MODUL VII

PENENTUAN KHM (KONSENTRASI HAMBAT MINIMUM) DENGAN

DILUSI (MIKRODILUSI)

A. Tujuan
1. Mampu mempraktekan penentuan aktivitas antibakteri dari zat uji
2. Mampu menentukan nlai KHM dari pengujian

B. Teori
Mikrodilusi dapat digunakan untuk menentukan KHM, yaitu konsentrasi
terkecil suatu antimikroba yang digunakan untuk menghambat
pertumbuhan mikroba. Metode ini cocok digunakan untuk melakukan
skrining aktivitas antimikroba karena metode ini lebih sensitif dan waktu
pengujian yang cukup singkat. Pengujian ini dapat memberikan hasil yang
kuantitatif jumlah antimikroba yang digunakan untuk mematikan bakteri.
Pengujian Mikrodilusi berisi antara 80 dan 100 (biasanya 96) sumur diisi
dengan volume kecil (biasanya 0,1 mL). Karena banyaknya sumuran,
sebanyak 12 hingga 15 agen antimikroba dapat terkandung dalam satu
plate yang kemudian akan diinokulasi dengan satu isolat bacterial. Faktor
pengenceran yang tergantung pada volume inokulum yang dikirimkan ke
masing-masing sumur oleh alat inokulasi.

C. Prosedur
Alat: Botol semprot, autoklaf, bunsen, cawan petri, mikroplate,
erlenmeyer, tabung reaksi, pinset, vial, mikropipet, tip, gelas kimia, gelas
ukur, pipet tetes, batang pengaduk, labu takar
Bahan : Aquades, media, MHB, alkohol 70%, spiritus, kapas, kasa,
mikroba uji, antibiotic uji

Prosedur:
a) Masukkan 100 µL Muehler Hilton Broth (MHB) pada kolom pertama
sebagai kontrol negatif media.
b) Tambahkan 100 µL larutan uji dengan konsentrasi tertentu pada
kolom ke-12 lalu dihomogenkan.
c) Kemudian diambil sebanyak 100 μL dari kolom ke-12 kemudian
dipindahkan ke kolom ke-11. Pengenceran terus dilakukan sampai
pada kolom ke-3 yang merupakan konsentrasi terkecil. Kolom ketiga
akan memiliki konsentrasi ekstrak terendah.
d) Tambahkan 5 µL suspensi bakteri uji ke dalam kolom nomor 2-12
lalu homogenkan(kolom 1 sebagai kontrol negatif)
e) Inkubasi pada suhu 37ᵒC selama 24 jam. Kemudian diamati adanya
bagian yang jernih (tidak ada pertumbuhan bakteri) tersebut
dinyatakan sebagai KHM.
f) Tentukan nilai KHM nya

Pengujian KBM

Sebanyak 5 μL alikuot dari setiap bagian yang jernih dipindahkan

dalam media agar dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam
kemudian diamati. Konsentrasi yang terendah tidak memperlihatkan
pertumbuhan bakteri ditetapkan sebagai Konsentrasi Bunuh
Minimum (KBM)