patogenesis yang mendasari asma dan PPOK diperlukan.

Kami sebelumnya menunjukkan bahwa jalur NF-kB memainkan peran penting

peran dalam poli I: C yang diinduksi upregulasi PD-L1, dan IC87114

poli I: ekspresi PD-L1 yang diinduksi poli I: C yang dilemahkan dalam PBEC yang sehat

dengan menghambat induksi translasi PD-L1 melalui Akt/

jalur mTOR (14, 23). Dalam penelitian ini, kami mengamati

efek penekan IC87114 pada poli I: C-diinduksi PD-L1 in

PBECs dari pasien asma, tetapi bukan pasien dengan COPD.

Paparan kronis terhadap asap rokok merupakan faktor etiologi utama

dalam patogenesis PPOK dan dilaporkan menginduksi PD-L1

ekspresi dalam sel epitel bronkial manusia dan paru-paru murine

melalui reseptor aril hidrokarbon (33). Mekanisme spesifik etiologi yang mendasari upregulasi PD-L1

ekspresi mungkin menjadi alasan untuk penekan yang tidak memadai

efek IC87114 pada PD-L1 yang diinduksi poli I:C di PBEC dari

pasien dengan PPOK. Bertentangan dengan penekanan yang diinduksi IC87114

ekspresi PD-L1, IC87114 meningkatkan poli I: C– atau gen PD-L2 yang diinduksi hMPV dan ekspresi
protein dalam PBEC, mungkin

melalui peningkatan produksi IFN antivirus (Gambar 9). Kita

temuan, bersama dengan penelitian sebelumnya tentang peran PD-L1

dan ekspresi PD-L2 dalam imunitas sel T, menunjukkan bahwa a

inhibitor PI3Kd selektif dapat secara bersamaan meningkatkan

kekebalan antivirus dan adaptif dan mewakili

pengobatan infeksi virus pernapasan.

PENGANTAR

Kematian sel terprogram 1 ligan 1 (PD-L1) dan ligan 2 (PD-L2) adalah

ligan dari kematian sel terprogram 1 (PD-1) co-inhibitory

reseptor pada sel T. Sumbu PD-1/PD-L1 adalah negatif

jalur pensinyalan modulasi untuk aktivasi sel T, dan

bukti eksperimental baru-baru ini telah menunjukkan bahwa sumbu PD-1/PD-L1

juga mengatur respon imun antivirus (1-3). Dalam pernapasan

infeksi virus, seperti human metapneumovirus (hMPV) atau

infeksi virus influenza, penghambatan jalur PD-1/PD-L1

memulihkan aktivitas sel T CD8+ spesifik virus dan menghasilkan

pembersihan virus di paru-paru, yang menunjukkan bahwa peningkatan regulasi PD-L1 pada

sel yang terinfeksi bertanggung jawab atas kelelahan sel T CD8+ (2, 4, 5).

Meskipun penelitian telah menunjukkan bahwa ekspresi PD-L2 adalah

diinduksi dalam sel epitel bronkus setelah infeksi virus seperti

sebagai virus syncytial pernapasan (6), peran yang tepat dari PD-L2 dalam

respon imun antivirus masih belum diketahui.

Infeksi virus pernapasan memperburuk penyakit paru-paru kronis

seperti asma dan penyakit paru obstruktif kronik

(PPOK). Sel epitel bronkial adalah target utama dari

infeksi oleh virus seperti rhinovirus, respiratory syncytial,

virus, virus influenza, dan hMPV. RNA untai tunggal ini

virus menghasilkan double-stranded RNA (dsRNA) atau struktur dsRNA panhandlelike dalam sel
inang yang terinfeksi selama replikasi.

DsRNA virus dikenali oleh reseptor pengenalan pola

(PRR), seperti reseptor seperti tol (TLR) 3 pada endosom dan

RNA sitosol helicase retinoic acid-inducible gen-I atau

gen 5 terkait diferensiasi melanoma, yang mengarah ke

sekresi interferon antivirus (IFNs) dan pro-inflamasi

sitokin dan kemokin (7-9). IFN tipe I (IFNa dan IFNb)

dan IFNs tipe III (IFNl) yang disekresikan dari epitel bronkial yang terinfeksi

sel merangsang sel tetangga melalui reseptor IFN untuk mengekspresikan

Gen yang diatur IFN (IRG), menginduksi keadaan antivirus (10, 11).

sebelumnya menunjukkan bahwa infeksi virus atau stimulasi dengan a

analog dsRNA sintetis, asam poliinosinat-polisitidilat (poli I:

C), peningkatan ekspresi PD-L1 dan PD-L2 pada bronkial manusia

sel epitel, dan jalur NF-kB memainkan peran penting dalam

poli I: C yang diinduksi upregulasi PD-L1 (12-14). Penelitian terkini

menunjukkan bahwa IFN tipe I eksogen tidak hanya menginduksi PD-L1

ekspresi dalam sel endotel, monosit, dan sel dendritik tetapi

juga ekspresi PD-L2 dalam sel melanoma berbudaya (15-17). Ketika

IFN tipe I dan III diinduksi sebagai respons lini pertama terhadap

infeksi virus pernapasan, efek IFN antivirus pada

ekspresi PD-L1 dan PD-L2 dalam sel epitel bronkial memiliki

tidak diselidiki. Phosphoinositide 3-kinase (PI3Ks) mengatur berbagai

fungsi biologis termasuk proliferasi sel, diferensiasi,

dan migrasi melalui beberapa molekul hilir seperti v-akt

murine thymoma viral onkogen homolog (Akt) dan

target mekanistik rapamycin (mTOR). PI3Kd adalah kelas IA

PI3K dan sebagian besar diekspresikan dalam sel-sel myeloid dan

garis keturunan limfoid (18). Kami baru-baru ini melaporkan bahwa penghambatan

Pensinyalan PI3Kd meningkatkan IFN antivirus yang diinduksi poli I:C

respons dalam sel epitel bronkial primer manusia (PBECs),

yang menunjukkan bahwa PI3Kd dapat mengatur antivirus secara negatif

Tanggapan IFN (14). Kami juga telah menunjukkan bahwa PI3Kd . selektif

inhibitor melemahkan ekspresi PD-L1 yang diinduksi poli I:C oleh menghambat induksi translasi PD-
L1 melalui Akt/mTOR

jalur (14). Namun, hubungan antara pensinyalan PI3Kd

dan ekspresi PD-L2 yang diinduksi poli I:C pada PBECs

tetap tidak diketahui.

Dalam penelitian ini, kami menilai apakah IFN eksogen menginduksi

ekspresi PD-L1 dan PD-L2 menggunakan PBEC dan pengobatan dengan

IFN plus poli I:C semakin meningkatkan PD-L1 dan PD-L2. Kami juga
dievaluasi apakah penghambatan pensinyalan PI3Kd mempengaruhi poli I:C–

menginduksi aktivasi faktor transkripsi hilir PRR,

tanggapan IFN antivirus, dan ekspresi PD-L1 dan PD-L2 di

PBEC dan PBEC sehat dari pasien asma dan PPOK

pasien. Akhirnya, kami menganalisis efek PI3Kd . selektif

inhibitor pada ekspresi PD-L1 dan PD-L2 yang diinduksi hMPV

pada PBEC.

BAHAN DAN METODE

Budaya dan Perlakuan PBECs

PBEC dikumpulkan dan dikultur sesuai dengan kami sebelumnya

protokol yang dijelaskan (14). Secara singkat, PBEC diperoleh selama

bronkoskopi serat optik rutin dari pasien yang tidak pernah merokok

dengan fungsi paru normal dan nodul paru dengan

melakukan penyikatan bronkial dari lobus yang sehat tanpa

nodul paru (PBECs sehat). Semua sikat bronkus

diperoleh dari daerah anatomi yang sama (bronkial)

generasi 4–7). PBEC juga dikumpulkan dari pasien dengan

asma dan pasien dengan PPOK untuk digunakan dalam beberapa percobaan.

Ciri-ciri penderita asma atau PPOK pada

bronkoskopi ditunjukkan pada Tabel S1. Kecuali dinyatakan lain,

PBEC sehat digunakan dalam percobaan. Protokol studi

telah disetujui oleh Tinjauan Institusional Universitas Kyushu

Badan Penelitian Klinis (29-170). Semua mata pelajaran disediakan

persetujuan tertulis sesuai dengan prinsip-prinsip

tercantum dalam Deklarasi Helsinki.

Sel dikultur dalam labu yang dilapisi dengan kolagen (Sel

Applications, Inc., San Diego, CA, USA) yang berisi

media pertumbuhan epitel bronkial tambahan (BEGM;

Lonza, Basel, Swiss) pada 37°C dalam 5% CO2 dan digunakan dalam empat

bagian. PBEC (sekitar 80% pertemuan) telah diberi perlakuan sebelumnya

dengan 250 U/ml IFNb1a manusia (PBL Assay Science, Piscataway, NJ,

AS), 250 U/ml IFNl1 manusia (Ilmu Uji PBL), 10 mM

IC87114 (BioVision, Milpitas, CA, AS), 10 mM AS604850

(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Jepang) atau

kendaraan selama 1 jam dan kemudian dirangsang dengan penambahan 1mg/mL poli I:

C (Innaxon, Tewkesbury, Inggris) ke media kultur.

Dalam percobaan infeksi virus, 10 mM IC87114 ditambahkan ke sel

selama 1 jam sebelum infeksi hMPV, dan IC87114 dipertahankan dalam

media setelah infeksi. PBEC dikultur di BEGM tanpa

hidrokortison setidaknya 24 jam sebelum stimulasi atau infeksi.

Aliran Sitometri

PBEC dikultur menjadi semi-pertemuan di pelat 12-sumur. Sel

diinkubasi dalam 100 mL PBS yang mengandung 0,5% BSA

mengandung PE anti-manusia PD-L1 (kloning: MIH1; Invitrogen,

Carlsbad, CA, USA) atau PE anti-manusia PD-L2 (kloning: MIH18;

Invitrogen) pada suhu kamar selama 30 menit pada awalnya

eksperimen. Dalam beberapa percobaan, sel diinkubasi dalam suhu 100

mL PBS dengan 0,5% BSA yang mengandung APC anti-manusia PD-L1

(kloning: MIH1; Invitrogen) dan PE anti-manusia PD-L2 (kloning:

MIH18; Invitrogen) pada suhu kamar selama 30 menit. Sel adalah

dicuci bersih dan dianalisis menggunakan aliran BD FACSVerse

sitometer dengan perangkat lunak FACSuite (Becton Dickinson, Franklin)

Lakes, NJ, AS). Sepuluh ribu acara diperoleh dalam mode daftar

dengan puing-puing dikecualikan oleh ambang hamburan maju.

Untuk analisis viabilitas sel, sel paru yang disuspensikan kembali atau

PBEC diinkubasi dengan propidium iodida (PI), dan sel yang tidak dapat hidup (diwarnai dengan PI)
dihitung dalam flow cytometer

dengan puing-puing dikecualikan oleh ambang hamburan maju.

Transfeksi RNA Kecil yang Mengganggu

PBEC yang dikultur dalam pelat 6-sumur (pertemuan 60% -80%) adalah
ditransfusikan secara sementara dengan faktor regulasi IFN 10 nM 3

(IRF3) siRNA (Silencer® Select Validated siRNA, s7507;

Ambion, Life Technologies, Carlsbad, CA, AS), 10 nM

PIK3CD siRNA (Silencer® Select Validated siRNA, s10529;

Ambion, Life Technologies) atau kontrol negatif 10 nM (NC)

siRNA (Peredam® Pilih Kontrol Negatif siRNA, 4390843;

Ambion, Life Technologies) menggunakan Lipofectamine® RNAiMAX

Reagen (Invitrogen) sesuai dengan pabriknya

instruksi. Lipofectamine® RNAiMAX Reagen atau siRNA

diencerkan dalam BEGM tanpa hidrokortison dan antibiotik.

Sel digunakan untuk percobaan pada 48 jam setelah transfeksi.

Blotting Barat

PBEC yang dikultur hingga semi-pertemuan di pelat 6-sumur dilisiskan

menggunakan Pierce® RIPA Buffer (Thermo Fisher Scientific, San Diego,

CA, USA) sesuai dengan instruksi pabriknya. Protein

sampel (4 g) didenaturasi, dipisahkan oleh SDS-PAGE, dan

dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida.

Membran diblokir dengan TBS-Tween (10 mM Tris, 150

mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 8,0) mengandung 5% skim

susu selama 1 jam pada suhu kamar. Membran itu kemudian

diinkubasi dengan anti-PD-L1 (Teknologi Pensinyalan Sel), antiPD-L2 (Teknologi Pensinyalan Sel), anti-
pengikatan TANK

kinase-1 (TBK1) (Teknologi Pensinyalan Sel, Beverly, MA,

AS), anti-fosfo-TBK1 (Ser172, Pensinyalan Sel

Teknologi), anti-IRF3 (Teknologi Pensinyalan Sel), antifosfo-IRF3 (Ser386, Teknologi Pensinyalan Sel),
anti-PI3

Kinase p110d (Teknologi Pensinyalan Sel) atau anti-b-aktin

(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) antibodi pada 4°C

semalam. Membran dicuci tiga kali dengan TBS-Tween

dan kemudian diinkubasi dengan horseradish peroxidase-conjugated

antibodi sekunder selama 60 menit pada suhu kamar. membran

dicuci tiga kali dengan TBS-Tween, dan pita tertentu

divisualisasikan menggunakan ImmunoStar® LD (Wako, Osaka, Jepang)

sesuai dengan instruksi pabrik. Semua noda adalah

dicitrakan menggunakan sistem ChemiDoc™ XRS+ (Bio-Rad

Laboratories, Inc., Hercules, CA, AS). Analisis densitometri

intensitas pita dilakukan menggunakan Image J.

PCR Transkripsi Balik Kuantitatif

Total RNA diisolasi dari PBEC menggunakan TRI Reagent

(Pusat Penelitian Molekuler, Inc., Cincinnati, OH, AS)

Transkripsi terbalik dilakukan menggunakan Multiscribe Reverse

Transkriptase (Invitrogen). RT-PCR kuantitatif waktu nyata

analisis dilakukan sekali per sampel menggunakan Fast Start

SYBR Green Master (Roche, Mannheim, Jerman) dan a

Sistem Waktu Nyata Dadu Bersepeda Termal II (Takara, Shiga,

Jepang). Tingkat ekspresi mRNA dihitung dari

siklus ambang menurut metode DDCt. Gen sasaran

tingkat ekspresi dinormalisasi ke ekspresi 18S

rRNA. Urutan primer disediakan dalam Tabel S2.

Infeksi Virus pada Sel Kultur

Strain CAN97-83 dari hMPV digunakan; hMPV disebarkan

dalam sel Vero E6 (CRL-1586; ATCC, Manassas, VA, USA) dan

titer virus ditentukan dengan uji TCID50. Singkatnya, virus adalah

disiapkan dalam MEM bebas serum (Gibco, Thermo Fisher Scientific,

San Diego, CA, USA) yang mengandung 5 mg/ml tripsin (Gibco) oleh

menginfeksi sel dalam cawan kultur 10 cm dengan banyak

infeksi (MOI) sebesar 0,05. Setelah diserap selama 2 jam pada 37°C,

MEM bebas serum yang mengandung 5 mg/ml tripsin ditambahkan.

Media bebas serum yang mengandung 5 mg/ml tripsin diubah

setiap hari selama inkubasi dan sel diinkubasi sampai

efek sitopatik 70% -90% diamati, biasanya dalam 7 hari.

Sel dan supernatan kultur dikumpulkan dan virus

diperoleh dengan membekukan sel. Strain hMPV ini memiliki

telah digunakan dalam penelitian lain (19), dan kami tidak mencoba lebih jauh

pemurnian untuk menghindari perubahan sifat utama virus (20).

Virus diukur dengan immunostaining assay. Secara singkat, lapisan tunggal Vero E6 semikonfluen
dalam pelat 24-sumur terinfeksi

dengan 200 ml pengenceran serial 10 kali lipat. Tripsin (5 mg/ml) adalah

ditambahkan dalam MEM bebas serum selama infeksi. Setelah penyerapan untuk

2 jam pada 37°C, 200 ml MEM yang mengandung 5% FBS ditambahkan. Setelah

6 hari kultur sel, sumur yang terinfeksi diidentifikasi dengan:

immunostaining dengan mouse anti-hMPV monoklonal primer

antibodi (MAB8510; EMD Millipore, Temecula, CA, USA) dan

sekunder kambing anti-tikus berlabel lobak peroksidase

antibodi (Abcam, Cambridge, Inggris). Sel divisualisasikan menggunakan

Substrat peroksidase DAB (Vector Laboratories, Inc.,

Burlingame, CA, USA) dan TCID50/ml ditentukan

menggunakan metode standar.

Eksperimen kontrol menggunakan hMPV yang diinaktivasi UV adalah

disertakan untuk mengkonfirmasi bahwa tanggapan adalah hasil dari hMPV

infeksi dan bukan dari faktor yang tersisa di media kultur

mengikuti propagasi hMPV. Untuk virus UV-iradiasi, hMPV adalah

terkena lampu UV dengan panjang gelombang pendek (254 nm) pada jarak

5cm selama 15 menit. PBEC (sekitar 80% pertemuan) adalah

dicuci dengan PBS dan terinfeksi hMPV di BEGM tanpa

hidrokortison selama 1 jam pada MOI 0,1. Monolayer sel adalah

dicuci dan kemudian diinkubasi dalam BEGM tanpa hidrokortison selama

24-72 jam. Biosekuriti standar dan prosedur keamanan institusional

diikuti selama penelitian ini

Analisis Statistik

Kecuali dinyatakan lain, data dinyatakan sebagai sarana ±

kesalahan standar (SEM). Uji U Mann-Whitney digunakan untuk

perbandingan antara dua kelompok. Perbandingan tiga atau lebih

kelompok dilakukan dengan menggunakan analisis varians satu arah

(ANOVA) atau ANOVA dua arah diikuti oleh kelipatan Tukey

tes perbandingan. Korelasi diperiksa menggunakan Spearman

korelasi. Semua analisis statistik dilakukan dengan menggunakan

Perangkat lunak GraphPad Prism 8 (Perangkat Lunak GraphPad, San

Francisco, CA, AS). Perbedaan dianggap secara statistik

signifikan pada p<0,05.

HASIL

IFN antivirus Meningkatkan Ekspresi

PD-L1 dan PD-L2 pada PBEC

Stimulasi dengan IFNb1a saja atau poli I:C saja meningkatkan

ekspresi PD-L1 dan PD-L2 pada PBEC pada 6 dan 12 jam

stimulasi berikut, masing-masing (Gambar 1A). Itu

pengobatan kombinasi IFNb1a plus poli I:C diregulasi

ekspresi PD-L1 dan PD-L2 ke tingkat yang lebih tinggi dibandingkan

dengan stimulasi dengan IFNb1a atau poli I:C saja. Stimulasi dengan

IFNb1a sendiri atau pengobatan kombinasi IFNb1a ditambah poli

I:C menginduksi tingkat ekspresi gen yang lebih tinggi dari gen yang distimulasi IFN

(ISG) 56 dibandingkan stimulasi dengan poli I:C saja (Gambar 1B).

Demikian pula, IFNl1 atau poli I:C saja meningkatkan ekspresi

PD-L1 dan PD-L2 pada PBEC pada 24 jam setelah stimulasi, dan

upregulasi lebih lanjut dari PD-L1 dan PD-L2 diamati setelah

pengobatan kombinasi IFNl1 ditambah poli I:C (Gambar S1A). Itu

viabilitas sel PBEC pada 24 jam setelah stimulasi tidak terpengaruh

dengan pengobatan dengan IFNb1a atau IFNl1 dan/atau poli I:C

(Gambar S1B).

IFN Antivirus Menginduksi Gen dan Protein

Ekspresi PD-L1 dan PD-L2 di PBECs

Selanjutnya, kami menilai efek pengobatan dengan IFNb1a dan/atau

poli I:C pada ekspresi gen PD-L1 dan PD-L2. Perlakuan

dengan IFNb1a saja atau poli I:C saja yang menginduksi PD-L1 dan PD-L2

ekspresi gen 6 jam setelah stimulasi (Gambar 2A). Itu

pengobatan kombinasi IFNb1a plus poli I:C semakin meningkat

tingkat ekspresi gen PD-L1 dan PD-L2 dibandingkan dengan

pengobatan dengan IFNb1a atau poli I:C saja. IFNb1a sendiri atau

poli I:C saja juga meningkatkan kadar protein PD-L1 dan

PD-L2 pada 24 jam setelah stimulasi, dan pengobatan kombinasi

meningkatkan kedua tingkat protein (Gambar 2B).

Inhibitor PI3Kd Meningkatkan Poli I:C–

Ekspresi PD-L2 yang diinduksi pada PBEC,

Sedangkan Ini Menekan Poli I:C–Induced

Ekspresi PD-L1

Kami sebelumnya melaporkan bahwa inhibitor PI3Kd selektif IC87114

poli I: ekspresi PD-L1 yang diinduksi poli I: C yang dilemahkan pada bronkial

sel epitel melalui penghambatan pensinyalan Akt / mTOR

jalur (14). Namun, belum jelas apakah IC87114

mempengaruhi ekspresi PD-L2 yang diinduksi poli I:C. Di sini kami menganalisis

efek IC87114 pada ekspresi PD-L1 dan PD-L2 di

PBEC. Meskipun IC871114 tidak memengaruhi gen yang diinduksi poli I:C

tingkat ekspresi PD-L1, IC87114 secara nyata meningkatkan poli I:C–

tingkat ekspresi gen yang diinduksi PD-L2 pada 12 jam dan 18 jam setelahnya

stimulasi dengan poli I:C (Gambar 3A). Konsisten dengan kami

laporan sebelumnya, IC87114 menekan poli I: C yang diinduksi PD-L1

PBEC. Ekspresi PI3K p110d ditekan dalam PBECs

ditransfeksi dengan siPIK3CD pada 48 jam dan 72 jam berikutnya

transfeksi dibandingkan dengan sel yang ditransfeksi dengan si-negatif

kontrol (NC) (Gambar 4A). PBEC ditransfeksi dengan siPIK3CD

atau siNC selama 48 jam distimulasi dengan poli I:C selama 24 jam, dan ekspresi PDL2 dianalisis. Sel
yang tidak diobati ditransfeksi dengan

siPIK3CD tidak menunjukkan perubahan ekspresi PD-L2 (Gambar 4B).

Namun, ekspresi PD-L2 yang diinduksi poli I:C ditingkatkan pada

PBEC yang ditransfeksi dengan siPIK3CD dibandingkan dengan sel

ditransfeksi dengan siNC (Gambar 4B). Viabilitas sel PBEC adalah

tidak terpengaruh oleh knockdown siRNA dari PIK3CD dan stimulasi

poli I:C (Gambar 4C).

Inhibitor PI3Kd Meningkatkan Poli I:C–

Respons IFN Antivirus yang Diinduksi oleh

Mempromosikan Fosforilasi TBK1/IRF3

di PBEC

Kami sebelumnya melaporkan bahwa IC87114 meningkatkan poli I: C–

menginduksi kadar protein IFNb dan IFNl di bronkial

supernatan kultur sel epitel (14). Untuk menyelidiki

mekanisme peningkatan ekspresi gen dan protein PD-L2

oleh IC87114 plus poli I:C, kami memeriksa efek IC87114 pada

tingkat ekspresi gen IFN antivirus yang diinduksi poli I: C dan

IRG di PBEC. Stimulasi dengan peningkatan gen poli I:C

tingkat ekspresi IFNb dan IFNl pada 3 jam dan 6 jam berikutnya

stimulasi, masing-masing, serta IRG seperti MxA dan ISG56

pada titik waktu selanjutnya (Gambar 5A). Perawatan dengan IC87114

bersama dengan poli I:C secara signifikan meningkatkan ekspresi gen

tingkat IFN dan IRG dibandingkan dengan tingkat dalam sel yang diobati dengan

poli I:C saja.

Aktivasi jalur TBK1/IRF3 sangat penting untuk memperoleh

tanggapan IFN antivirus setelah pengikatan dsRNA virus ke

reseptor seperti tol 3 (22). Jadi, kami memeriksa efek dari

IC87114 pada fosforilasi TBK1 dan IRF3 di PBEC oleh

analisis western blot. Perlakuan gabungan dari IC87114 plus

poli I:C secara signifikan meningkatkan kadar terfosforilasi

TBK1 dan IRF3 pada 1 jam dan 2 jam setelah stimulasi,

masing-masing, dibandingkan dengan tingkat dalam sel yang diobati dengan poli I:C

sendiri (Gambar 5B). Total level TBK1 dan IRF3 tidak terpengaruh

dengan pengobatan kombinasi IC87114 dan stimulasi poli I:C

(Gambar S4).

siRNA Knockdown dari IRF3 Counteracts

Peningkatan Poly I:C–Induced

Ekspresi PD-L2 oleh Inhibitor PI3Kd

Selanjutnya, kami menilai efek knockdown gen IRF3,

yang mengkodekan faktor transkripsi kunci dalam poli I:C-diinduksi

respons IFN antivirus, pada ekspresi PD-L1 dan PD-L2

dalam PBEC yang distimulasi dengan poli I:C dengan atau tanpa IC87114. Kita

mengkonfirmasi penurunan kadar protein IRF3 di PBEC pada 48 jam dan

72 jam setelah transfeksi siIRF3 (Gambar 6A). PBEC

ditransfeksi dengan siIRF3 atau siNC selama 48 jam distimulasi dengan

poli I:C saja atau IC87114 ditambah poli I:C, dan ekspresi dari

PD-L1 dan PD-L2 dianalisis 24 jam setelah stimulasi. Kita

sebelumnya menunjukkan bahwa jalur NF-kB memainkan peran penting

peran dalam poli I: C-diinduksi upregulation dari PD-L1 (23).

Knockdown gen IRF3 tidak melemahkan poli I:C–

menginduksi ekspresi PD-L1 dan PD-L2 (Gambar 6B). Tanpa memedulikan

transfeksi dengan siNC atau siIRF3, IC87114 menekan poli I:

Ekspresi PD-L1 yang diinduksi C. Selanjutnya, peningkatan

poli I: ekspresi PD-L2 yang diinduksi oleh IC87114 adalah

dilawan dalam PBEC yang ditransfeksi dengan siIRF3. Viabilitas sel

tidak terpengaruh oleh stimulasi poli I: C sendiri atau gabungan

dengan IC87114 setelah transfeksi siNC atau siIRF3 (Gambar S5).

Pengaruh Inhibitor PI3Kd pada Poli I:

Ekspresi C–Induced PD-L1 Dan PD-L2

di PBECs Dari Pasien Dengan Asma

atau PPOK

Efek IC87114 pada poli I: C yang diinduksi PD-L1 dan PD-L2

ekspresi dinilai menggunakan PBEC yang dikumpulkan dari pasien

dengan asma atau PPOK. Mirip dengan pengamatan pada PBEC yang sehat,

pengobatan dengan IC87114 menekan poli I: C yang diinduksi PD-L1 dan

peningkatan poli I: C yang diinduksi PD-L2 di PBEC dari pasien dengan

Inhibitor PI3Kd Mengubah hMPV–Terinduksi

Tingkat Ekspresi Gen dan Protein

PD-L1 dan PD-L2 di PBECs

Akhirnya, kami menyelidiki apakah IC87114 mempengaruhi virus yang diinduksi

Ekspresi PD-L1 dan PD-L2 dalam PBEC. Infeksi PBECs dengan

hMPV pada MOI 0,1 menginduksi ekspresi PD-L1 dan PDL2 pada 48 jam dan 72 jam pasca infeksi,
dan hMPV yang diiradiasi UV tidak

tidak meningkatkan ekspresi PD-L1 atau PD-L2 (Gambar 8A, S6). Serupa

untuk pengamatan di PBEC yang diobati dengan IC87114 plus poli I:C,

Ekspresi PD-L1 yang diinduksi hMPV ditekan dalam PBECs

diobati dengan IC87114 pada 48 jam pasca infeksi, sedangkan IC87114

peningkatan ekspresi PD-L2 yang diinduksi hMPV (Gambar 8B).

Ada hubungan linier antara ekspresi gen

protein nukleokapsid hMPV (hMPV N) dan diinduksi hMPV

IFNb, PD-L1, dan PD-L2 dalam sel yang diobati dengan atau tanpa

IC87114 (Gambar 8C). Perawatan dengan IC87114 mengubah

kemiringan garis regresi IFNb dan PD-L2 lebih besar, yang

menunjukkan induksi gen IFNb dan PD-L2 yang lebih efisien

responsif terhadap infeksi hMPV dalam sel yang diobati dengan IC87114.

DISKUSI

Aktivasi jalur PI3K terlibat dalam tumorigenesis paru-paru

(24). Oleh karena itu, penggunaan bronkial yang diturunkan dari kanker paru-paru

garis sel epitel seperti A549 mungkin tidak cocok untuk

menganalisis keterlibatan pensinyalan PI3Kd dalam antivirus IFN

tanggapan dan induksi molekul penghambat bersama oleh virus

infeksi. Oleh karena itu, kami menilai pengaruh IFN antivirus atau

PI3Kd pada ekspresi PD-L1 dan PD-L2 menggunakan PBEC. Kita

sebelumnya melaporkan bahwa poli I:C menginduksi ekspresi PD-L1 pada

sel epitel bronkus melalui jalur NF-kB (23). Hasil kami

menunjukkan bahwa IFN eksogen tipe I dan III juga dapat meningkat

PD-L1 dan PD-L2 dalam PBEC, dan IFN gabungan poli I:C

ekspresi PD-L1 dan PD-L2 yang ditingkatkan secara aditif. Itu

inhibitor PI3Kd selektif IC87114 serta dimediasi siRNA

knockdown gen PIK3CD meningkatkan ekspresi PDL2 yang diinduksi poli I:C, sedangkan IC87114
menekan poli I:C yang diinduksi

PD-L1 mungkin dengan menghambat induksi translasi PD-L1

melalui jalur Akt/mTOR. Perawatan dengan IC87114 juga

meningkatkan ekspresi gen IFN yang diinduksi poli I: C dan

IRG melalui peningkatan fosforilasi TBK1 dan IRF3. knockdown yang dimediasi siRNA dari gen IRF3
menetralkan

peningkatan poli I: C-diinduksi PD-L2 oleh IC87114,

menunjukkan bahwa PI3Kd secara negatif mengatur poli I: C-diinduksi

Produksi IFN dan induksi PD-L2 selanjutnya di PBEC

(Gambar 9). Kami selanjutnya mengkonfirmasi efek serupa dari IC87114 pada

Ekspresi PD-L1 dan PD-L2 dalam PBEC dari pasien dengan

asma atau PPOK dan setelah infeksi hMPV.

Studi sebelumnya menunjukkan bahwa IFN tipe I meningkatkan PD-L1

ekspresi pada sel endotel mikrovaskular, monosit, dan

sel dendritik (15, 16). Garcia-Diaz dkk. melaporkan bahwa IFNb

menginduksi ekspresi PD-L1 dan PD-L2 dalam sel melanoma

dan memberikan efek yang lebih kuat pada ekspresi PD-L2 melalui

pengikatan transduser sinyal dan aktivator transkripsi 3 ke

promotor PD-L2 (17). Di sini kami menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa

antivirus tipe I dan III IFNs menginduksi PD-L1 dan PD-L2 dalam
PBEC, dan induksi ini ditingkatkan dengan co-stimulasi

dengan IFN dan analog dsRNA virus. Mirip dengan kami

pengamatan, Hastings et al. juga melaporkan bahwa infeksi hMPV

pada tikus yang kekurangan reseptor IFN tipe I menginduksi PD-L1 . yang lebih rendah

ekspresi pada sel epitel paru-paru dibandingkan dengan tingkat di

tikus tipe liar (25). Pengenalan virus terkait

molekul oleh PRR inang setelah infeksi virus memediasi

induksi respon imun bawaan yang dicirikan oleh

produksi IFN dan IRG antivirus dan selanjutnya

pengembangan kekebalan adaptif terhadap virus (26, 27).

Penelitian telah menunjukkan bahwa sumbu PD-1/PD-L1 bertanggung jawab

untuk kelelahan sel T CD8+ dan kegagalan untuk mencapai pembersihan virus

pada infeksi virus pernapasan akut (4, 5). Namun, peran

PD-L2 dalam imunitas adaptif belum sepenuhnya dijelaskan. PDL2 tidak hanya mengikat PD-1 tetapi
juga molekul pemandu tolak b

(RGMb), dan interaksi PD-L2/RGMb meningkatkan respons CD4+ Thelper cell-1 (Th1) (28, 29). Pada
infeksi malaria, ekspresi PDL2 pada sel dendritik berkorelasi terbalik dengan penyakit

keparahan, dan PD-L2 meningkatkan CD4+ Th1 . spesifik parasit

tanggapan dan menghambat PD-L1 mengikat PD-1 (30). Ini

studi menunjukkan fungsi penghambatan bersama diferensial dari

PD-L1 dan fungsi co-stimulator PD-L2 dalam imunitas sel T.

Infeksi virus pada saluran napas adalah salah satu penyebab utama

asma dan PPOK eksaserbasi dan mempercepat penyakit

kemajuan (31, 32). Oleh karena itu, strategi antivirus menargetkan

patogenesis yang mendasari asma dan PPOK diperlukan.

Kami sebelumnya menunjukkan bahwa jalur NF-kB memainkan peran penting

peran dalam poli I: C yang diinduksi upregulasi PD-L1, dan IC87114

poli I: ekspresi PD-L1 yang diinduksi poli I: C yang dilemahkan dalam PBEC yang sehat

dengan menghambat induksi translasi PD-L1 melalui Akt/

jalur mTOR (14, 23). Dalam penelitian ini, kami mengamati

efek penekan IC87114 pada poli I: C-diinduksi PD-L1 in

PBECs dari pasien asma, tetapi bukan pasien dengan COPD.

Paparan kronis terhadap asap rokok merupakan faktor etiologi utama

dalam patogenesis PPOK dan dilaporkan menginduksi PD-L1

ekspresi dalam sel epitel bronkial manusia dan paru-paru murine

melalui reseptor aril hidrokarbon (33). Mekanisme spesifik etiologi yang mendasari upregulasi PD-L1

ekspresi mungkin menjadi alasan untuk penekan yang tidak memadai

efek IC87114 pada PD-L1 yang diinduksi poli I:C di PBEC dari

pasien dengan PPOK. Bertentangan dengan penekanan yang diinduksi IC87114

ekspresi PD-L1, IC87114 meningkatkan poli I: C– atau gen PD-L2 yang diinduksi hMPV dan ekspresi
protein dalam PBEC, mungkin

melalui peningkatan produksi IFN antivirus (Gambar 9). Kita

temuan, bersama dengan penelitian sebelumnya tentang peran PD-L1

dan ekspresi PD-L2 dalam imunitas sel T, menunjukkan bahwa a

inhibitor PI3Kd selektif dapat secara bersamaan meningkatkan

kekebalan antivirus dan adaptif dan mewakili

pengobatan infeksi virus pernapasan.

patogenesis yang asma dan PPOK diperlukan.

Kami sebelumnya menunjukkan bahwa jalur NF-kB memainkan peran penting

peran dalam poli I: C yang diinduksi upregulasi PD-L1, dan IC87114

poli I: ekspresi PD-L1 yang diinduksi poli I: C yang dilemahkan dalam PBEC yang sehat

dengan menghambat induksi translasi PD-L1 melalui Akt/

jalur mTOR (14, 23). Dalam penelitian ini, kami mengamati

efek penekan IC87114 pada poli I: C-diinduksi PD-L1 in

PBECs dari pasien asma, tetapi bukan pasien dengan PPOK.

Paparan kronis terhadap asap rokok merupakan faktor etiologi utama

dalam patogenesis PPOK dan dilaporkan menginduksi PD-L1

ekspresi dalam sel epitel bronkial manusia dan paru-paru murine

reseptor aril menantang (33). mekanisme spesifik etiologi yang menentukan regulasi PD-L1

ekspresi mungkin menjadi alasan untuk penekan yang tidak mencukupi

efek IC87114 pada PD-L1 yang diinduksi poli I:C di PBEC dari

pasien dengan PPOK. Bertentangan dengan penekanan yang diinduksi IC87114

ekspresi PD-L1, IC87114 meningkatkan poli I: C– atau gen PD-L2 yang diinduksi hMPV dan ekspresi
protein dalam PBEC, mungkin

melalui peningkatan produksi antivirus IFN (Gambar 9). Kita

temuan, bersama dengan penelitian sebelumnya tentang peran PD-L1

dan ekspresi PD-L2 dalam imunitas sel T, menunjukkan bahwa a

inhibitor PI3Kd selektif dapat secara bersamaan meningkatkan

kekebalan antivirus dan adaptif dan mewakili

pengobatan infeksi virus pernapasan.