SUBKULTUR

PENDAHULUAN
Setelah melakukan kultur primer, apabila sel telah

mencapai confluency (tumbuh dan menyebar memenuhi permukaan substrat), maka harus dilakukan sub-kultur dan menghasilkan kultur sekunder
Bagaimana bila tidak disubkultur?
Kemampuan mitotik sel menurun
Sel akan mati

Kultur sekunder dipantau pertumbuhan dan diperbaharui

medianya, apanila diperlukan dapat dilakukan subkultur kembali sehingga diperoleh kultur tersier danseterusnya.
Waktu antar subkultur bervariasi tergantung pada laju

pertumbuhan dan tipe sel

PENDAHULUAN
Bagaimanakah prosedur subkultur? 1. Sel dilepaskan dari substrat kultur primer/sekunder secara enzimatik dan mekanik. 2. Sel yang diperoleh dibagi dua kemudian ditumbuhkan dalam media segar. Catatan pada saat melakukan subkultur: Semua larutan dan peralatan kultur harus steril Anda harus berhati-hati pada saat melakukan kultur sel darah, sel tubuh, dan agensia yang dapat menimbulkan infeksi pada manusia gunakanlah biosavety procedures dengan baik.

SUBKULTUR SEL DARI MONOLAYER

Tahapan kerja Pelepasan sel dari substratnya Pembagian dan penanaman kembali Pemeliharaan kultur Prosedur kerja tambahan Pembekuan sel monolayer Thawing dan rekaveri sel Perhitungan jumlah sel Persiapan sel untuk transportasi

Passaging atau sub-culture

Cell dissociated from flask

Split 1 in 2

Prosedur subkultur
Bahan dan alat: Sel dari kultur primer Medium HBSS tanpa Ca2+ dan Mg2+ , 37C Larutan tripsin/EDTA, 37C Medium kultur lengkap (dengan suplemen), 37C Pipet pasteur steril Waterbath atau baki pemanas, 37C Cawan kultur steril (dari plastik maupun kaca)

Prosedur subkultur
Cara kerja
1. 2.

Ambillah medium dari kultur primer menggunakan pipet steril. Bilaslah sel monolayer menggunakan medium HBBS tanpa Ca2+ dan Mg2+ untuk menghilangkan sisa FBS yang dapat menghambat aktivitas tripsin. Tambahkan larutan tripsin/EDTA 37C hingga menutupi seluruh sel monolayer. menit; ketukkan dasar cawan kultur ke atas meja agar selsel monolayer terlepas dari substrat.

3.

4. Letakkan cawan kultur di atas baki pemanas selama 1-2

Prosedur subkultur
5.

Amati sel di bawah mikroskop (lebih baik menggunakan inverted microscope) untuk memastikan bahwa sel telah terlepas dari substratnya.

Apabila sel belum terlepas dari substrat, letakkan kembali cawan kultur di atas baki pemanas

6. Tambahkan 2 mL medium kultur lengkap, bilaslah sel

monolayer dengan memipet suspensi sel beberapa kali.

Segera tambahkan medium kultur lengkap setelah sel terlepas dari substrat untuk menghindari over digest oleh tripsin.

7.

Pindahkan suspensi sel ke cawan kultur steril berisi medium kultur lengkap hingga kepadatan ~5x104 sel/mL; cantumkan tanggal dilakukannya subkultur dan tingkat subkultur (subkultur ke berapa?)

Prosedur subkultur
8. Inkubasi sel pada temperatur 37C, CO2 5% dan

kelembaban optimum.
9. Apabila diperlukan dapat dilakukan penggantian

medium setelah 3-4 hari.

10. Apabila kultur sekunder telah mencapai confluency,

dapat dilakukan subkultur kembali dengan mengulang langkah kerja 1-8.

SUBKULTUR SEL DARI SISTEM SUSPENSI

Tahapan subkultur dari sistem suspensi sedikit lebih mudah dari sistem monolayer; karena sel sudah berada dalam suspensi sehingga tidak memerlukan proses enzimatik.
1.

Sel harus diberi nutrisi setiap 2-3 hari sekali hingga mencapai confluency (ditandai dengan medium yang tampak lebih turbid). Keluarkan botol kultur dari inkubator, biarkan selselnya mengendap. Ambillah 1/3 medium secara aseptis dan ganti dengan medium segar yang telah diekuilibrasi. Usahakan agar kepadatan sel 106 sel/mL. Resuspensi sel dan inkubasi kembali

SUBKULTUR SEL DARI SISTEM SUSPENSI

2.

Pada saat tidak dilakukan penambahan medium, periksa kondisi sel dengan mengagitasi botol kultur secara halus untuk meresuspensi sel. Amati perubahan warna medium.
Apabila sel telah mencapai confluency (kepadatan ~2,5 x 106 sel/mL, lakukanlah sub kultur.

3.

keluarkan botol kultur dari inkubator dan suspensikan sel.

Secara aseptis ambillah setengah dari suspensi sel dan masukkan ke dalam botol kultur baru.
Tambahkan 7-10mL medium segar yang telah diekuilibrasi kedalam masing-masing botol kultur dan masukkan botol kultur ke dalam inkubator

PEMBEKUAN SEL MONOLATER

Bahan dan alat:

(dari sampel manusia)

Kultur monolayer (dalam petri) pada fase-log Medium kultur lengkap

Freezing mediumL medium lengkap ditambah dengan

10-15% (v/v) FBS dan 5-10% (v/v) DMSO, 4C centrifuge

Prosedur kerja
1. Lepaskan sel monolayer menggunakan tripsin 2. Pindahkan suspensi sel ke dalam tabung centrifuge steril

dan tambahkan 2 mL medium kultur lengkap, centrifugasi selama 5 menit pada 300-350 xg dalam temperatur ruang

PEMBEKUAN SEL MONOLATER

Prosedur kerja
3.

(dari sampel manusia)

Ambil supernatan dan tambahkan 1 mL freezing medium 4C, dan resuspensi sel.
sel kemudian tempatkan di atas es.

4. Tambahkan 4 mL freezing medium 4C dan homogenkan 5.

Hitung jumlah sel menggunakan haemocytometer. Encerkan sel dengan freezing medium hingga kepadatannya mencapai 106-107 sel/mL. kecangkan tutupnya.

6. Masukkan 1 mL suspensi sel ke dalam cryovial dan

7.

Letakkan cryovial dalam freezer -70C selama semalam kemudian pindahkan ke dalam nitrogen cair

PEMBEKUAN SEL MONOLATER

(dari sampel manusia)

Prosedur kerja 8. Catatlah identitas sel, tanggal pembekuan dan lokasinya dalam penyimpanan sehingga memudahkan pencarian pada saat dibutuhkan.

Centrifuge tubes Container nitrogen cair

cryovial

 Sel-sel yang disimpan beku dan akan digunakan untuk

penelitian harus dibawa kembali ke temperatur ruang (thawing) dengan cepat dan dikultur dengan kepadatan tinggi untuk memperbesar rekaveri sel.
Pada saat mengeluarkan sel dari nitrogen cair, gunakan

akat pelindung dengan baik seperti jas lab, google, dan sarung tangan insulator. Jangan sampai anda terpercil nitrogen cair karena akan berefek seperti terbakar.
Ruangan tempat menyimpan kontainer nitrogen cair harus

memiliki ventilasi yang cukup.

Bahan dan alat: Larutan ethanol 70% Medium kultur lengkap Prosedur kerja: 1. Keluarkan vial dari nitrogen cair dan segera letakkan dalam waterbath 37C sambil diagitasi hingga medium mencair. Biasanya medium akan mencair dalam waktu <1 menit thawing harus dilakukan dengan cepat untuk menghindari terbentuknya kristal es dan terjadinya lisis
2. Sebelum vial dibuka, usaplah tutup vial dengan ethanol

70%

Prosedur kerja
3. Pindahkan suspensi sel dari step 2 ke dalam tabung centrifuge berisi 2

mL medium hangat dengan 20%FBS, centrifugasi selama 10 menit pada 150-200 x g, pada temperatur ruang, kemudian buang supernatan.
4. Bilaslah DMSO dengan medium kultur segar, dan resuspensi dalam

~1mL medium dengan 20%FBS. Tanamkan pada medium kultur lengkap.

5. Amati setelah 24 jam untuk melihat keberhasilan perlekatan sel ke

substrat kultur.
6. Gantilah medium pada hari ke 5 atan 7 dengan medium yang

mengandung 20%FBS hingga kultur berhasil tumbuh.