteksi

periostin, seluruh gambar pemindaian dianalisis. Ekspresi epidermal dan deposisi periostin dermal

diukur sebagai intensitas fluoresensi dalam unit sewenang-wenang (AU) yang dinormalisasi

berdasarkan area dan latar belakang fluoresensi menggunakan perangkat lunak Image J (NIH,

Bethesda, MD). Deposisi dermal hemosiderin dihitung dengan membagi area reaktif-noda biru

Prusia dengan area dermal di setiap fotomikrograf. Jumlah sel infiltrasi dermal dihitung secara

manual. Kepadatan IENF dihitung dengan membagi jumlah penanda spesifik neuron β-tubulin III

(+)

15
saraf yang melintasi persimpangan dermo-epidermal dengan panjang epidermis (Sanders et

al. 2019).
Persiapan makrofag peritoneal murine

Sel-sel peritoneal dikumpulkan dari C57BL / 6N tikus, unggulan pada konsentrasi 5 ×

105/ baik di piring di medium RPMI-1640 lengkap ditambah dengan 10% FBS dan 100 IU / mL

penisilin-streptomisin, dan diinkubasi selama 2 jam pada 37 ° C dan 5% CO 2. Kemudian sel-sel

yang tidak melekat dicuci dan sel-sel yang melekat yang tersisa (> 80% makrofag) diinkubasi

dengan atau tanpa substansi P (1 µM; Institut Peptida, Osaka, Jepang), periostin rekombinan (20

ng / mL; eBioscience, San Diego, CA), dan / atau RBC lysates (5% volume total volume medium).

Setelah 24 jam, sel-sel menjadi sasaran ekstraksi RNA total atau analisis aliran sitometri. Lisat sel

darah merah dibuat sebagai berikut: darah lengkap tikus diambil dan disentrifugasi, dan serum

dikeluarkan. Kemudian darah dibekukan dan dicairkan dua kali.

PCR waktu nyata

RNA seluler total diekstraksi dari sel menggunakan ISOGEN II (Nippon Gene Co., Tokyo,

Jepang), ditranskripsikan terbalik dengan SuperScript ™ IV VILO ™ Master Mix (Thermo Fisher

Scientific), dan kemudian RT-PCR kuantitatif dilakukan secara real-time pemantauan peningkatan

fluoresensi pewarna SYBR Green (Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix; Agilent Technologies

Japan, Ltd., Tokyo, Japan) menggunakan AriaMx Real-Time PCR System (Agilent Technologies).

Primer yang digunakan untuk PCR adalah 5′-TCGGTCATCATAGCACATCTGGAG-3′ dan 5′-

GCACAGTCCCTTTTGGAGTTAAGTC-3′ untuk tikus IL-31; dan

5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′ dan 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′ untuk mouse

16
GAPDH. Tingkat ekspresi mRNA dihitung dengan metodekomparatif ∆∆CTrelatif terhadap

GAPDH.

Analisis aliran sitometri

Suspensi sel tunggal dari pM yang dikultur diperoleh dengan menggunakan pengerik sel setelah

fiksasi. Mereka diberi perlakuan awal dengan anti-CD16 / 32 Ab (BioLegend, San Diego, CA) dan
 diberi label dengan MOMA-2 PE terkonjugasi Ab (BioRad, Hercules, CA), anti-ariginase-1 Ab

(Abcam plc, Cambridge, UK: ab92274 ), dan anti-IL-31 Ab (abcam: ab102750) diikuti oleh reaksi

dengan Alexa Fluor 647 anti-kambing IgG- dan Alexa Fluor 488 anti-kelinci IgG- Abs sekunder

(masing-masing Abcam plc, ab150131 dan ab150061) menggunakan Intracellular Fix & Perm set

(eBioscience). Kemudian mereka dianalisis dengan FACSCalibur cell analyzer (BD Biosciences,

San Jose, CA).

Analisis statistik

Semua data dilaporkan sebagai mean + SD. Untuk membandingkan perbedaan antara dua

kelompok, uji-t dua sisi dan tidak berpasangan digunakan. Untuk mendeteksi korelasi, kami

menghitung koefisien korelasi peringkat Spearman (r) menggunakan perangkat lunak statistik

"EZR" (Kanda 2013). Signifikansi statistik ditetapkan pada P <0,05.

17
Pernyataan Ketersediaan Data: Kumpulan data yang terkait dengan artikel ini dapat

ditemukan di http://dx.doi.org/10.17632/bmmkj2psfz.1, repositori data online sumber

terbuka yang dihosting di Mendeley Data.

COI: Dr. Yosipovitch adalah Anggota Dewan Ilmiah Menlo, Trevi, Sienna, Sanofi, Regeneron,

Galderma, Pfizer, Novartis, Bayer, Kiniksa, Eli Lilly, dan Ortho. Dukungan penelitian oleh Pfizer,

Sun Pharma, Leo, Menlo, Kiniksa. Penulis lain tidak memiliki konflik kepentingan.
Ucapan Terima Kasih: Penulis berterima kasih kepada Ibu Chiyako Miyagishi di Universitas

Kedokteran dan Gigi Tokyo atas bantuan teknisnya. Pekerjaan ini didukung oleh Japan Society for

the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Young Scientists (B) (# 17K16328)

dan oleh hibah persekutuan tak terbatas dari Menlo Therapeutics.

Pernyataan CRediT (kontribusi penulis):

Konseptualisasi: TH, GY. Kurasi data: TH. Analisis formal: TH. Akuisisi pendanaan: TH, HY,

GY. Investigasi, TH, CK, RF, SN, SS. Metodologi: TH, LN. Administrasi proyek: TH, LN, HY,

GY. Sumber: TH, LN, HY, GY. Pengawasan: LN, HY, GY. Validasi: TH, GY. Visualisasi: TH,

GY. Penulisan (draf): TH, Penulisan (review dan editing): TH, CK, RF, SN, SS, LN, HY, GY.

Semua penulis telah membaca naskah dan menyetujui pengiriman ini.

18
DAFTAR PUSTAKA

Azimi E, Reddy VB, Pereira PJS, Talbot S, Woolf CJ, Lerner EA. Zat P mengaktifkan
reseptor berpasangan protein G terkait Mas untuk menyebabkan gatal. J. Alergi
Clin. Immunol. 2017; 140 (2): 447-453.e3
Caggiati A, Rosi C, Casini A, Cirenza M, Petrozza V, Acconcia MC, dkk. Penumpukan zat besi
pada kulit menjadi ciri lipodermatosklerosis dan ulkus tungkai. Eur. J. Vasc. Endovasc.
Surg. 2010; 40 (6): 777–82
Cevikbas F, Wang X, Akiyama T, Kempkes C, Savinko T, Antal A, dkk. Reseptor IL-31 yang
diekspresikan oleh neuron sensorik memediasi gatal yang bergantung pada sel T helper:
Keterlibatan TRPV1 dan TRPA1. J. Alergi Clin. Immunol. 2014; 133 (2): 448–60
Dillon SR, Sprecher C, Hammond A, Bilsborough J, Rosenfeld-Franklin M, Presnell SR, dkk.
Interleukin 31, sitokin yang diproduksi oleh sel T teraktivasi, menyebabkan dermatitis
pada tikus. Nat. Immunol. 2004; 5 (7): 752–60
Furudate S, Fujimura T, Kakizaki A, Kambayashi Y, Asano M, Watabe A, dkk. Interaksi yang
mungkin antara periostin yang diekspresikan oleh stroma kanker dan makrofag terkait tumor
 dalam mengembangkan mikosis fungoides. Exp. Dermatol. 2016; 25 (2): 107–12
Furue M, Yamamura K, Kido-Nakahara M, Nakahara T, Fukui Y. Peran yang muncul
dari reseptor interleukin-31 dan interleukin-31 pada pruritus pada dermatitis atopik.
Alergi. 2018; 73 (1): 29–36
Han H, Headley MB, Xu W, Comeau MR, Zhou B, Ziegler SF. Limfopoietin Stroma Timik
Memperkuat Diferensiasi Makrofag Alternatif Yang Diaktifkan. J. Immunol. 2013; 190 (3):
904–12
Haribhai D, Ziegelbauer J, Jia S, Upchurch K, Yan K, Schmitt EG, dkk. Alternatif Makrofag yang
Diaktifkan Meningkatkan Respons Sel T dan Th17 Regulatori Terinduksi selama
Imunoterapi untuk Kolitis. J. Immunol. 2016; 196 (8): 3305–305
Hashimoto T, Kursewicz CD, Fayne RA, Nanda S, Shah SM, Nattkemper L, dkk. Mekanisme
patofisiologis gatal pada pemfigoid bulosa. Selai. Acad. Dermatol. 2019a;: sedang
dicetak; doi: 10.1016 / j.jaad.2019.07.060.
Hashimoto T, Satoh T. Perspektif Imunologis: Sel Th2 / Sel Mast / Basofil / Eosinofil. Evol. Dermat
Atopik. abad ke 21. Peloncat; 2018. hal. 69–82
Hashimoto T, Satoh T, Yokozeki H. Pruritus pada kudis biasa: IL-31 dari makrofag yang
diinduksi oleh overekspresi TSLP dan periostin. Alergi. 2019b;: sedang dicetak; doi:
10.1111 / all.13870.

19
Kabashima K, Furue M, Hanifin JM, Pulka G, Wollenberg A, Galus R, dkk. Nemolizumab
pada pasien dengan dermatitis atopik sedang hingga berat: Acak, fase II, studi ekstensi
jangka panjang. J. Alergi Clin. Immunol. 2018;142(4):1121-1130.e7
Kanda Y. Investigation of the freely available easy-to-use software “EZR” for medical statistics.
Bone Marrow Transplant. 2013;48(3):452–8
Kato A, Fujii E, Watanabe T, Takashima Y, Matsushita H, Furuhashi T, et al. Distribution of
IL-31 and its receptor expressing cells in skin of atopic dermatitis. J. Dermatol. Sci.
2014;74(3):229–35
Kim SY, Nair MG. Macrophages in wound healing: activation and plasticity. Immunol. Cell Biol.
2019;97(3):258–67
Kittaka H, Tominaga M. The molecular and cellular mechanisms of itch and the involvement of
TRP channels in the peripheral sensory nervous system and skin. Allergol. Int.
2017;66(1):22–30
Kunsleben N, Rüdrich U, Gehring M, Novak N, Kapp A, Raap U. IL-31 Induces Chemotaxis,
Calcium Mobilization, Release of Reactive Oxygen Species, and CCL26 in Eosinophils,
Which Are Capable to Release IL-31. J. Invest. Dermatol. 2015;135(7):1908–11
Lai JP, Douglas SD, Ho WZ. Human lymphocytes express substance P and its receptor. J.
Neuroimmunol. 1998;86(1):80–6
Leal EC, Carvalho E, Tellechea A, Kafanas A, Tecilazich F, Kearney C, et al. Substance P
promotes wound healing in diabetes by modulating inflammation and macrophage
 phenotype. Saya. J. Pathol. American Society for Investigative Pathology;
2015;185(6):1638–48
Lim JE, Chung E, Son Y. A neuropeptide, Substance-P, directly induces tissue-repairing M2 like
macrophages by activating the PI3K/Akt/mTOR pathway even in the presence of IFN. Sci.
Rep. 2017;7(1):9417
Mao H, Pan F, Guo H, Bu F, Xin T, Chen S, et al. Feedback mechanisms between M2
macrophages and Th17 cells in colorectal cancer patients. Tumor Biol. 2016;37(9):12223–
30
Marquardt Y, Cornelissen C, Bickers DR, Lüscher-Firzlaff J, Baron JM, Lüscher B, et al.
Ultraviolet B radiation and reactive oxygen species modulate interleukin-31 expression in T
lymphocytes, monocytes and dendritic cells. Br. J. Dermatol. 2011;165(5):966–75
Marriott I, Bost KL. IL-4 and IFN- Up-Regulate Substance P Receptor Expression in Murine
Peritoneal Macrophages. J. Immunol. 2000;165(1):182–91
Masuoka M, Shiraishi H, Ohta S, Suzuki S, Arima K, Aoki S, et al. Periostin promotes chronic
allergic inflammation in response to Th2 cytokines. J. Clin. Menginvestasikan.
2012;122(7):2590–600

20
Nakai K, He YY, Nishiyama F, Naruse F, Haba R, Kushida Y, et al. IL-17A induces
heterogeneous macrophages, and it does not alter the effects of lipopolysaccharides on
macrophage activation in the skin of mice. Sci. Rep. 2017;7(1):12473
Nakashima C, Otsuka A, Kabashima K. Interleukin-31 and interleukin-31 receptor: New
therapeutic targets for atopic dermatitis. Exp. Dermatol. 2018;27(4):327–31 Nattkemper LA,
Martinez-Escala ME, Gelman AB, Singer EM, Rook AH, Guitart J, et al. Cutaneous T-cell
Lymphoma and Pruritus: The Expression of IL-31 and its Receptors in the Skin. Acta Derm.
Venereol. 2016;96(7):894–8
Nattkemper LA, Tey HL, Valdes-Rodriguez R, Lee H, Mollanazar NK, Albornoz C, et al. The
Genetics of Chronic Itch: Gene Expression in the Skin of Patients with Atopic Dermatitis
and Psoriasis with Severe Itch. J. Invest. Dermatol. 2018;138(6):1311–7
Niyonsaba F, Ushio H, Hara M, Yokoi H, Tominaga M, Takamori K, et al. Antimicrobial
Peptides Human -Defensins and Cathelicidin LL-37 Induce the Secretion of a Pruritogenic
Cytokine IL-31 by Human Mast Cells. J. Immunol. 2010;184(7):3526–34
Patra V, Strobl J, Gruber‐Wackernagel A, Vieyra‐Garcia P, Stary G, Wolf P. CD 11b+ cells
markedly express the itch cytokine interleukin 31 in polymorphic light eruption. Br. J.
Dermatol. 2019;in press: doi: 10.1111/bjd.18092.
Pereira MP, Mühl S, Pogatzki-Zahn EM, Agelopoulos K, Ständer S. Intraepidermal Nerve Fiber
Density: Diagnostic and Therapeutic Relevance in the Management of Chronic Pruritus: a
Review. Dermatol. Ada. (Heidelb). 2016;6(4):509–17
Raap U, Gehring M, Kleiner S, Rüdrich U, Eiz-Vesper B, Haas H, et al. Human basophils are a
source of - and are differentially activated by - IL-31. Clin. Exp. Alergi. 2017;47(4):499–
508
Rubio-Navarro A, Amaro Villalobos JM, Lindholt JS, Buendía I, Egido J, Blanco-Colio LM, et al.
Hemoglobin induces monocyte recruitment and CD163-macrophage polarization in
abdominal aortic aneurysm. Int. J. Cardiol. 2015;201:66–78
Saharay M, Shields DA, Porter JB, Scurr JH, Coleridge Smith PD. Leukocyte activity in the
microcirculation of the leg in patients with chronic venous disease. J. Vasc. Surg.
1997;26(2):265–73
Sanders KM, Nattkemper LA, Rosen JD, Andersen HH, Hsiang J, Romanelli P, et al. Non-
Histaminergic Itch Mediators Elevated in the Skin of a Porcine Model of Scabies and of
Human Scabies Patients. J. Invest. Dermatol. 2019;139(4):971–3
Schuhknecht B, Marziniak M, Wissel A, Phan NQ, Pappai D, Dangelmaier J, et al. Reduced
intraepidermal nerve fibre density in lesional and nonlesional prurigo nodularis skin as a
potential sign of subclinical cutaneous neuropathy. Br. J. Dermatol. 2011;165(1):85–91

21
Siebenhaar F, Sharov AA, Peters EMJ, Sharova TY, Syska W, Mardaryev AN, et al. Substance P
as an Immunomodulatory Neuropeptide in a Mouse Model for Autoimmune Hair Loss
(Alopecia Areata). J. Invest. Dermatol. 2007;127(6):1489–97
Snyder RJ, Lantis J, Kirsner RS, Shah V, Molyneaux M, Carter MJ. Macrophages: A review of
their role in wound healing and their therapeutic use. Wound Repair Regen.
2016;24(4):613–29
Sonkoly E, Muller A, Lauerma AI, Pivarcsi A, Soto H, Kemeny L, et al. IL-31: A new link
between T cells and pruritus in atopic skin inflammation. J. Allergy Clin. Immunol.
2006;117(2):411–7
Ständer S, Yosipovitch G. Substance P and neurokinin 1 receptor are new targets for the
treatment of chronic pruritus. Br. J. Dermatol. 2019;in press; doi: 10.1111/bjd.18025. Steinhoff
M, Buddenkotte J, Lerner EA. Role of mast cells and basophils in pruritus. Immunol. Rev.
2018;282(1):248–64
Steinhoff M, Neisius U, Ikoma A, Fartasch M, Heyer G, Skov PS, et al. Proteinase-activated
receptor-2 mediates itch: a novel pathway for pruritus in human skin. J. Neurosci.
2003;23(15):6176–80
Sundaresan S, Migden MR, Silapunt S. Stasis Dermatitis: Pathophysiology, Evaluation, and
Management. Saya. J. Clin. Dermatol. 2017;18(3):383–90
Tan Y, Ng WJ, Lee SZX, Lee BTK, Nattkemper LA, Yosipovitch G, et al. 3-Dimensional
Optical Clearing and Imaging of Pruritic Atopic Dermatitis and Psoriasis Skin Reveals
Downregulation of Epidermal Innervation. J. Invest. Dermatol. 2019;
Thomas PR, Nash GB, Dormandy JA. White cell accumulation in dependent legs of patients with
venous hypertension: a possible mechanism for trophic changes in the skin. Br. Med. J. (Clin.
Res. Ed). 1988;296(6638):1693–5
Valdes-Rodriguez R, Mollanazar NK, González-Muro J, Nattkemper L, Torres-Alvarez B,
López-Esqueda FJ, et al. Itch prevalence and characteristics in a Hispanic Geriatric
population: A comprehensive study using a standardized itch questionnaire. Acta Derm.
 Venereol. 2015;95(4):417–21
Wang N, Liang H, Zen K. Molecular mechanisms that influence the macrophage m1-m2
polarization balance. Depan. Immunol. 2014;5:614
Wenk J, Foitzik A, Achterberg V, Sabiwalsky A, Dissemond J, Meewes C, et al. Selective pick-up
of increased iron by deferoxamine-coupled cellulose abrogates the iron-driven induction of
matrix-degrading metalloproteinase 1 and lipid peroxidation in human dermal fibroblasts in vitro:
a new dressing concept. J. Invest. Dermatol. 2001;116(6):833–9

22
Yalçin B, Tamer E, Toy GG, Öztaş P, Hayran M, Alli N. The prevalence of skin diseases in the
elderly: Analysis of 4099 geriatric patients. Int. J. Dermatol. 2006;45(6):672–6 Yosipovitch G,
Rosen JD, Hashimoto T. Itch: From mechanism to (novel) therapeutic approaches. J. Allergy Clin.
Immunol. 2018;142(5):1375–90
 23
FIGURE LEGENDS

Figure 1. CD68(+) macrophages express IL-31 and correlate with itch in stasis dermatitis.

Representative images of stasis dermatitis (SD) lesions and healthy skin with quantification of

staining. (a) Epidermal expression of IL-31 was not enhanced in SD lesions. The number of IL-

31(+) cells and CD68(+) macrophages was increased in SD lesions. (b) The majority of IL-31(+)

cells expressed CD68. The number of CD68(+)/IL-31(+) cells was increased in SD lesions and

correlated with itch. (c) In stasis dermatitis with severe itch, CD68(+) macrophages expressed an

M2 macrophage marker CD163. The number of CD68(+)/CD163(+) cells was increased in SD

lesions and correlated with itch. Scale bar = 100 µm. * = P < 0.05, unpaired t-test. NS = not

significant. AU = arbitrary unit. Dotted lines indicate the dermo-epidermal junction. Vertical bars

indicate SD.

Figure 2. Expression of IL-31 receptor complex components, IL-31RA and OSMRβ

Representative images of stasis dermatitis (SD) lesions and healthy skin with quantification of

staining. Both epidermal and dermal expression of IL-31RA was enhanced in SD lesions, but did

not correlate with itch. Expression of OSMRβ in the epidermis and dermis was not increased in

SD lesions and did not correlate with itch. Scale bar = 100 µm. * = P < 0.05, unpaired t-test. NS =

not significant. AU = arbitrary unit. Dotted lines indicate the dermo-epidermal junction. Vertical

bars indicate SD.

Figure 3. Infiltration of immune cells in stasis dermatitis.

Representative images of stasis dermatitis (SD) lesions and healthy skin with quantification of

staining. The number of CXC chemokine receptor type 3 (CXCR3)(+) cells was not increased

24
in SD lesions and did not correlate with the number of CD68(+)/IL-31(+) cells. In contrast, the

number of CC chemokine receptor type 4 (CCR4) (+) cells and IL-17(+) cells was increased in
SD lesions and correlated with the number of CD68(+)/IL-31(+) cells. The number of dermal

basophils, but not dermal eosinophils, was increased in SD lesions and correlated with the

number of CD68(+)/IL-31(+) cells. Scale bar = 100 µm. * = P < 0.05, unpaired t-test. NS = not

significant. r = Spearman's rank correlation coefficient. Vertical bars indicate SD.

Figure 4. Periostin, hemosiderin, and substance P, but not TSLP, are correlated with the

presence of IL-31(+) macrophages

Representative images of stasis dermatitis (SD) lesion and healthy skin with quantification of

staining. Epidermal expression of TSLP was not enhanced in SD lesions and did not correlate with

the number of CD68(+)/IL-31(+) cells. Dermal deposition of both periostin and hemosiderin, as well

as the number of substance P(+) cells was increased in SD lesions and correlated with CD68(+)/IL-

31(+) cells. All aforementioned factors were not significantly higher in SD with severe itch

compared to SD without severe itch. Scale bar = 100 µm for TSLP and substance P, = 1 mm for

Periostin, and = 200 µm for hemosiderin. * = P < 0.05, unpaired t-test. NS = not significant. AU =

arbitrary unit. Dotted lines indicate the dermo-epidermal junction. Vertical bars indicate SD.

Figure 5. CD68(+) macrophages express neurokinin-1 receptor

Representative images of stasis dermatitis (SD) lesions and healthy skin with quantification of

staining. (a) Both epidermal expression of neurokinin-1 receptor (NK-1R) and the number of

dermal NK-1R(+) cells were increased in SD lesions but did not correlate with severe itch. (b)

25
CD68(+) cells expressed NK-1R. Scale bar = 100 µm. * = P < 0.05, unpaired t-test. NS = not

significant. AU = arbitrary unit. Dotted lines indicate the dermo-epidermal junction. Vertical bars

indicate SD.

Figure 6. Murine peritoneal macrophages generate IL-31 in response to a combination of

substance P, periostin, and RBC lysate ex vivo

Murine peritoneal macrophages were stimulated with substance P, periostin, and/or RBC lysate ex

vivo for 24 hours. (a) IL-31 mRNA expression was significantly increased in response to periostin,

substance P plus periostin, and a combination of substance P + periostin + RBC lysate. (b, c) Flow

cytometric analysis of intracellular IL-31 and arginase-1 in MOMA-2 gated murine peritoneal

macrophages without stimulation (medium-treated, non-stimulated macrophages) or in response to

substance P plus periostin plus RBC lysate (stimulated macrophages). Representative results of at

least two independent experiments are shown. Values represent mean + SD. * = P < 0.05, unpaired

t-test, compared to medium-treated, non-stimulated macrophages. MFI = mean fluorescence

intensity. Arg-1 = arginase-1.

26
SUPPLEMENTARY MATERIAL

SUPPLEMENTARY MATERIALS AND METHODS

Antibodies

Antibodies (Abs) obtained from Abcam plc (Cambridge, UK) included: Anti-mast
cell tryptase (AAI; ab2378), IL-31 (ab102750), IL-31RA (ab113498), CXC chemokine

receptor type 3 (ab64714), CC chemokine receptor type 4 (ab1669), IL-17 (ab79056), CD68

(KP1; ab955), CD163 (ab182422), basophil (2D7; ab155577), Substance P (ab106291),

thymic stromal lymphopoietin (ab188766), periostin (ab14041), transient receptor potential

vanilloid 1 (ab3487), transient receptor potential ankyrin 1 (ab62053), and arginase-1

(ab92274) Abs. Anti-neurokinin 1 receptor (PA3-301), protease activated receptor 2 (sc-

5597), β-tubulin III (Tuj1; Mo15013), major basic protein (MBP) (NBP1-42140-1ml),

oncostatin M receptor β (LS-B11477) Abs were obtained from ThermoFisher Scientifics

(Waltham, MA), Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX), Neuromics (Edina, MN), Novus

biologicals (Centennial, CO), and LifeSpan BioSciences (Seattle, WA), respectively. R-

Phycoerythrin-conjugated anti-MOMA-2 Ab (MCA519PE) was purchased from Bio Rad

Laboratories (Hercules, CA). Alexa Fluor 647 anti-goat IgG- (ab150131) and Alexa Fluor

488 anti-rabbit IgG- (ab150061) secondary Abs were obtained from Abcam plc.

1
2
Supplemental Figure S1. Epidermal nerve fibers, mast cells, PAR-2, and TRPA1 in

lesional skin of stasis dermatitis.

Representative images of stasis dermatitis (SD) lesions and healthy skin with quantification

of staining. Intraepidermal nerve fiber (IENF) density was reduced in SD lesions but did not

correlate with itch. The number of dermal mast cells was not increased and did not correlate

with itch in SD lesions. Epidermal expression of PAR-2, TRPA1, and TRPV1 was not

enhanced in SD lesions. Scale bar = 100 µm. Dotted lines indicate the dermo-epidermal

junction. * = P < 0.05, unpaired t-test. Vertical bars indicate SD. NS = not significant. AU =

arbitrary unit. PAR-2 = protease-activated receptor-2. TRPA1 = transient receptor potential

ankyrin-1. TRPV1 = transient receptor potential vanilloid-1.

Supplemental Figure S2. IL-31 mRNA expression of murine peritoneal macrophages

in response to substance P

Representative results of two independent experiments are shown. Values represent mean +

SD of three samples. NS = not significant, unpaired t-test, compared to non-treated

macrophages.