18

III. METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan mulai bulan Januari sampai Juli 2022 di
Laboratorium Analisis dan di Laboratorium Teknologi Hasil Pertanian Politeknik
Negeri Lampung. Uji ukuran partikel dan indeks polidispersitas di laboratorium
ILRC Universitas Indonesia, uji kadar gingerol di Balai Penelitian Rempah dan
Obat (Balittro) Bogor, dan uji mikrostruktur droplet di UPT LTSIT Universitas
Lampung.

3.2 Bahan dan Alat

Bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai
berikut:
3.2.1 Bahan
Bahan yang digunakan adalah jahe merah tua segar umur panen 10 bulan
yang diperoleh dari Adirejo-Jabung-Lampung Timur, aquades, Etanol 96%
(Merck®), Tween 80 (Merck®), heksan (Merck®), aseton (Merck®), methanol
(Merck®), DPPH (Himedia®), reagen folin ciocalteu (Merck®), sodium karbonat
(Merck®), asam galat (Sigma Aldrich®), dan kertas saring (Whatman®).

3.2.2 Alat
Alat yang digunakan adalah neraca analitik (Radwag-AS220.R2®), oven
(Memmert ®), hammer mill, inkubator (Memmert ®), hotplate magnetic stirrer
(Chimarec+®), vacuum rotary evaporator (B-ONE®), ultrasonicator type bath
(Branson 5800®), buret (Iwaki-pyrex®), erlenmeyer (Iwaki-pyrex®), beaker glass
(Iwaki-pyrex®), pipet ukur (Iwaki-pyrex®), labu ukur (Iwaki-pyrex®), gelas ukur
(Iwaki-pyrex®), tabung reaksi (Iwaki-pyrex®), mikro pipett (Dragon Lab®),
Spectrophotometer UV-Vis Single Beam (K-LAB®), Particle Size Analyzer
(Horiba SZ-100®), TLC Scanner (Camac TLC Scanner 3®), dan Scanning
Electron Microscope (SEM) (type ZEISS EVO MA 10®).
 19

3.3 Prosedur Penelitian

Penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) 4 perlakuan
dengan 3 kali ulangan. Perlakuan penelitian berdasarkan waktu sonikasi, mengacu
pada penelitian Anugraini, et al., (2018) dan Amilotussholihah (2020) yang telah
dimodifikasi. Perlakuan penelitian dapat dilihat pada Tabel 2. Tahap penelitian
yang akan dilakukan yaitu: persiapan sampel, ekstraksi rimpang jahe merah,
nanoemulsi oleoresin jahe merah, dan karakterisasi nanoemulsi oleoresin jahe
merah.

Tabel 2. Perlakuan dalam pembuatan nanoemulsi oleoresin jahe merah

N0 Kode Perlakuan
1 N0 Nanoemulsi dengan waktu sonikasi 0 menit
2 N30 Nanoemulsi dengan waktu sonikasi 30 menit
3 N60 Nanoemulsi dengan waktu sonikasi 60 menit
4 N90 Nanoemulsi dengan waktu sonikasi 90 menit

3.3.1 Persiapan Sampel

Jahe merah tua segar yang berumur 10 bulan dibersihkan dari tanah dan
kotoran kemudian dicuci dan diiris tipis-tipis dengan ketebalan 1-3 mm.
Selanjutnya dikeringkan menggunakan oven selama 48 jam suhu 50 °C sampai
diperoleh kadar air 12%. Jahe kering dihaluskan dengan menggunakan hammer
mill sampai menjadi serbuk dan diayak menggunakan ayakan 50 mesh. Rendemen
serbuk jahe kering dihitung berdasarkan pada persentase antara bobot serbuk jahe
yang didapat dengan bobot rimpang jahe segar. Menurut Rahmadani, et al. (2018)
untuk menghitung rendemen adalah sebagai berikut:

Rendemen serbuk jahe kering = x 100% .................. (1)

3.3.2 Ekstraksi Rimpang Jahe Merah

Metode ekstraksi menggunakan maserasi bertingkat yang telah
dimodifikasi dengan perbandingan serbuk dan pelarut yaitu 1:3 (b/v) (Rahmadani
et al., 2018) (Fakhrudin, et al., 2015). Serbuk jahe merah yang digunakan 100
gram dan pelarut etanol 96% 300 mL. Selanjutnya direndam selama 24 jam pada
suhu ruang disertai pengadukan setiap 6 jam kemudian disaring sehingga
diperoleh ampas dan filtrat. Ampas 1 dari penyaringan ditambah etanol 96% 300
 20

mL lalu direndam kembali selama 24 jam disertai pengadukan setiap 6 jam.

Maserasi dilakukan secara bertingkat sebanyak 3 kali. Selanjutnya, filtrat 1, filtrat
2 dan filtrat 3 dilakukan pencampuran. Hasil ekstraksi dipisahkan dengan
pelarutnya menggunakan rotary evaporator suhu 50 °C selama 60 menit sehingga
diperoleh ekstraksi kental/oleoresin jahe merah. Adapun diagram alir ekstraksi
dapat dilihat pada Gambar 1.

100 gr serbuk
jahe merah

Ethanol 96%
Maserasi selama 24 jam disertai
300 mL
pengadukan setiap 6 jam pada suhu ruang

Ampas 1 Penyaringan Filtrat 1

Maserasi

Penyaringan Filtrat 2

Ampas 2

Pencampuran
Maserasi Filtrat 3

Penyaringan Pemekatan dengan rotary

evaporator suhu 50˚C
selama 60 menit

Ampas 3
Oleoresin

Gambar 1. Diagram Alir ekstraksi jahe merah

 21

Hasil ekstraksi ditimbang dan diukur volumenya untuk perhitungan

rendemen ekstrak/kadar oleoresin. Menurut metode Guenther, kadar oleoresin
dinyatakan dalam volume per berat, sehingga perhitungannya berdasarkan berat
kering yaitu (Fakhrudin, et al., 2015):

Rendemen Ekstrak (kadar oleoresin) = x 100% ... (2)

3.3.3 Nanoemulsi Oleoresin Jahe Merah

Pembuatan nanoemulsi oleoresin jahe merah mengacu pada penelitian
Noor, et al., (2015) dan Asadinezhad, et al., (2019) yaitu menggunakan HEE
metode ultrasonikasi yang telah dimodifikasi. Diagram alir pembuatan nanoemulsi
ditunjukkan pada Gambar 2.

oleoresin jahe 50 mL, etanol 96%

100 mL dan Tween 80%: 5 ml

Penambahan aquades 345 mL secara perlahan disertai

pengadukan dengan kecepatan 750 rpm pada suhu ruang

Pengadukan kembali selama 60

menit 1500 rpm pada suhu 30 °C

Disonikasi selama 0, 30, 60 dan 90

menit suhu 30°C frekuensi 40 KHz

Disaring

Penguapan pelarut menggunakan hotplate

suhu 50 °C selama 30 menit

nanoemulsi

Gambar 2. Diagram alir proses nanoemulsi oleoresin jahe merah

 22

Oleoresin jahe merah (fase minyak) dilarutkan dalam etanol 96% (ko-
surfaktan) pada konsentrasi 50% (50 mL oleoresin jahe dalam 100 mL etanol).
Kemudian ditambahkan Tween 80 (surfaktan) sebesar 10% dari fase minyak yaitu
sebanyak 5 mL, selanjutnya ditambah aquades (fase air) secara perlahan sampai
diperoleh volume 500 mL (aquades yang ditambahkan sekitar 345 mL).
Nanoemulsi dibuat dengan mencampurkan fase minyak, ko-surfaktan,
surfaktan dan fase air dengan perbandingan yang telah ditentukan. Fase air
ditambahkan secara perlahan menggunakan buret ke dalam fase minyak, ko-
surfaktan dan surfaktan disertai pengadukan dengan kecepatan 750 rpm. Setelah
semua aquades ditambahkan, dilakukan pengadukan kembali dengan magnetik
stirer selama 60 menit, kecepatan 1500 rpm pada suhu 30 °C. Selanjutnya,
campuran tersebut ditempatkan dalam ultrasonikator tipe bath pada waktu yang
telah ditentukan dengan frekuensi 40 kHz dan suhu 30 °C. Kemudian hasil dari
proses tersebut disaring dengan kertas saring dan diuapkan sisa pelarut (etanol)
menggunakan hotplate pada suhu 50 oC selama 30 menit. Setelah dilakukan
pemisahan pelarut maka diperoleh nanoemulsi jahe merah.

3.3.4 Karakterisasi Nanoemulsi Oleoresin Jahe Merah

Adapun karakteristik nanoemulsi ekstrak jahe merah yang diamati dalam
penelitian ini adalah sebagai berikut:
a. Ukuran partikel dan indeks polidispersitas
Pengujian dilakukan dengan menggunakan PSA Horiba SZ-100. Sampel
dipipet 150 µl diencerkan menjadi 20 ml. Sebanyak 10 ml sampel dimasukkan ke
cuvette cell dan dimasukkan ke dalam holder pada alat PSA. Kemudian dilakukan
running menggunakan prinsip Dynamic Light Scattering (Nuryanti, et al., 2018).
b. Daya larut
Uji daya larut nanoemulsi oleoresin jahe merah dilakukan dengan
mencampur nanoemulsi dengan pelarut organik (1:1) dalam gelas ukur 10 ml dari
berbagai tingkat polaritas yaitu heksan, aseton, etanol, metanol dan aquadest.
Masing-masing fase pelarut organik kemudian diukur volumenya sebelum
dicampur dan setelah dicampur, pertambahan volume fase organik merupakan
nilai kelarutan (Jusnita & Syurya, 2019).
 23

c. Aktivitas antioksidan
Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan metode DPPH.
Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam nilai IC 50 atau konsentrasi yang mampu
meredam 50% radikal bebas DPPH. Pengujian dilakukan dengan cara membuat
larutan DPPH 50 ppm dalam metanol. Kemudian membuat larutan uji nanoemulsi
oleoresin jahe merah dengan 5 seri konsentrasi yaitu 200 ppm, 400 ppm, 600 ppm,
800 ppm dan 1000 ppm dari setiap sampel penelitian. Penentuan persen
penghambatan antioksidan ditentukan dengan mereaksikan larutan uji dan larutan
DPPH perbandingan 1:1 kemudian diinkubasi selama 30 menit suhu 370 C.
Selanjutnya, diukur absorbansi menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 517 nm. Persen penghambatan antioksidan dihitung dari nilai
absorbansi yang diperoleh dari pengujian dimasukkan dalam rumus persen
penghambatan (Atun, et al., 2020).

Aktivitas antioksidan DPPH = x 100% .................. (3)

Keterangan:
Abs kontrol = absorbansi DPPH
Abs sampel = absorbansi formula uji dan DPPH
Nilai IC50 dinyatakan sebagai Ln x pada persamaan regresi y = ax + b dari
kurva persen penghambatan antioksidan sebagai ordinat dan Ln konsentrasi
sebagai absis. Y adalah nilai 50, a dan b diperoleh dari persamaan regresi
(Faradisa, 2020).

d. Kandungan total fenol

Kandungan total fenol ditentukan menggunakan metode Follin ciocalteu
(Pratyaksa, et al., 2021). Pengujian dilakukan dengan membuat larutan standar
asam galat 5 seri konsentrasi yaitu 20 ppm, 40 ppm, 60 ppm, 80 ppm dan 100
ppm. Dari setiap konsentrasi tersebut diambil 400 µL dimasukkan dalam tabung
reaksi, ditambahkan 400 μL reagen Folin Ciocalteu, divortek dan diinkubasi
selama 6 menit lalu ditambahkan 4,2 mL larutan sodium karbonat 5%. Sampel
divortek dan diinkubasi selama 90 menit pada suhu ruang dan ruang gelap
kemudian diukur absorbansi pada panjang gelombang 760 nm. Selanjutnya
 24

sampel ditimbang sekitar 0,01 gram dilarutkan dengan aquadest sampai 10 mL

dalam labu ukur. Kemudian diperlakukan sama seperti sampel larutan asam galat.
Kandungan total fenol ditentukan menggunakan rumus persamaan regresi
asam galat, y = ax + b. yaitu y menunjukkan absorbansi, x menunjukkan
konsentrasi asam galat, a menunjukkan intersep dan b adalah konstanta. Total
fenol ditunjukkan sebagai mg ekuivalen asam galat/g sampel. Total fenol dapat
dihitung dengan menggunakan rumus:
( )
Total fenol ( )= x FP ............................ (4)

Keterangan :
X = Konsentrasi dari persamaan regresi linier kurva standar asam galat (mg/ml)
FP = Faktor pengencer

e. Kandungan gingerol
Sebanyak 0,5 gram sampel dimasukkan ke labu ukur 25 ml ditambah
dengan etanol sampai sepertiga labu. Selanjutnya dikocok dengan menggunakan
shaker selama 2 jam, ditera dan didiamkan selama 24 jam. Filtrat disaring
menggunakan kertas saring. 5 µl filtrat dispotkan ke atas plat alumunium silica gel
ukuran 20 x 20 cm yang telah dipanaskan dalam oven dengan suhu 105 0C selama
30 menit. Selanjutnya standar 6-gingerol 500 ppm dispotkan sebanyak 5 µl,
digunakan sebagai pembanding. Plat dimasukan kedalam chamber yang berisi
eluen heksan ; dietil eter dengan perbandingan 3: 7 sebanyak 30 ml kemudian
dielusi selama ± 45 – 60 menit sampai batas elusi ± 15 cm. Kemudian plat
dikering anginkan dan diukur dengan menggunakan alat TLC-Scanner pada λ=
282 nm. Untuk menghitung kadar gingerol menggunakan rumus:
( )
Kadar gingerol (%) = x 100% (5)

f. Mikrostruktur droplet
Untuk melihat mikrostruktur droplet nanoemulsi jahe merah menggunakan
Scanning Electron Microscopy (SEM). Sampel ditempelkan pada cell holder dan
disalut emas-paladium. Kemudian, SEM type ZEISS EVO MA 10 dioperasikan
dalam keadaan WD 8,5 mm, menggunakan signal A SE1, EHT 8 kV. Selanjutnya
 25

sampel diperbesar menggunakan perbesaran 5000, 10000, 15000, dan 20000 kali.
Gambar yang dihasilkan berupa mikrostruktur droplet nanoemulsi yang berupa
butiran dengan segala tonjolan, lekukan, dan lubang pada permukaan (Jayanudin
& Rochmadi, 2017) .

3.4 Metode Analisis Data

Data karakterisasi nanoemulsi oleoresin jahe merah yang meliputi ukuran
partikel, indeks polidispersitas, daya larut, aktivitas antioksidan dan kandungan
total fenol diolah dengan sidik ragam untuk mengetahui pengaruh perlakuan
terhadap parameter yang diuji menggunakan ANOVA pada taraf kepercayaan (P)
≤ 0,05. Selanjutnya, untuk mengetahui perlakuan mana yang berbeda dilakukan
uji lanjut menggunakan uji BNJ. Sedangkan untuk kadar gingerol dan
mikrostruktur droplet dianalisis secara deskriptif.