ISOLASI MIKROBIOLOGI

Mikrobiologi memiliki sejarah yang panjang dan kaya, awalnya cabang ilmu ini

hanya berpusat pada penyebab penyakit menular saja tetapi sekarang termasuk kedalam

bagian ilmu pengetahuan yang praktis. Banyak ilmuwan telah memberikan kontribusi

yang signifikan untuk pengembangan mikrobiologi. Salah satu yang menarik unruk

dikembangkan dalam mikrobiologi adalah bakteri. Pengamatan Bakteri pertama

dilakukan sekitar tahun 1673 oleh ahli mikroskop Belanda Anton van Leeuwenhoek

berkat mikroskop yang dimilikinya. Mikroskop tersebut memiliki kemampuan

perbesaran yang luar biasa yaitu dari 50 menjadi 300 kali lipat dari yang diamati

pertama kali.1

Mikrobiologi modern dalam perkembangannya telah menjangkau banyak bidang

usaha manusia, termasuk pengembangan produk farmasi, penggunaan metode kontrol

kualitas dalam produksi makanan dan produk susu, pengendalian mikroorganisme

penyebab penyakit di perairan yang dapat dikonsumsi, dan aplikasi mikroorganisme

dalam industri. Mikroorganisme digunakan untuk memproduksi vitamin, asam amino,

enzim, dan suplemen pertumbuhan. Mereka memproduksi banyak makanan, termasuk

produk susu fermentasi (krim asam, yogurt, dan buttermilk), serta makanan fermentasi

lainnya seperti acar, asinan kubis, roti, dan minuman beralkohol.

Dalam mikrobiologi, istilah isolasi mengacu pada pemisahan galur dari populasi

campuran mikroba hidup alami, seperti yang ada di lingkungan, misalnya pada

tumbuhan, hewan, air, udara dan tanah. Mikroba yang berbeda tumbuh secara berbeda

pada media nutrisi yang berbeda, tergantung pada kebutuhan pertumbuhannya.

1
Wainwright M, Lederberg J. History of microbiology. Encyclop
Microbiol 1992;2:419–37.

1
 Secara historis, teknik laboratorium isolasi pertama kali dikembangkan di

bidang bakteriologi dan parasitologi selama abad ke-19, sebelum disusul oleh bidang

virologi pada abad ke-20.2 Di alam terdapat berjuta juta jenis bakteri. Ada sekitar

10.000 nama dari spesies mikroba. Diperkirakan ada antara 10.000 dan 100.000 lebih

spesies yang belum teridentifikasi untuk setiap spesies yang teridentifikasi. Satu sendok

tanah dapat memiliki 100 juta bakteri individu. Bahkan ketika menggores gusi maka

akan didapati sekitar 1 juta bakteri per cm2 (satu cm2 kira-kira sebesar kuku jari

kelingking). Bakteri yang ada di dalam tubuh membentuk sekitar 10% dari berat badan

kering manusia. Di alam bakteri jarang hidup sendiri tetapi hidup berkelompok dengan

bakteri lain, begitu juga di dalam tubuh manusia.

Pengamatan pada mikroorganisme tertentu dapat hanya dapat dilakuka jika

mikroorganisme dipisahkan dari lingkungan dan mikroorganisme lainnya. Hal ini dapat

dilakukan dengan teknik isolasi. Beberapa metode sering digunakan dalam isolasi

mikroba. Metode yang digunakan juga disesuaikan dengan jenis mikroba yang akan

diamati. Isolasi bakteri didefinisikan sebagai teknik pemisahan satu spesies bakteri dari

kultur campuran bakteri dengan metode pelapisan yang berbeda seperti penuangan,

penyebaran, penggoresan, dan pengenceran serial. Pertumbuhan bakteri dapat diamati

pada media nutrisi padat, dalam media kaldu cair dan beberapa media kultur cair

otomatis. Untuk memvisualisasikan dan mengisolasi bakteri dalam media padat, kita

perlu menambahkan suspensi bakteri ke dalam atau pada media. Pendapat serupa juga

dijelaskan oleh Adde dan Endang (2018)3 bahwa Isolasi mikroba yaitu memisahkan satu

2
rescott LM, Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ. Microbiologie.
5ème edition. Louvain-la-Neuve: De Boeck Supérieur; 2018.
3
Adde Lolita Octavia Putri dan Endang Kusdiyantini ”Isolasi Bakter Asam Laktat dari Pangan Fermentasi
berbasis ikan (Inasua) yang diperjual belikan dari Maluku-Indonesia”. Jurnal Biologi Tropika, Vol. 1 No. 2
(November, 2018), 6-12

2
jenis mikroba dengan mikroba lainnya dari berbagai macam campuran mikroba dengan

tujuan untuk mendapatkan biakan murni. Prinsip dari isolasi mikroba adalah

memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya di alam dan

menumbuhkannya di media buatan sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni

Isolasi bakteri merupakan alat yang penting untuk mempelajari sifat morfologi,

fisiokimia dan patogen dari bakteri yang telah diisolasi. Isolasi adalah suatu cara untuk

memisahkan mikroorganisme tertentu dari lingkungan, sehingga diperoleh biakan yang

tidak tercampur dengan jenis atau biakan murni lainnya (Putri, 2017). Karena populasi

bakteri yang terbatas pada metode penggoresan, isolasi kultur murni lebih mudah

dibandingkan dengan metode pour plate dan metode spread plate. Melalui metode

goresan, kita dapat membiakkan, mengisolasi, dan mempelajari koloni individu bakteri.

Biakan murni diperlukan untuk mempelajari sifat-sifat biokimia dan morfologi biakan

tersebut (Sherman, 2012).

Isolasi bakteri dapat dilakukan dengan menggunakan media umum, dimana

berbagai bakteri dapat tumbuh, dan media selektif yang memungkinkan pertumbuhan

genera tertentu. Contoh dari Media umum adalah nutrient agar (NA), tryptic soy agar

(TSA), dan brain heart infus agar (BHIA). Contoh media selektif adalah agar sukrosa

empedu tiosulfat sitrat (TCBS) untuk vibrio, dan glutamat pati phenol red agar (GSP)

untuk aeromonad dan peudomonas. Media dilengkapi dengan 1-2% natrium klorida

(NaCl) jika ingin digunakan untuk spesies laut. Sesuaikan pH media kultur menjadi 7,2-

7,4 dengan menambahkan 0,1 N NaOH.4

4
Ruangpan, L., & Tendencia, E. A. (2014). Bacterial isolation, identification and storage. In Laboratory
manual of standardized methods for antimicrobial sensitivity tests for bacteria isolated from aquatic
animals and environment (pp. 3–11). Tigbauan, Iloilo, Philippines: Aquaculture Department, Southeast
Asian Fisheries Development Center

3
 Dalam isolasi tidak terlepas dari teknik yang digunakan untuk mendapatkan hasil

berupa isolat murni atau yang dikenal dengan istilah isolat. Teknik kultur untuk

medapatkan isolat murni terbagi menjadi 4 macam, yaitu: Pertama adalah metode pour

plate (penuangan). Penuangan adalah metode paling sederhana untuk isolasi bakteri.

Metode pour plate merupakan metode untuk memperoleh biakan murni dari populasi

campuran mikroorganisme dengan cara mengencerkan spesimen yang kemudian

dituangkan ke dalam cawan steril dan diikuti dengan menuangkan medium agar yang

telah dicairkan dan didinginkan (pada suhu ± 50 0C). Tujuan dari metode ini adalah

untuk menentukan perkiraan jumlah bakteri hidup dalam cairan atau spesimen (Irianto,

2012).

Dalam prakteknya dapat dilakukan dengan cara: suspensi bakteri dengan populasi

yang sangat besar diambil. Hasil perhitungan bakteri dinyatakan dalam koloni. Dengan

menggunakan pipet, ambil 1 ml sampel bakteri ke dalam cawan petri steril. Untuk

pertumbuhan bakteri, harus ada beberapa sumber nutrisi seperti karbon dan nitrogen.

Oleh karena itu, media agar nutrien yang paling umum terlebih dahulu disiapkan dan

ditambahkan ke cawan Petri yang berisi sampel bakteri. Untuk distribusi sampel dan

media yang seragam, putar pelat searah jarum jam dan berlawanan arah jarum jam.

Sebelum menyimpan cawan petri dalam inkubator, biarkan cawan kultur memadat.

Untuk pertumbuhan bakteri yang tepat, simpan cawan kultur dalam inkubator pada suhu

35-37 derajat Celcius selama maksimum 48 jam. Setelah inkubasi, pertumbuhan koloni

bakteri dapat terlihat.

Metode kedua, metode Steak (cawan gores). Metode steak merupakan suatu cara

untuk mengisolasi bakteri dengan cara menggores permukaan medium dengan

menggunakan jarum ose. Penggoresan bertujuan untuk membuat garis sebanyak

4
mungkin pada permukaan medium agar bakteri yang tumbuh pada garis-garis terakhir

berupa koloni yang terpisah-pisah (Irianto, 2012). Metode pengolesan sangat populer

dan metode yang paling banyak digunakan untuk isolasi kultur murni. Untuk melakukan

penggoresan, tuangkan media agar nutrien yang baru disiapkan ke dalam cawan Petri

steril dan biarkan hingga memadat. Setelah itu, ambil loop inokulasi dan sterilkan di

atas api sampai menjadi merah panas. Kemudian, ambil inokulum dengan menggunakan

loop inokulasi yang disterilkan dan gores di atas media nutrisi padat dengan menjaga

pelat dekat dengan api untuk menghindari kontaminasi. Setelah digores, inkubasi cawan

kultur selama 24-48 jam pada suhu 35-37 derajat Celcius di dalam inkubator. Karena

populasi bakteri yang terbatas pada metode penggoresan, isolasi kultur murni lebih

mudah dibandingkan dengan metode pour plate dan metode spread plate. Melalui

metode goresan, kita dapat membiakkan, mengisolasi, dan mempelajari koloni individu

bakteri.

Metode ketiga, metode spread plate (penyebaran). Isolasi dengan penyebaran

serupa dengan isolasi bakteri pada penuangan. Hal yang membedakan adalah pada saat

penuangan suspensi sampel kedalam medium isolasi diawali dengan pengeceran

sampel pada setiap penuangan. Medium yang telah disiapkan dituang ke dalam cawan

petri steril. Tunggu hingga medium memadat, setelah itu tuangkan suspensi ke dalam

cawan petri yang telah berisi medium yang telah memadat. Penebaran suspensi

dilakukan dengan batang Drugalsky yang telah dipanaskan terlebih dahulu (Waluyo,

2017). Metode penebaran lagi-lagi merupakan metode yang sangat sederhana untuk

melakukan isolasi bakteri. Ini sedikit berbeda dari metode pelat tuang. Di sini, media

nutrisi ditambahkan ke cawan Petri sebelum menambahkan sampel bakteri. Media

nutrisi ditambahkan ke cawan Petri steril kemudian dibiarkan memadat. Setelah media

5
nutrisi menjadi padat, tambahkan 1 ml suspensi bakteri di atas permukaan media. Untuk

penyebaran bakteri yang seragam di atas permukaan media padat, ambil penyebar

berbentuk T atau L untuk menyebarkan suspensi bakteri secara merata. Setelah itu,

inkubasi cawan kultur pada suhu 35-37 derajat Celcius selama 24 hingga 48 jam. Kita

bisa melihat beberapa koloni bakteri setelah inkubasi. Dalam metode penyebaran, kita

dapat memilih koloni yang diisolasi untuk kultur bakteri. Untuk isolasi kultur murni,

metode penyebaran tidak terlalu populer.

Metode keempat adalah metode pengenceran serial. Teknik ini banyak dikenal

untuk isolasi dan kultur bakteri. Pada metode pengenceran serial, ambil suspensi bakteri

dan encerkan secara berurutan dalam tabung reaksi yang berurutan. Dengan mengikuti

pengenceran serial, tambahkan 1 ml sampel ke tabung reaksi tetangga secara berurutan

dalam seri 10-1, 10-2, 10-3 dan seterusnya. Setelah pengenceran suspensi bakteri yang

berurutan, kita dapat menginokulasi kultur bakteri dengan menggunakan salah satu dari

tiga metode (penuangan, penyebaran dan penggoresan). Sangat mudah untuk

mengisolasi bakteri dari populasi bakteri yang sedikit. Pada pengenceran serial, sampel

yang lebih pekat (10-1) akan menghasilkan jumlah koloni paling banyak. Sampel yang

lebih encer (10-4) akan menghasilkan jumlah koloni paling sedikit. Jadi harus jelas bagi

kita bahwa sampel yang kurang diencerkan akan mengandung lebih banyak konsentrasi

bakteri daripada air. Dan sampel yang lebih encer akan mengandung konsentrasi air

yang lebih tinggi daripada bakteri. Oleh karena itu, sampel yang mengandung populasi

bakteri rendah akan menghasilkan jumlah koloni yang lebih sedikit dan sebaliknya.

Koloni yang diisolasi harus dipilih untuk pewarnaan dan pemeriksaan mikroskopis

untuk mempelajari karakteristik bakteri yang diisolasi.

6
 . Pada prosedur isolasi mikrob pada sampel Dalam proses pengerjaan isolasi pada

beberapa jenis sampel, terdapat prosedur atau tahapan-tahapan yang harus dilakukan

udara diawali dengan sterilisasi telapak tangan dengan menggunakan alkohol 70%, hal

ini bertujuan untuk menjaga kesterilan tangan dari bakteri lain yang nantinya tidak

diharapkan dalam sampel yang digunakan. Selanjutnya adalah mempersiapkan media

PCA (Plate Count Agar) steril yang berada dalam cawan petri kemudian buka cawan

petri dan gunakan untuk mengambil mikrob yang ada di udara selama 5-10 detik, dan

selanjutnya tutup kembali cawan petri serta lakukan inkubasi selama 1-5 hari.

Pada prosedur isolasi mikrob dalam makanan seperti sampel buah apel dan anggur

merah dapat dilakukan dengan beberapa tahapan. Prosedur isolasi diawali dengan

sterilisasi telapan tangan dan meja kerja menggunakan alkohol 70%. Setelah itu meja

kerja di lab menggunakan tissu, kemudian siapkan 2 buah lampu bunsen dan hidupkan

apinya, selanjutnya biarkan api bunsen menyala selama lebih kurang 15 menit, hal ini

bertujuan untuk menjaga daerah sekitar lampu bunsen tetap steril. Selanjutnya

permukaan sampel apel merah diusah dengan menggunakan cotten bud steril dan

usahakan agar tangan tidak menyentuh permukaan buah. Selanjutnya siapkan larutan

garam fisiologis 0,85% sebanyak 9 ml. Larutan garam fisiologis merupakan media

terbaik untuk menjaga ketahanan hidup isolat bakteri asam laktat, karena NaCl (larutan

garam fisiologis yang terbuat dari garam NaCl dengan konsentrasi 0,9% b/v) berfungsi

untuk menjaga keseimbangan ion sel mikroba.5 Fungsi NaCl 0.9% sebagai sumber

mineral mikroba karena salah satu factor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba

yaitu sumber mineral dan ini dapat diperoleh dari NaCl 0.9% yang dimana juga

menjaga sel mikroba dalam keadaan yang isotonis. Karena jika mikroba dalam keadaan
5
Lestari, C., I. Suhaidi, dan Ridwansyah. 2017. Pengaruh Konsentrasi Garam dan Suhu Fermentasi Kimchi
Lobak. Jurnal Rekayasa Pangan dan Pertanian Vol.5 No.1. Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan.
Fakultas Pertanian. Universitas Sumatera Utara. Medan.

7
hipotonis atau hipertonis maka sel mikroba akan pecah. Selain itu, larutan NaCl

merupakan larutan yang steril dimana tidak ditumbuhi atau tidak adanya mikroba

sehingga cocok untuk media. Selanjutnya gunting cotten bud yang mengenai

permukaan buah kedalam larutan garam fisiologis dan kemudian lakukan vortex. Tujuan

larutan divortex adalah untuk menghomogenkan larutan atau campuran larutan agar

mikroba yang akan digunakan menyatu dengan larutan tersebut. Selanjutnya lakukan

seri pengenceran sebanyak 4 tahap.

Setelah dilakukan seri pengenceran pada tahap 1, tahap 2, tahap 3, dan tahap 4,

maka proses selanjutnya adalah inokulasi. Inokulasi mikroba adalah kegiatan untuk

menumbuhkan, meremajakan mikroba dan mendapatkan populasi mikroba yang murni.

Inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium

yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Media untuk membiakkan

bakteri haruslah steril sebelum digunakan. Proses inokulasi dilakukan dengan metode

pour plate. Dalam tahapan inokulasi media yang digunakan adalah media PCA (Plate

Count Agar). Medium Plate Count Agar (PCA) merupakan medium yang digunakan

dalam metode standar perhitungan jumlah bakteri dalam berbagai sampel uji seperti air,

air limbah, makanan dan produk dairy6. Selanjutnya sampel dimasukkan kedalam

inkubator. Tujuan sampel dimasukkan kedalam inkubator pada suhu 370C adalah untuk

memnatau pertubuhan bakteri dengan menggunakan suhu tertentu. Suhu panas pada

inkubator akan merangsang pertumbuhan bakteri. Untuk sampel anggur merah

mempunyai tahapan yang hampir sama dengan apel merah, namun pada sampel anggur

6
Wati, Risa Yudi. 2018. Pengaruh Pemanasan Media Plate Count Agar (PCA) Berulang Terhadap Uji
Total Plate Count (TPC) di Laboratorium Mikrobiologi Teknologi Hasil Pertanian Unand . Vol.1 No. 2,
Nov 2018 ISSN 2621-0878 44.

8
merah tidak menggunakan cotten bud, namun langsung menggunakan anggur merah

utuh dan selanjutnya di vortex.

Pada prosedur isolasi sampel tanah, diawali dengan tahapan sterilisasi telapak

tangan dengan alkohol 70%, kemudian sampel tanah dimasukan kedalam larutan garam

fisiologis 0,85% dan divortex. Larutan ini digunakan sebagai larutan pengenceran

pertama, selanjutnya diambil sebanyak 1 ml dari larutan pengenceran pertama untuk

dimasukkan kedalam larutan pengenceran tahap kedua. Hal yang sama dilakukan

sampai tahap pengenceran ke empat. Selanjutkan hasil pengenceran diinokulasikan pada

media PCA dan dilakukan metode spread plate menggunakan bantang L. Penggunaan

batang L dilakukan untuk meratakan inokulum. Setelah itu dilakukan inkubasi pada

inkubator dengan suhu 370 C selama 24 jam.

Dari pembahasan diatas dapat disimpulkan bahwa isolasi adalah memisahkan atau

memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya di alam dan menumbuhkannya di

media buatan sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Isolasi mikroba

merupakan metode penting untuk mempelajari dan mengklasifikasikan mikroba

berdasarkan sifat makroskopik (seperti pola pertumbuhan), sifat pewarnaan, sifat

mikroskopis (seperti warna, bentuk dan ukuran) dan uji biokimia. Dengan mengetahui

ciri-ciri mikroba tersebut, diagnosis spesimen klinis dan identifikasi mikroba yang

ditemukan secara alami di lingkungan menjadi mudah. Teknik isolasi mikroba

dibedakan atas empat, yaitu Pertama adalah metode pour plate (penuangan), metode

Steak (cawan gores), metode spread plate (penyebaran), dan metode pengenceran serial.

Proses pengerjaan isolasi pada beberapa jenis sampel, terdapat prosedur atau tahapan-

tahapan yang harus dilakukan, secara umum meliputi sterilisasi, kemudian dilanjutkan

denga isolasi, kemudian dilanjutkan dengan inokulasi, dan terakhir adalah inkubasi.

9
 DAFTAR PUSTAKA

Adde Lolita Octavia Putri dan Endang Kusdiyantini ”Isolasi Bakter Asam Laktat dari
Pangan Fermentasi berbasis ikan (Inasua) yang diperjual belikan dari Maluku-
Indonesia”. Jurnal Biologi Tropika, Vol. 1 No. 2 (November, 2018), 6-12.

Irianto, H. 2012. Karakterisasi Molekuler BAL Dengan Gen 16S rRNA Penghasil
Enzim Protease Yang berpotensi sebagai Probiotik Dari Fermentasi Markisa
Kuning di Sumatera Barat. J. Clin Microbial. 37: 3613-3620.

Putri, D. M. S. 2017. Analisis Perbandingan Kandungan Mikroplastik Menggunakan

Metode Samping Plankton Net dan Manta Net di Perairan Selatan Selat Bali.
FPIK. UNBRA.

Rescott LM, Willey JM, Sherwood LM, Woolverton C. J. Microbiologie. 5ème edition.
Louvain-la-Neuve: De Boeck Supérieur; 2018.

Wainwright M, Lederberg J. History of microbiology. EncyclopMicrobiol .1992;2:419–

37.

Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Penerbit Universitas Muhammadiyah. Press

Malang.

Wati, Risa Yudi. 2018. Pengaruh Pemanasan Media Plate Count Agar (PCA) Berulang
Terhadap Uji Total Plate Count (TPC) di Laboratorium Mikrobiologi Teknologi
Hasil Pertanian Unand . Vol.1 No. 2, Nov 2018 ISSN 2621-0878 44.

10