RESUME KULIAH TAMU

Bacteriology and Virology Molecular

OLEH:

Mela Septiani (061911535030)

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS AIRLANGGA
DESEMBER 2020
 PENDAHULUAN

Metode ideal untuk mendiagnosa suau bakteri harus spesifik, mudah serta
efisien dalam alat, bahan dan harga. Ada dua metode identifikasi yaitu metode
konvensional dan modern. Metode kovensional sediri memiliki kelemahan dimana
bakteri seperti mycobacyerium, legionella pneumophilia dan kadar infeksi tinggi
seperti brucella sulit dideteksi. Untuk itu bisa dilakukan diagnose dan identifikasi
bakteri dengan metode modern atau molecular diagnosis.

Virus merupakan mikroorganisme yang bersifat pathogen. Virus hanya dapat

berkembang bila dalam tubuh sel hidup. Menggunakan sel inang, virus menghasilkan
salinan dari genomnya dan menghasilkan virus baru. Virus menjadi vektor penting
dalam terapi gen dan vaksinasi. Diagnosanya dapat dilakukan dalam berbagai cara,
diantarnya diagnose molekuler dan diagnose berbasis serologis.

Vaksin merupakan virus yang dilemahkan. Macam- macam vaksin

diantaranya, vaksin aktif dan inaktif, vaksin subunit, DNA dan rekombinan. Tujuan
dari pembentukan vaksin yaitu sebagai mencegah infeksi, mencegah penyakit dan
mencegah virus shedding. Dalam kedokteran hewan penggunakan vaksin bisa untuk
mencegah penyakit viral unggas diantarnya, Avian Influenza, Infectious Bronchitis
dan Marek desease.
 ISI

1.1 Materi I

Bacteriology Molecular

Prof. Dr. Zunita Zakaria

Metode ideal untuk mendiagnosa harus sentitif dan spesifik, Rapid, mudah
dilakukan, bahan dan alat tersedia serta biaya murah. Metode konvensional
identifikasi bakteri dengan Biakan atau mengambil langsung dari sumber bakteri
dengan cara (terdapat Specimen, Biakkan ke media yang sesuai dan Lakukan test
biokimia untuk mengidentifikasi bakteri). Media selektif dan differensial ada dua
jenis yaitu Tradisional (Macconkey agar, BGA, XLD, MSA) dan terbaru
(chromogenic media).

Dari pada menggunakan test biokimia mungkin bisa menggunakan

identitification media dimana terdapat tempat untuk menginkubasi bakteri dan banyak
lagi caranya. Isolasi dan identifikasi resistensi metisilin di staphylococcus aureus
selama 6 hari. Automated id systems seperti VITEX, PHOENIX, Microsan
Walkaway, penganalisis harus berasal dari kultur murni.

Laboratium diagnosis pathogen veteriner telah memiliki metode untuk

mendeteksi patogenitas antibody. Pada Molecular diagnosis ada beberapa yang sulit
untuk dideteksi dengan metode konvensional seperti mycobacyerium, legionella
pneumophilia, kadar infeksi tinggi seperti brucella. Bakteri merupakan hewan
prokariotik, tidak punya nucleus, jika DNA di lepas dan dikuakkan akan terdapat
ribuan kromosom, terdapat 2 nonkromosom DNA atau 2 plasmid (bisa muncul
dengan berbagai ukuran tapi lebih kecil dari genom).

Metode molecular paling populer, Polymerase Chain reaction, RAPD,

Plasmin profile analysis, Multilocus Sequencing Typing (paling bisa diterima dan
banyak digunakan), pulsed field gel electrophoresis dll. Keuntungannya (Rapid, lebih
pasti, bisa digunakan untuk seluruh organisme pathogen)
1. Polymerase Chain Reaction
Mirip seperti mesin fotokopi, mengkopi ribuan DNA target yang telah
terdeteksi, mengikuti atau mengkopi replikasi DNA secara in vivo,
mereplikasi spesifik partikel DNA yang akan disintesis dari satu kopi DNA.
Dengan 35 siklus mengasilkan 68 juta kopi DNA target.
Yang diperlukan adalah sampel, Template DNA, dNTP, Primer,
Enzim polymerase, Buffer+ MgCl2. Masukkan ke dalam tube, dan mesin
PCR, setelah 35 siklus selesai, kemudian hasil keluar dalam bentuk gel dan
periksa. Tipe PCR diantaranya
 Monoplex PCR bisa untuk mendeteksi salmonella spp. Di dalam
sampel. Gunakan primer spresifik untuk mendeteksi salomonella
yaitu Sal F dan R.
 Multiplex PCR bisa mendekteksi Salmonella enteritidis dan S.
typhimutium di sampel. Menggunakan ST F dan R dengan 500 bp,
SE F dan R dengan 250 bp.
 Di sampel positif, garis akan sesuai denga bp yang telah
digunakan. Apabila positif salmonella enteritidis garis aka nada di
bp 500.

Isolasi dan identitifkasi MRSA

1. Sampel, blood agar

2. Seleksi denga MSA
3. Seleksi dengan ORSAB
4. AST
5. Penginterpretasi
2. Pulsed Field Gel Electrophoresis
Pulsed Field Gel Electrophoresis adalah fragmen yang lebih besar
DNA tidak dipisahkan secara memadai. Pada tahun 1984, dua ilmuwan
bernama Schwartz dan Cantor datang dengan teknik baru: PFGE.
 PFGE digunakan di laboratorium di seluruh dunia. Misalnya: CDC
menggunakan PFGE untuk mempelajari wabah penyakit dan cepat
mendiagnosis sumber umum wabah. DNA mudah dipotong. Di PFGE.
Pertama-tama tanamkan di sumbat agarose lalu rawat sumbatnya dengan
enzim untuk mencerna dinding sel dan protein, sehingga meninggalkan DNA
telanjang tidak rusak saat di agarosa. Busi kemudian dipotong sesuai ukuran,
diperlakukan dengan pembatasan enzim jika perlu, dimasukkan ke dalam
sampel dengan baik, dan disegel pada tempatnya dengan agarosa.
3. Multilocus Sequencing Typing (MLST)

Telah diusulkan di tahun 1988 sebagai nukleotida pendekatan berbasis

urutan yang dapat diterapkan banyak patogen. Sistem pengetikan portabel,
dapat direproduksi, dan dapat diskalakan yang mencerminkan populasi dan
evolusi biologi patogen. metode yang kuat dan efisien dalam mengeksplorasi
evolusi molekuler Mudah dibagikan antar laboratorium melalui internet.

Alur kerja MLST

o Urutan nukleotida dalam beberapa gen housekeeping (400-500 bp)

o 99 skema tersedia: Kebanyakan skema menyertakan 7 gen
housekeeping. Tapi ada 5-10 gen) http://pubmist.org/databases.shtml
o Alel tertentu akan ditetapkan (bilangan bulat)
o Kombinasi alel tertentu dari suatu strain menentukan SEQUENCE
tersebut

Prosedur Laboratoriumnya dengan pembuatan Culture sel, Ekstraksi

DNA, Konfirmasi PCR dari Isolasi 165 Wilayah TRNA, Amplifikasi PCR
MLST di 7housekeeping gen, Elektroforesina gel 1,5% di agarose dengan 1x
Buffer TBE Pemurnian Produk PCR dan Pengurutan DNA. Gen housekeeping
sendiri adalah gen yang dibutuhkan untuk pemeliharaan fungsi seluler dasar,
dan diekspresikan di semua sel organisme.

1.2 Materi II
 Molecular Vitology and I’ts Application

Prof. Datin Paduka Dr. Aini Ideris

A. Molecular Vitology

Molecular vitology adalah studi virus di level molekuler. Virus adalah

vector penting untuk terapi gen dan vaksinasi.

Virus bersifat submikroskopis, obligat parasit intraseluler, yang

bereplikasi di dalam sel inang. Terlalu kecil untuk dilihat mikroskop optic.
Virus terbesar yang diketahui (Mimivirus) dengan diameter 400 nm, bakteri
terkecil (Mikoplasma) = 200 nm.

Virus itu unik. Partikel virus (virion) tidak tumbuh atau membelah.
Virus bersifat aseluler. Virus kekurangan informasi genetik yang
mengkodekan alat yang diperlukan untuk generasi energi metabolik atau
sintesis protein (ribosom), atau metabolic energi, karena itu mereka
mengandalkan inangnya untuk mereplikasi atau berkembang biak.
Menggunakan sel inang, virus menghasilkan salinan dari genomnya dan
menghasilkan virus baru. Proses replikasi virus bervariasi tergantung pada
genom virus. Sel yang terinfeksi virus lebih seperti pabrik daripada Rahim.
Klasifikasi Doble stranded DNA, single stranded DNA, double stranded
RNA, single stranded RNA, Single stranded RNA negative sense, Sigle
standed positive

Dogma sentral biologi molekuler adalah penjelasan tentang aliran

informasi genetik dalam system biologis, yang menyatakan DNA itu berisi
petunjuk pembuatan protein, yang disalin oleh RNA. RNA kemudian
menggunakan instruksi untuk membuat protein.

Teknik konvensional diantaranya gold standard, ektraksi- deteksi

spesifik target. Bisa menggunakan nucleic acid. Polymerase Chain Reaction
(PCR). Metode dalam Biologi Molekuler. PCR menargetkan dan memperkuat
wilayah tertentu dari untai DNA. Juga merupakan teknik invitro untuk
menghasilkan sejumlah besar DNA tertentu. Seringkali, hanya sejumlah kecil
DNA tersedia misalnya setetes darah, strain semen, Rambut tunggal, penyeka
vagina, dll.

Koinfeksi sel oleh strain virus yang berbeda secara genetik dapat
menyebabkan generasi virus rekombinan. Proses ini dapat terjadi pada kedua
virus yang tidak tersegmentasi atau dalam segmen:

a. Virus tersegmentasi.
b. Koinfeksi sel oleh galur a yang berbeda secara genetic membuat
retrovirus menghasilkan generasi 'heterozigot' partikel virus,
setelah itu terjadi peristiwa peralihan template dapat menyebabkan
rekombinasi provirus.
c. Co infeksi sel oleh galur a yang berbeda secara genetic dapat
menghasilkan kombinasi yang berbeda dari reassortant progeny.

Analisis Western blot (juga dikenal sebagai immunoblotting)

digunakan untuk mendeteksi protein tertentu dalam sel, jaringan, organ, atau
cairam tubuh. Tekniknya tergantung pada reaksi suatu antibodi dengan protein
yang dimobilisasi di membrane tipis

Microarray DNA (juga dikenal sebagai umum DNA chip atau biochip)
adalah koleksi dari dna mikroskopik terlampir pada jual permukaan. ilmu
pengetahuan menggunakan dna microarrays untuk mengukur tingkat ekspresi
dari jumlah gen yang besar secara simultan atau ke daerah ginotype dari
sebuah genom

Mengapa penyakit virus sulit dikendalikan ?

1. Agen : Ancaman terhadap berbagai spesies burung,

beberapa agen bersifat zoonosis. Bermutasi secara konstan - strain varian,
lebih ganas, diperpanjang kisaran inang, mutan yang lolos dari vaksin /
obat
 2. Spektrum penyakit : Menyebabkan berbagai macam penyakit -
ringan hingga akut, persistensi, infeksi bersamaan, infeksi laten dan
imunosupresi
3. Pengelolaan : Multi-usia, intensif dengan kepadatan tebar
tinggi. Pengendalian dan tindakan pencegahan Sulit untuk didiagnosis
terutama subklinis dan persisten infeksi.Vaksin yang buruk menyebabkan
kekebalan

Diagnosa Virus

1. Diagnostik molekuler : Penggunaan diagnostik berbasis asam nukleat

memiliki peningkatan secara eksponensial. Reaksi berantai polimerase -
1980-an. Diagnosis molekuler paling tepat untuk pathogen yang sulit
untuk dideteksi & diidentifikasi secara tepat waktu. Metode konvensional
(Mycobacterium, Legionella pneumofilia) dan Sangat menular dan
berbahya (mis. Brucella).
2. Diagnosis berbasis serologi : Untuk mendeteksi antigen atau
antibodi. Kinerja (spesifisitas & sensitivitas), biaya dan penerapan.
ELISA, tes serologi untuk berbagai penyakit. Seperti NonELISA seperti
AGID, HA / HI IFAT, dan uji netralisasi. Penggunaan uji berbasis
antibody monoclonal mampu mendeteksi subtipe tertentu (IB, IBDV,
AIV) dan untuk strategi DIVA (HPAI vs LPAI).
3. Diagnostik berbasis PCR : Memiliki Format berbeda; yaitu PCR
bersarang sangat sensitif, mudah terkontaminasi. Multiplex PCR -
mendeteksi lebih dari 1 target. PCR in situ- pada bagian jaringan (infeksi
laten). Metode deteksi berbeda; gel agarosa konvensional, PCR lebih
efisien; lebih cepat dan sensitive serta mampu mengukur titer virus.

B. Vaksin dan Vaksinasi.

 Vaksin yang ideal: mampu menghasilkan perlindungan kekebalan
yang sama seperti biasanya mengikuti infeksi alami tetapi tanpa menyebabkan
penyakit menghasilkan kekebalan yang tahan lama menghentikan penyebaran
infeksi. Tujuan vaksinasi: mensterilkan kekebalan (mencegah infeksi),
kekebalan penyakit (mencegah penyakit / kematian), memblokir kekebalan
(mencegah virus shedding dan penularan penyakit).

Teknologi vaksin unggas. Vaksin hidup dilemahkan dan dimatikan

dalam berbagai kombinasi: mono-, bi-, tri, & polivalen. Vaksin mati
menggunakan bahan pembantu berbasis minyak atau tawas. Vaksin
rekombinan tersedia secara komersial- pilihan terbatas dan hanya
berdasarkan; Vaksin vektor virus - virus Fowlpox, Herpesvirus (HVT) dan
Adenovirus. Vaksin genetika terbalik - terutama untuk virus RNA seperti AIV
dan NDV.

Diagnostik Influenza. Sampel yang dicurigai (jaringan & swab). Bisa

dilakukan dua cara yang pertama Isolasi virus & identifikasidi lab BSL-2 dan
BSL-3. Kemudian dilakukan pengurutan menggunakan Metode Sanger dan
Teknologi NGS. Cara kedua RT-PCR. Dengan variasi berbasis Teknik PCR
( konvensional untuk tipe A dan subtipe- spesifik, real time PCR untuk tipe A
dan subtipe khusus, Primer untuk tipe A berdasarkan gen NP, Mand Primer
khusus subtipe untukH1, H2, H3, HS, H7, H9, N1, N2 dan N8, Colorimetric
PCR untuk H9N2)

Pengendalian Al yang Sangat Patogen. Strategi 71-75. Strategi

pengendalian yang komprehensif: biosekuriti dan vaksinasi, diagnostik dan
pengawasan serta Pendidikan. Tujuan utamanya adalah: untuk mencegah
masuknya Al, untuk mengurangi kerugian akibat dampak ekonomi,
penghapusan total Al. Vaksinasi saja tidak akan mencapai pemberantasan, dan
jika tidak digunakan dengan tepat dapat menyebabkan infeksi menjadi
endemis.
 Vaksin Unggas H5N1. Vaksin Komersial berisi vaksin yang dimatikan
- H5N2, H5N3, H5N8, H5N9. Vaksin cacar unggas hidup-H5 dan / atau N1
rekombinan. Reverse Genetic H5N2dan H5N1

Batasan Vaksin HPAI & Vaksinasi; Mahal, Penanganan individu

(injeksi), Kekebalan berkembang lambat setelah vaksinasi pertama.
Perlindungan silang yang buruk antara subtipe 16 HA yang berbeda.
Kurangnya perlindungan penuh terhadap kematian dan penyebaran virus.
Perlindungan penuh membutuhkan protein HA dan NA. Kurangnya strategi
DIVA yang mapan. Kemungkinan pembuatan varian dan virus reassortant.

Vaksin DNA dalam kedokteran hewan. Banyak digunakan pada hewan

praklinis dan uji coba klinis di manusia melawan HIV, malaria, TB, influenza,
HBV & CMV dan juga sebagai imunoterapi melawan kanker. Hanya 4 vaksin
DNA yang telah disetujui untuk kedokteran hewan digunakan, melawan virus
West Nile (kuda), menular nekrosis haematopoietic (salmon), melanoma
(anjing) dan GHRH (babi). Upaya gencar telah dilakukan untuk beberapa ekor
unggas penyakit, AIV, IBV, NDV, MDV dan IBDV. Tidak ada vaksin DNA
yang dilisensikan pada unggas.

Keterbatasan vaksin DNA. Pendekatan yang menarik, tetapi memiliki

keterbatasan. Tanggapan yang buruk dan / atau tidak konsisten. Tidak praktis,
sulit diadopsi untuk vaksinasi massal. Kekhawatiran tentang integrasi. Vaksin
unggas diperlukan dalam skala besar dosis, karenanya, vaksin harus hemat
biayadan mudah dikelola

DNA Rekombinan Lisan Vaksin untuk Unggas. Kelahiran diperantarai

Salmonella yang dilemahkan dari vaksin DNA H5. Nanopartikel perak
sintesis hijau mengandung vaksin H5 AIV DNA.

Vaksin dalam penyakit Viral Unggas

a. Avian Influensa. Perlu mengintegrasikan penggunaan vaksin dan

diagnosis dalam manajemen dan biosekuriti tanah pertanian. Vaksin yang
 mengenali antigen universal (epitop) kehadiran itu pada berbagai jenis
AIV. Alat diagnostik yang sensitif untuk cepat di tempat deteksi dan
mampu membedakan terinfeksi dan unggas yang divaksinasi (DIVA).
b. Tantangan dalam mengontrol IB. Tropisme jaringan luas, bereplikasi
dalam sel epitel saluran pernapasan, ginjal dan / atau reproduksi.
Kekebalan yang diinduksi oleh vaksin adalah kebutuhan jangka pendek
vaksinasi ulang ganda. Persistensi virus dan pelepasan jangka panjang.
Vaksin berkontribusi pada munculnya strain varian dan mungkin
mengalami pengembalian ke strain virulen.
c. Tantangan dalam mengontrol MD. Meningkatkan virulen MDV yang
bisa pecah imunitas yang diinduksi oleh vaksin. Diagnosis dini MD
berdasarkan tanda klinis dan lesi (bentuk MD akut, okular dan kulit).
Identifikasi dan diferensiasi bidang virulen strain dari strain vaksin
serotipe I dilemahkan.

KESIMPULAN

Pengidentifikasian suatu mikroorganisme bakteri dapat dilakukan metode

modern atau molecular diagnosis. Metode yang paling umum digunakan adalah
metode Polymerase Chain Reaction (PCR), Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
dan Multilocus Sequencing Typing (MST).

Virus merupakan organisme yang bersifat patogen dan hanya bisa

berkembang di sel hidup. Diagnose atau identifikasi virus dapat dilakukan dengan
diagnose molekuler dan diagnose berbasis serologi. Virus dilemahkan menjadi vaksin
dengan tujuan mencegah infeksi penyait virus. Dalam kedokteran hewan ckasin
digunakan untuk mengontrol penyakit viral hewan diantaranya Avian Influenza,
Infectious Bronchitis dan Marek desease.