VITAMIN A DALAM MINYAK ATAU

LEMAK: METODE CEPAT CARR PRICE

PRINSIP
Vitamin A bereaksi dengan antimony triklorida membentuk warna biru
yang dapat diukur intensitasnya dengan spektrofotometer.

PEREAKSI
1. Pereaksi antimon triklorida.
2. Kloroform dicuci dengan sejumlah volume air yang sama dua atau tiga
kali, kemudian bebas airkan dengan potassium karbonat anhydrous.
3. Didistilasi, 10% destilat yang pertama dibuang. Selama pengeringan
dengan potassium karbonat dan distilasi, kloroform dihindarkan dari
cahaya.
4. Antimony triklorida dicuci dengan kloroform murni bebas air sampai
cucian jernih.
5. Larutan jernih antimony klorida yang sudah dicuci dibuat dalam
kloroform murni bebas air. Larutan ini mengandung 21-23% (w/v) SbCl 3
lalu disimpan dalam botol berwarna coklat dan ditutup rapat.
6. Untuk menguji kandungan SbCl3 , 1 ml larutan SbCl3 dicampur dengan 2
g sodium potassium tartrat dalam 20 ml air. Ditambahkan 2 g sodium
bikarbonat dan dititrasi dengan larutan Iod 0.1 M (1 ml Iod 0.1 M =
0.01141 G SbCl3).

CARA KERJA
Jika lemak/minyak diduga mengandung vitamin A dalam jumlah tinggi, maka
dapat langsung digunakan. Lemak/minyak dilarutkan dalam kloroform hingga
konsentrasinya 20% (w/v).

Untuk sampel yang kadar vitamin A-nya tidak tinggi maka perlu dilakukan proses
saponofikasi seperti pada prosedur penetapan vitamin A pada margarin, dan
bahan yang tidak tersabunkan diekstrak dengan kloroform.

4 ml pereaksi antimon triklorida dicampur dengan 1 ml kloroform lalu dicampur

merata. Larutan ini digunakan sebagai blanko.

0.5 ml larutan yang mengandung vitamin A (dari tahap 1) dicampurkan dengan 2

ml pereaksi antimony triklorida lalu dicampur secara merata.

Absorbansi warna yang terbentuk pada panjang gelombang 620 nm diukur. Kardar
vitamin A dalam sampel ditentukan berdasarkan kurva standart yang telah dibuat
sebelumnya. Membuat kurva standart hubungan absorbansi dengan konsentrasi
vitamin A asetat dengan kisaran 0-15 U per ml.

VITAMIN B1 : METODE
HPLC

PRINSIP
Vitamin B1 diekstrak dari bahan makanan dengan
hidrolisis asam. Perlakuan dengan papain dilakukan untuk
menghilangkan senyawa pengganggu analisis berupa
protein, sedang perlakuan yang diastase dilakukan untuk
membebaskan vitamin dari bentuk fosfatnya.
PEREAKSI
1. Asam sulfat 0.25 N.
2. Larutan buffer.
3. Takadiastase.
4. Asam trikloro asetat.
5. Merckosorb SI 60.
6. Larutan stok tiamin standart, 500 g/ml.
7. Larutan kerja tiamin standart, 4 g/ml.

 PERALATAN
a. Oktoklaf
b. Penangas air
c. Sentrifus
d. Tabung sentrifus
e. Peralatan untuk HPCL. Bagian yang harus ada:
Pompa bertekanan tinggi
Sampler
Kolom logam
Sample loop, 60 l.
Detector fluorimeter dengan sampel, panjang
gelombang eksitasi 366 nm, emisi 464 nm.
f. Pompa pengatur

CARA KERJA
1. Sampel yang mengandung 0.5 g padatan ditimbang dan dimasukkan ke dalam
tabung sentrifus 50 ml.
2. Ditambahkan akuades menggunakan pipet Mohr sampai kandungan air total
menjadi 2 g.
3. 2 ml larutan kerjatiamin standart dipipet dan dimasukkan ke dalam sebuah
tabung sentrifus lainnya.
4. Masing-masing tabung ditambahkan 10 ml asam sulfat 0.25 N.
5. Tabung-tabung ditutup dengan alumunium foil.
6. Dipanaskan dalam oktoklaf pada 1210C selama 15 menit.
7. Didinginkan dan ditambahkan 1.5 ml larutan buffer lalu dikock sampai pH
mencapai 4.6.
8. Ditambahkan 1 ml suspense takadiatase dan dikocok merata.
9. Tabung diletakkan dalam penangas air bergoyang pada 40 0C selama 25 menit.
10.Ditambahkan 1 ml larutan papain, dikocok merata dan dilanjutkan pemanasan
selama 2 jam pada 40-450C.
11.Ditambahkan 2 ml asam trikloro asetat
12.Tabung dipanaskan selama 5 menit dalam penangas air 50-60 0C.
13.Sentrifus tabung selama 5 menit pada kecepatan 300000 x g
14.Diinjeksi secara manual 60 g. supernatant kedalam kolom HPCL atau secara
otomatis.
15.Kromatografikan dengan kecepatan aliran 1ml per menit dan ditambahkan
pereaksi ferisianida basa dengan kecepatan aliran 0.3 ml per menit.

 PERHITUNGAN
Misalkan : tinggi puncak sampel = h
Tinggi puncak standart = H
Berat sampel (g)
=W
Maka:
Kadar tiamin dalam sampel (mg/100
mg) sebagai tiamin klorida HCl = (8 x
h x 100) / W x H x 1000 = 0.8 H/ W x H

VITAMIN B6 : METODE
MIKROBIOLOGIS

 PRINSIP
Vitamin B6 diekstrak dari makanan dengan menggunakan asam.
Sesudah pengenceran secukupnya, kadar vitamin B6 ditentukan
secara nefelometrik dengan menggunakan pertumbuhan khamir
Saccharomyces carlsbergensis yang mempunyai pertumbuhan
spesifik terhadap vitamin B6 pada kondisi yang terkontroldan
mempunyai aktivitas vitamin B6 total.
PEREAKSI
a. Medium peridoksin
b. Asam sulfat 0.44 N.
c. Larutan NaOH 0.4 N.
d. Larutan stok periodoksin standart (A) , 10 g/ml. melarutkan
122 gr piriidoksin hidroklorida dalam 1 liter etanol 25%.
Simpan refrigerator sampai waktu diperlukan.
e. Organisme penguji Saccharomyces carlsbergensis

CARA KERJA
Ekstraksi
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

0.5-15 g sampel ditimbang dalam gelas piala 400 ml.

Ditambahkan 180 ml H2SO4 0.44 N.
Gelas piala ditutup dengan alumunium foil.
Dioktoklaf selama 5 jam pada suhu 121 0C.
Didinginkan dengan penangas air
Ditambahkan 20 ml NaOH 4 N
pH diatur menjadi 4.5 dengan menggunkan larutan NaOH 1 N dan
0.1 N menggunakan pH meter lalu bilas elektroda dengan air
8. isi gelas dipindahkan kedalam labu takar 250 ml, ditepatkan sampai
tanda tera dengan air.
9. Disaring menggunakan kertas saring.
10.Simpan filtrate dalam refrigerator sampai waktunya diperlukan.
11.Encerkan filtrate bila perlu hingga mengandung peridoksin kira-kira
50 g/ml.
12.Blanko dibuat dengan cara yang sama seperti sampel.

 Persiapan Larutan Assay

5 ml larutan stok periodoksin standart diencerkan menjadi 500 ml dengan air .
Diambil 5 ml larutan ini dan diencerkan menjadi 100 ml yang disebut sebagai larutan
kerja periodoksin standart (Pipet 0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, dan 0.2) dan dimasukkan
masing-masing kedalam tabung assay.
0.05, 0.10, dan 0,20 alikuot ekstrak sampel dipipet dan dimasukkan masing-masing
kedalam tabung assay.
Dengan menggunakan dispenser yang disesuaikan, 5 ml medium double strength
ditambahkan kedalam masing-masing tabung assay.
5 ml medium dimasukkan kedalam tabung assay berisi blanko.

Masing-masing tabung ditutup dengan polipropilen.

Dioktoklaf selama 5 menit pada suhu 1210C.

Tabung dipindahkan dari oktoklaf, didinginkan sampai suhu 30 0C dalam penangas air.

 Persiapan inoculum
Sel Saccharomyces carlsbergensis
dipindahkan dari agar miring kedalam
tabung yang mengandung 5 ml medium
peridoksin Y double strength steril.

Diinkubasi selama 20 jam pada suhu

antara 28-300C.

Inoculum disiapkan dengan

mengencerkan subkultur dengan medium
double strength steril sampai terbaca
angka 50 skala Perspex standart pada
alat nefelometer.

 Inokulasi dan inkubasi tabung

Isi pipet 10 ml steril dengan inoculum.

Tabung assay pertama dibuka tutupnya.

Ditambahkan hanya satu tetes inoculum kedalam tabung dan
ditutup kembali dengan cukup longgar.
Proses tersebut diulangi pada tabung assay lainnya kecuali blanko.

Tabung assay ditempatkan pad incubator pada posisi miring.

Diinkubasi selama 2-22 jam pada suhu 300C

Ditambahkan 7 ml air pada masing-masing tabung.

 Pengukuran Pertumbuhan
Masing-masing tabung assay dikocok dengan vortex.

Tabung blanko yang tidak diinokulasi ditempatkan kedalam

alat nefolometer, lalau diatur pada pembacaan nol.

Tabung assay yang mengandung 0.2 ml larutan standart

ditempatkan kedalam alat dan jarum penunjuk pembacaan
diatur pada 95-100% skala penuh.

Kekeruhan tabung assay lainnya diukur.

 PERHITUNGAN
a. Kurva standart yang menghubungkan hubungan pembacaan
pada alat nefolometer dibuat dengan jumlah ng peridoksin
per tabung untuk standart.
b. Jumlah peridoksin ditentukn masing-masing pasangan tabung
assay x1, x2, x3. Jika ml alikuot yang diambil untuk assay
berturut-turut v1,v2, dan v3 maka konsentrasi perisoksin=
(x1/v1 x x2/v2 x x3/v3) / 3 = ng/ml
Jika berat sampel = W
Volume ekstrak = V
Maka kadar piridoksin (mg/100g) =
(W x 102)
= axV
W x 104

(a x V x 10 2)

VITAMIN B12 : METODE MIKROBIOLOGIS

 PRINSIP
Vitamin B12 dipisahkan dari makanan dengan menggunakan larutan
buffer asetat pada pH 4.5. Kobalamin yang dibedakan tidak stabil,
dengan penamaan sodium siamida dapat diubah menjadi sianokobalamin
yang stabil. Kadar vitamin B12 ditetapkan secara nefelometrik
dengancara menumbuhkan Lactobacillus leichmanii.
PEREAKSI
1. Buffer asam asetat
2. Larutan sodium sianida 1%
3. Media assay vitamin B12
4. Micro inoculum broth
5. Larutan stok vitamin B12 standart
6. Organisme penguji Lactobacillus leichmanii.
. PERALATAN
1. Tabung reaksi assay
2. Penangas air
3. Kertas saring Whatman

Cara Kerja

Ekstraksi
Bahan ditimbang 0.25-5 g.
Ditambahkan 20 ml larutan buffer asetat dan 2 tetes
larutan sodium sianida.
Tabung ditutup dengan alumunium foil.
Direndam dalam penangas air suhu 1000C selama 30
menit.
Didinginkan dan ekstrak diencerkan dengan air
menjadi 50 ml.
Disaring dengan kertas Whatman.
Jika diperlukan filtrate dapat disimpan di refrigerator
selama semalam

 Persiapan Inokulum
Regenerasi bakteri Lactobacillus leichmanii selama semalam,
dipindahkan dari agar miring kedalam tabung yang mengandung 5
ml micro inoculum broth steril.
Diinkubasi selama semalam pada suhu antara 370C.

Dikocok merata, dipindahkan 1 tetes secara septic kedalam 5 ml

medium Vitamin B12.

Diinkubasi selama 6 jam pada suhu antara 370C.

dipindahkan 1 tetes dengan pipet steril kedalam 10 ml media assay.

 Persiapan larutan assay

1. diambil 2 ml dari larutan stok standart A, ditambahkan 2
tetes sianida kemudian diencerkan menjadi 1000 ml dengan
air hingga didapat standart B.
2. 4 ml standart B diencerkan menjadi 100 ml sehingga
didapat standart C.
3. 0.05, 0.1, 0.2, dan 0.25 ml larutan C dipipet dan
dimasukkan masing-masing pada tabung assay.
4. Ekstrak sampel dari bahan ekstraksi diencerkan untuk
mendapatkan konsentrasi vitamin B12 mendekati 0.80 ng.
5. 0, 0.05, 0.1, dan 0.2 ml alikuot ekstrak dimasukkan kedalam
masing-masing tabung assay.
6. Dengan menggunakan dispenser, masing-masing tabung
assay ditambahkan 10 ml media single strength.
7. 10 ml media dimasukkan kedalam 5 tabung assay lain.
8. Seluruh tabung ditutup.
9. Dioktoklaf pada 1210C selama 5 menit.
10.Didinginkan dengan penangas air sampai dibawah 30 0C.

 Inokulasi dan inkubasi tabung

Longgarkan tutup tabung

Isi pipet 10 ml steril dengan inoculum.

Tabung assay pertama dibuka tutupnya.

Ditambahkan hanya satu tetes inoculum kedalam tabung dan
ditutup kembali dengan cukup longgar.
Proses tersebut diulangi pada tabung assay lainnya kecuali blanko.

Diinkubasi selama 22 jam pada suhu 370C.

 Pengukuran Pertumbuhan
Masing-masing tabung assay dikocok dengan vortex.
Tabung blanko yang tidak diinokulasi ditempatkan
kedalam alat nefolometer, lalau diatur pada
pembacaan nol.
Tabung assay ditempatkan kedalam alat pada standart
tertinggi dan pembacaan jarum penunjuk diatur pada
95-100% skala penuh.
Kekeruhan tabung assay lainnya diukur.

 PERHITUNGAN
a. Kurva standart yang menghubungkan hubungan pembacaan
pada alat nefolometer dibuat dengan jumlah ng peridoksin
per tabung untuk standart.
b. Jumlah peridoksin ditentukn masing-masing pasangan tabung
assay x1, x2, x3. Jika ml alikuot yang diambil untuk assay
berturut-turut v1,v2, dan v3 maka konsentrasi perisoksin=
(x1/v1 x x2/v2 x x3/v3) / 3 = ng/ml
Jika berat sampel = W
Volume ekstrak = V
Maka kadar piridoksin (mg/100g) =
(W x 102)
= axV
W x 104

(a x V x 10 2)

VITAMIN C/ ASAM ASKORBAT : METODE OKSIDIMETRI

PRINSIP
Indofenol dye yang berwarna biru dalam basa dan merah dalam asam
diresuksi oleh asam askorbat membentukdehidro-asam askorbat dan
indofenol tereduksi yang tidak berwarna.
PEREAKSI
1. HPO3 3%
2. Asam askorbat standart
3. Larutan dye
. PERALATAN
1. Mikroburet
2. Pipet ukur
3. Labu ukur
4. Labu Erlenmeyer
5. Gelas ukur
6. Blander
7. Kertas saring

CARA KERJA

Standardisasi larutan dye

Mikrobiuret diisi dengan larutan dye.

5 ml larutan standart asam askorbat dipipet kedalam labu

Erlenmeyer kemudian ditambah dengan 5 ml HPO3 3%

Titrasi dengan larutan dye sampai merah jambu

Faktor dye dihitung dengan rumus:

Faktor dye = 0,5

Titer

 Persiapan sampel
Sari buah:

dipipet 10-20 ml sampel

kedalam labu ukur 100
ml, HPO3 3% diencerkan
sampai tanda tera.
Kemudian disaring atau
disentrifus.

Makanan
padat atau
semi padat:
sampel ditimbang 100
g, diaduk dengan 50-60
ml HPO3 3% dalam
blender, diencerkan
sampai volume 100 ml
dengan HPO3 3%.
Kemudian disaring atau
disentrifus.

 Pengujian ekstrak sampel

2-10 ml ekstrak sampel diambil

Dititrasi dengan larutan dye sampai tercapai titik akhir hingga

warna merah jambu bertahan 15 detik.

Langkah 1 diulangi kemudian dititrasi dengan dye dengan cara

menambahkan hamper semua dye yang dibutukan, kemudian
dititrasi sampai titik akhir.

Apabila didalam sampel yang diuji terdapat

S02, indofenol yang terdapat dalam dye akan
tereduksi yang membuat nalisa tidak tepat
lagi. Sehingga perlu dilakukan kalibrasi
menggunakan prosedur kondensasi
Formaldehit:
1. 10 gr filtrate dimasukkan dalam labu
Erlenmeyer 50 ml.
2. Ditambahkan 1 ml formaldehid 40% dan
0.1 ml HCL.
3. Didiamkan selama 10 menit.
4. Dititrasi seperti langkah sebelumnya.

Vitamin C. Cara titrasi Yodium (Jacobs)

Bahan ditimbang 200-300 g dan dihancurkan dalam Waring blender
sampai diperoleh slurry.
Slurry ditimbang sebanyak 10-30 g dan dimasukkan ke dalam labu
takar 100 ml dan ditambahkan akuades sampai tanda.
Saring dengan krus Gooch atau dengan sentrifug untuk memisahkan
filtratnya.
2-25 ml filtrate diambil dengan pipet dan dimasukkan ke dalam
Erlenmeyer 125 ml.
Ditambahkan 2 ml larutan amilum 1% (soluble starch) dan
ditambahkan 20 ml akuades kalau perlu.
Dititrasi dengan 0.01 N standart yodium

Perhitungan:
1 ml 0.01 N Yodium = 0,88 mg asam
askorbat.

VITAMIN C
Vitamin C. Cara 2,6 D (AOAC)
Air buah diperas atau disaring secara langsung atau menghancurkan
dalam waring blender dan disaring melalui kertas saring yang kasar.
Menukur volume cairan atau berat bahan mula-mula.

Mengambil 100 ml filtrate dan menambahkan 100 ml reagen HPO3

asam asetat. Menggojog sampai aliquot merata dan menyaring
melalui kertas saring.

Mengambil 10 ml aliquot dan dititrasi dengan larutan 2,6 yang telah

distandardisasi dan membuat titrasi blanko (mengganti cairan contoh
dengan aquades). Membuat 3 kali ulangan.

Menghitung dari titrasi terkoreksi (titasi sesungguhnya titrasi

blanko) dan menyatakan jumlah vitamin C sebagai mg/100 ml cairan
bahan mula-mula atau tiap 100 g berat bahan mula-mula. Jangan
lupa memperhitungkan faktor pengenceran.

 Standardisasi Larutan 2,6 D

Menimbang dengan teliti lebih kurang 100 mg standard asam
askorbat (vitamin C) dan dipindahkan ke dalam labu takar 50
ml, kemudian diencerkan dengan reagen HPO3- asam asetat
sampai tanda.
Memindahkan 2 ml aliquot asam askorbat trsebut ke dalam
Erlenmeyer 50 ml yang telah diisi dengan 5 ml reagen HPO3asam asetat.
Menitrasi dengan larutan 2,D dari buret 50 ml sampai warna merah
jambu terbentuk yang tidak hilang selama 5 detik. Mengulangi
titrasi ini 3 kali (dari 2 ml aliquot asam askorbat).

Membuat 3 larutan blanko (mengganti 2 ml aliquot asam askorbat

dengan 2 ml aquades) dan dititrasi dengan larutan 2,6 D.

Menghitung equivalen titrasi terkoreksi (titrasi sesungguhnyatitrasi blanko) yang menunjukkan 1 ml larutan 2,6 D dengan
jumlah mg asam askorbat.