BIOTEKNOLOGI

FARMASI

YELLY HIDAYANI (1501053)

YOLLA JUFANDA (1501055)
CICI ANGRAINI (1501060)
DIAN SANITA PUTRI (1501064)
Bioteknologi farmasi

Bioteknologi dapat di artikan sebagai ilmu yang

digunakan untuk memindahkan gen manusia ke
sel bakteri, agar bakteri mampu memproduksi protein
manusia bagi penderita defisiensi protein contohnya
insulin untuk pasien diabetes.
Apa itu sekuensing DNA…?

Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah

proses atau teknik penentuan urutan basa nukleotida
pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai
sekuens DNA, yang merupakan informasi paling
mendasar suatu gen atau genom karena mengandung
instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh
makhluk hidup.
 Metode penentukan urutan basa nukleotida,
sekuensing adenin, guanin, citosin, timin pada sepotong
DNA

Urutan basa Urutan asam Struktur protein

Nukleotida amino dan fungsinya

Perubahan
Perubahan sekuensing Protein non
sekuensing fungsional
DNA
Sejarah sekuensing DNA
Mempublikasikan sekuens tRNA alanin
dari khamir yang terdiri atas 77
ROBERT HOLLEY nukleotida selama 7 tahun dan hasilnya
(1965) Cornel University merupakan sekuens DNA yang pertama
di New York, Amerika kali dipublikasikan adalah DNA
Serikat sepanjang 12 nukleotida dari bakteriofag
lambd (1971)
Federick Sanger dan Mempublikasikan metode sekuensing DNA
Alan Coulson (1975) secara langsung disebut teknik plus minus.
medical research Dan berhasil melakukan sekuensing DNA
council Inggris
sebagian besar genom bakteriofog
sepanjang 5.375 nukleotifa dan dipublis
Februari 1977, Alan pada tahun 1977
Maxam dan Waltert
gilbert dari Harvard Mempublikasikan sekuensing DNA mereka
University
Prinsip dasar sekuensing DNA

DNA sekuensing menggunakan metode PCR

(Polymerase Chain Reaction) sebagai
pijakannya

DNA yang akan ditentukan urutan basa

ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan
(template)

Kemudian diamplifikasi menggunakan enzim

dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi
PCR

Namun ada penambahan beberapa pereaksi

tertentu seperti buffer, dNTPs, dan ddNTP.
Proses ini dinamakan cycle sequensing
KOMPONEN-KOMPONEN SEQUENSING
Metode sekuensing DNA

Maxam Gilbert Next Generation

Method Sequensing
(REAKSI KIMIA)

Sanger Method
(REAKSI
ENZIMATIK)
Maxam Gilbert Method
(REAKSI KIMIA)
Metode Maxam Gilbert Method
(REAKSI KIMIA)
• Metode pengakhiran rantai (chain termination) dan
degradasi kimia.
• Didasarkan pada pembelahan nukleotida oleh bahan
kimia yang spesifik.
• Tidak mmerlukan DNA untai ganda sehingga tidak
memerlukan primer untuk mensintesi untai baru kembali.
• Pemotongan DNA terjadi secara kimia sehingga reagen
kimia tertentu harus ditambahkan kedalam sistem reaksi.
SENYAWA KIMIA METODE
MAXAM- GILBERT

Dimetil sulfat Hidrazin

Asam format
Piperidin
Tahapan Metode Maxam Gilbert
• Sekuen molekul DNA untai ganda yang akan digunakan dipotong bagian
posisi katan antara fosfat dan guladeoksiribosa menggunakan piperidin
• Fragmen DNA diberilabel pada salah satu ujungnya atau pada nukleotida
3’ menggunakan fosfat radioaktif
• Basa dimodifikasi dengan spesifik menggunakan bahan kimia tertentu.
a. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G
b. Asam format menyerang A dan G
c. Hidrazin akan menghidrolisis C dan T
d. Hidrazin, piperidin dan garam bekerja pada C
• Kemudian akan diperoleh empat fragmen yang berbeda masingmasing
ujungnya adalah G, A atau G, C atau T dan C.
• Dilihat laju migrasi masing-masing fragmen dalam bentuk pita. Dengan
cara membandingkan lajur pertama dan kedua, serta lajur ketiga dengan
keempat.
• Diurutkan berdasarkan lajur migrasinya dari yang terkecil ke yang besar.
KELEBIHAN DAN KEKURANGAN

KELEBIHAN KEKURANGAN
• Dapat digunakan baik • Memiliki Tekhnik yang
untuk DNA ganda Rumit
maupun tunggal • Menggunakan Bahan
Kimia yang berbahaya
• Menghasilkan fragmen seperti hydrazine yang
yang bermacam-macam bersifat neurotoxin.
• Kesulitan dalam Scale-
up Dapat digunakan baik
untuk DNA ganda
maupun tunggal
Menghasilkan fragmen
yang bermacam-macam
 Metode Sanger

Metode yang pertama kali

dikembangkan oleh Frederick
Sanger pada tahun 1975,
yaitu dengan melakukan
reaksi cycle sequencing pada
empat tabung terpisah yang
masing-masing berisi semua
pereaksi yang dibutuhkan.
• Metode Sanger menggunakan dideoxynucleotide
triphosphates (ddNTPs) yang memiliki sebuah H pada
karbon-3 dari gula ribosa. Yang normal memiliki OH pada
deoxynucleotide triphosphates (dNTPs).
• Dideoxynucleotides merupakan penghenti rantai. Dalam
reaksi sintesis jika dideoxynucleotide ditambahkan dan
bukan normal deoxynucleotide, sintesis akan berhenti
karena 3’OH yang diperlukan untuk penambahan
nukleotida berikutnya tidak ada.
Metode Sanger

1. DNA utas sebagai template DNA

2. Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang
berpasangan dengan
template DNA dan berfungsi sebagai starting point untuk
replikasi
3. DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA,
menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 dari template
4. Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif
atau dengan pewarna fluorescent)
6.Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal
tetapi secara random dideoxy nukleotida diambil
(dipasangkan).
7. Penambahan dideoxynukeotida menyebabkan reaksi
berhenti. Khusus untuk ddNTP, yang ditambahkan hanya
1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A
jika yang ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C
jika ddCTP dan T jika ddTTP.
8. Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan
kecepatan yang berbeda selama elektroforesis, maka
urutannya dapat ditentukan
FAKTOR PENENTU KEBERHASILAN
SEKUENSING DNA

Sekuensing
menggunakan
Dye primers

Faktor Penentu Sekuensing

Ekstraksi DNA
keberhasilan Dengan
Untuk sekuensing bahan Kimia
sekuensing DNA DNA

Sekuensing
menggunakan Dye
Terminator
Nex Generation

Pyrosequencing

Teknik pemetaan DNA yang

berdasarkan deteksi terhadap
pirofosfat (PPi) yang
dilepaskan selama sintesis
DNA. Teknik ini
memanfaatkan reaksi
enzimatik yang dikatalisis
oleh ATP sulfurilase dan
luciferase untuk pirofosfat
inorganik yang dilepaskan
selama penambahan
nukleotida.
 Ilumina

• Metode sekuensing ini ditemukan

oleh perusahaan Illumina.

• Sekuensing Illumina menggunakan

primer yang akan berkomplemen
dengan adaptor yang telah
disediakan oleh perusahaan pada
sebuah plat.

• Proses sekuensing ini

menggunakan teknik bridge PCR,
yaitu terbentuknya jembatan pada
saat elongasi. Nukleotida penghenti
akan diberikan dan pendaranan
fluoresens akan direkam oleh
kamer
Aplikasi Sekuensing DNA
untuk menentukan
identitas maupun fungsi KEDOKTERAN
gen atau fragmen DNA
lainnya dengan cara riset dasar
BIOTEKNOLOGI
membandingkan biologi
sekuens-nya dengan
sekuens DNA lain yang FORENSIK
sudah diketahui.
Sebagai contoh : Sekuensing DNA dapat digunakan
untuk
mengidentifikasi, mendiagnosis, dan
Ilmu pengobatan mengembangkan pengobatan
penyakit
genetik
ALAT-ALAT SEKUENSING
DNA

APPLIED BIOSYSTEMS PRISM

APPLIED BIOSYSTEMS PRISM 3700
3100
(CAPILLARY, 96 CAPILLARIES)
(CAPILLARY, 16 CAPILLARIES)
SEKUENSING PROTEIN
Senyawa organik kompleks
Protein berbobot molekul tinggi dari
monomer monomer asam amino
yang dihubungkan satu sama lain
oleh ikatan peptida

Sekuensing protein atau sekuensing peptida

adalah penentuan urutan asam amino pada
suatu protein atau peptida (oligopeptida
maupun polipeptida

Metode untuk sekuensing protein umumnya melibatkan

pemutusan ikatan yang diikuti dengan identifikasi asam
amino.
Metode Sekuencing Protein

Metode Metode
Klasik Modern

Edman Mass
Degradation Spectrometry
Edman Degradation
Mass Spectrometry
APLIKASI SEKUENSING DNA DAN
PROTEIN

Mencocokkan donor
organ dengan
penerima dalam
program
transplantasi