Ekstrak daun Polyalthia longifolia yang

distandarisasi (PLME) menghambat sel

proliferasi dan mempromosikan apoptosis:
Studi anti-kanker dengan berbagai metode
mikroskopi
 Dalam penelitian ini, sifat apoptogenik dan
efek sitotoksik ekstrak metanol daun panjang P.
helifolia (PLME) terhadap sel karsinoma serviks
manusia (HeLa) dipelajari menggunakan mikroskop
cahaya (LM), holografik digital mikroskop (HDM),
scanning electron microscope (SEM) dan mikroskop
Pendahuluan elektron transmisi (TEM). Nilai IC50 rata-rata dari
PLME terhadap sel HeLa yang diperoleh dengan
MTT dan CyQuant assay adalah 22,00 mg / mL pada
24 jam. Kesimpulannya, PLME mampu menghasilkan
morfologi ciri – ciri yang khas dari kematian sel HeLa
yang sesuai dengan apoptosis.
2. MATERIAL
AND
METHODS
 Daun P. longifolia
Daun dipotong, dicuci dengan
dikumpulkan dari berbagai
air suling dan oven-kering pada
daerah di Universiti Sains
30oC selama 7
Malaysia

Filtrat dari setiap ekstraksi

2.1. Pengumpulan Setelah kering, daun
dihaluskan. Sampel 100 gram
divakum pada evaporator
berputar pada 40oC dan ekstrak
tanaman dan bubuk tanaman direndam
dalam 400 mL metanol di RT
pekatnya akhirnya dituangkan
ke dalam cawan Petri dan
persiapan ekstrak (23oC±2) selama 7 hari. dibawa ke kekeringan pada
40oC dalam oven.

Ekstrak yang dihasilkan

disimpan di RT dalam gelap.
Adapun standardisasi,
kuantifikasi rutin dilakukan
menggunakan sistem LC-MS /
MS.
Jumlah rutin saat ini ditemukan
menjadi 8,96 µg dalam 1000
µg daun P. Longifolia ekstrak
metanol.
 PLME diuji untuk Ekstrak tumbuhan
sitotoksisitas in vitro, diencerkan dalam
2.2. Evaluasi Sitotoksisitas menggunakan HeLa, media dengan
MDA- MB-231, menggunakan
MCF-7 dan sel Vero mikropipet dengan
dengan uji MTT. cara pengenceran.
2.2.1. MTT assay
Setelah
perawatan,
Konsentrasi akhir Setiap sampel
mediumnya
dari ekstrak direplikasi tiga
disedot dengan Endapan ungu
tumbuhan di kali untuk
hati-hati dan sel- jelas terlihat di
setiap sumur masing-masing
sel dicuci dengan bawah
adalah antara 100 HeLa, MDA-
fosfat buffered mikroskop,
dan 0,781 mg / MB-231, MCF-7
saline (PBS) dan medium, bersama
mL. Setelah itu, dan sel Vero,
diinkubasi lagi dengan MTT.
sel-sel kultur diikuti dengan
dalam medium
dipanen dengan inkubasi.
segar dengan
MTT pada 37oC.
 Sel-sel itu dimasukkan dalam plat mikro-
titer fluoresensi hitam 96 well, dengan
kepadatan 5000 sel / well.

Setelah 24 jam PLME dari

konsentrasi 100 hingga 0,781 µg /
mL

2.2.2. Tes Setelah 24 jam perlakuan pada 37oC,

media dibuang, dan piring dibekukan
CyQUANT 80oC hingga digunakan.

Pada hari terakhir, lempeng dengan sel

dicairkan dan diinkubasi dengan pewarna
CyQuant selama 5 menit dalam gelap.

Fluoresensi diukur menggunakan mikro-plat fluoresensi

dengan filter, ditetapkan pada eksitasi 480 nm dan emisi
520 nm. Konsentrasi IC50 dari PLME ditentukan untuk
garis sel HeLa yang diuji. Setiap percobaan dilakukan
tiga kali
 Perubahan morfologi sel Sel dikultur pada kepadatan
dilakukan dengan Giemsa 1,5x105 sel / mL dan kemudian
sebelum observasi diobati dengan IC50 (22,00 µg /
menggunakan mikroskop fase mL) dari PLME waktu inkubasi
kontras. 6, 12, 24 dan 36 jam.

2.3. Studi Mikroskopi

Sel HeLa yang tidak diobati

digunakan sebagai kontrol.
2.3.1. Mikroskop Setelah membuang fiksatif,
Media disedot perlahan di
ujung waktu inkubasi masing-
Giemsa noda ditambahkan. masing, dicuci dengan PBS dan
cahaya (LM) diperbaiki dengan Mc-Dowell
Trump

Noda dicuci dengan air suling

Semua gambar itu dipilih lebih
dan udara kering. Sel-sel
dari total 50 mikrophotograf
kemudian diamati pada
yang ditangkap untuk masing-
pembesaran 400x dan
masing jarak waktu.
morfologi difoto.
 Perubahan morfologi sel diperiksa dengan tidak
merusak dan mikroskopi holografik fase non
invasive.

Sel dikultur pada kepadatan 1,5x105 sel / mL

semalam dalam 25 cm2 dan kemudian diobati
dengan IC50 (22,00 mg / mL) dari PLME untuk
inkubasi waktu 6, 12, 24 dan 36 jam.
2.3.2. Mikroskop digital
holografik (HDM)
Sel HeLa yang tidak diobati digunakan sebagai
kontrol. Perubahan sel diamati pada perbesaran 200x
dan foto yang diambil diambil menggunakan khusus
perangkat lunak HoloStudioTM.

Semua gambar dipilih secara total 50

mikrophotograf diambil untuk setiap interval waktu.
 Observasi SEM dilakukan pada sel HeLa

Sel dikultur pada kepadatan 1,5x105 sel / mL semalam dalam 25

cm2 labu kultur. Kemudia diperlakukan dengan IC50 (22,00 mg /
mL) dari PLME untuk waktu inkubasi 6, 12, 24 dan 36 jam.

2.3.3. Memindai
mikroskopi Sel HeLa yang tidak diobati digunakan sebagai kontrol.

electron
Sel-sel dilihat di bawah pemindaian mikroskop elektron dan
dilakukan di bawah kondisi analitis: L = SE1, WD = 21 mm,
dan EHT = 10.0 kV.

Semua gambar dipilih lebih dari total 50 microphotographs

yang diambil untuk interval waktu masing-masing.
 Sel dikultur pada kepadatan 1,5x105 sel / mL semalam dalam 25 cm2
labu kultur dan diperlakukan dengan IC50 (22,00 mg / mL) dari PLME
untuk waktu inkubasi 6, 12, 24 dan 36 jam.

Pada akhir masa inkubasi, sel-sel trypsinized ditangguhkan di

fixation McDowell Trump, disiapkan dalam 0,1 M dapar fosfat
selama 24 jam.

2.3.4. Mikroskop electron Sampel dipindahkan ke agar secara bertahap didehidrasi

peningkatan konsentrasi etanol sebelum dimasukkan ke resin.
transmisi

Resin sel HeLa dipotong menjadi sangat tipis bagian dalam

diproses ultramicrotomy, dan diwarnai dengan uranil asetat dan
timbal sitrat.

pengamatan sel dilakukan di bawah TEM. Semua gambar dipilih lebih

dari total 50 foto yang diambil microphotographs masing-masing
untuk setiap interval waktu.
2.3.5. Analisis Analisis regresi diplot untuk menghitung
respons-respons hubungan artinya ± SD
statistic rangkap tiga dan nilai IC50 untuk Tes
MTT dan CyQUANT dikuantifikasi
menggunakan Graphpad Prisma versi 7.
3. RESULTS
 Hasil dari evaluasi sitotoksisitas PLME sebagai konsentrasi setengah
penghambatan (IC50) nilai (mg / mL) ditunjukkan pada Gambar 1.
Nilai IC50 dari PLME terhadap sel HeLa adalah 15,15 mg / mL pada
24 jam menggunakan MTT (Gambar 1a)

3.1. Efek
sitotoksisitas dari
PLME diukur dengan
MTT dan CyQUANT Dengan demikian, nilai IC50 dari PLME terhadap sel HeLa adalah
28,86 mg / mL pada 24 jam menggunakan uji CyQuant (Gambar 1b).
Efek dari PLME pada sel Vero direpresentasikan secara grafis (Gambar 1c) yang dievaluasi
oleh MTT assay. Nilai IC50 dari PLME pada sel Vero ditemukan menjadi 51,07 mg / mL
pada 24 jam. Untuk MTT dan CyQUANT masing-masing ditunjukkan bahwa datanya
bagus sesuai dengan garis regresi untuk menentukan IC50. Semua konsentrasi
dikuantifikasi dalam rangkap tiga, n = 3.
 Perlakuan PLME pada sel HeLa diamati menggunakan
sebuah mikroskop cahaya pada interval 6, 12, 24 dan 36 jam dan
perubahan dijelaskan dengan perbesaran 100x, 200x dan 400x.
Kerusakan sel karena PLME pengobatan di IC50 22,00 mg / mL
digambarkan pada Gambar 2.

3.2. Perubahan
morfologi
dievaluasi dengan
mikroskop cahaya
(LM)
 Efek dari PLME pada sel HeLa diamati menggunakan HDM yang
ditangkap pada interval 6,12, 24 dan 36 jam dan perubahannya
ditampilkan dengan perbesaran 200x (Gambar 3).

3.3. Perubahan
morfologi dievaluasi
dengan mikroskop
digital holografik
(HDM)
 Efek pengobatan dari PLME pada sel HeLa diamati menggunakan
SEM pada interval 6,12, 24 dan 36 jam dan perubahannya dirinci
menggunakan pembesaran 300x diikuti oleh berbagai perbesaran
untuk menyoroti spesifisitas aspek tertentu. Kemajuan sel saat
terpapar pada PLME ditangkap pada Gambar 4

3.4. Perubahan
morfologi dievaluasi
dengan memindai
electron mikroskop
(SEM)
 Sel-sel difoto dengan interval 6, 12, 24 dan 36 jam dan
perubahan intramorphological diikuti oleh berbagai
Magnifikation untuk menyoroti spesifik tertentu
(Gambar 5).

3.5. Secara
morfologi
perubahan
dievaluasi oleh
transmisi mikroskop
elektron (TEM)
4. Discussion
 IC50 dari HeLa ditentukan untuk MTT dan CyQUANT tes yang
15,15 mg/mL dan 28,86 mg/mL. Assay MTT mencerminkan

4.1. Dalam tes aktivitas metabolik sementara CyQUANT menafsirkan isi DNA;
nilai IC50 yang lebih rendah dari MTT hanya dapat dikaitkan
sitotoksisitas vitro dengan PLME menyebabkan disfungsi metabolik sebelum
oleh MTT dan penurunan DNA sel HeLa yang dirawat. Viabilitas tes yang
memanfaatkan titik akhir pengukuran yang berbeda dapat
CyQUANT menjelaskan tindakan beracun, dan dapat menyebabkan perkiraan
yang berbeda dari potensi sitotoksisitas untuk senyawa tertentu.
 Studi morfologi dilakukan dalam penelitian ini didasarkan pada
4.2. Perubahan Giemsa bernoda sel HeLa diobati dengan PLME di LM terjadinya
apoptosis dengan waktu yang berbeda. Hasil sitotoksisitas
morfologi sel menyatakan efek penghambatan tamoxifen pada sel HeLa dengan
diamati memberikan bukti apoptosis pada sel-sel ini diperlakukan.
menggunakan Dokumentasi kejadian serupa melalui pengamatan LM, seperti

mikroskop cahaya penyusutan sel, blebbing, fragmen pyknotic, dan badan-badan

apoptosis, yang juga diamati dalam penelitian ini menggunakan
(LM) Giemsa bernoda HeLa diobati dengan PLME.
 PLME drastis mengubah bentuk sel-sel HeLa dari waktu ke
waktu: area sel menurun, dan tinggi optik mereka meningkat
secara signifikan menunjukkan sel-sel dan sel-basal lamina
detasemen, yang merupakan ciri khas klasik apoptosis. Misalnya,
perubahan dalam volume sel, yang sering dianggap sebagai

4.3. Sel morfologi mekanisme kematian sel mekanisme jalur yang berbeda. Selain
itu, gambar holografik dari sel-sel HeLa juga menyarankan fitur
penilaian dengan morfologi apoptosis dengan menunjukkan sel-sel bulat berbentuk
mikroskop digital nyata dan kematian sel melalui detasemen sel dari substratum
peningkatan waktu dari 6 jam sampai 36 jam. Temuan ini tidak
hologram (HDM) sejalan dengan bukti terjadinya apoptosis, dan, untuk pertama
kalinya, visualisasi morfogenesis ini dilakukan dengan sel HeLa
PLME diperlakukan menggunakan teknik canggih. HDM gambar-
gambar menunjukkan perubahan konsisten dengan pengamatan
LM,
 EM ditemukan dalam dua bentuk dasar Memindai Electron
Microscope (SEM) dan Mikroskop Elektron Transmisi (TEM)
yang berbeda untuk sebagian besar dalam hal aturan-aturan dasar.
Singkatnya, SEM memanfaatkan bantuan sinar elektron sekunder
4.4. perubahan untuk membuat tampilan tiga dimensi yang memungkinkan
seseorang untuk menerima informasi topografi, morfologi dan
morfologi sel HeLa
komposisi. Fenomena penyusutan sel, yang juga merupakan
dilihat menggunakan konsekuensi dari perubahan sitoskeleton, ini disebabkan oleh
mikroskop elektron perubahan pertukaran ion (natrium dan kalium), yang antara lain,
scanning (SEM) menetapkan ambang batas untuk sel mati. Membran diamati
melalui SEM, yang hasilnya tidak bisa apoptosis, karena
penonjolan membran plasma sel didorong oleh tekanan yang
dihasilkan dalam sitoplasma melalui kontraksi actomyosin
 TEM memungkinkan penyelidikan perubahan sitoplasma, yang
tidak dapat dilihat melalui SEM. TEM adalah teknik besar untuk
4.5. perubahan membedakan antara apoptosis dan nekrosis; di samping itu,
memungkinkan studi tentang spesimen dipotong, dan gambar bi-
morfologi sel HeLa dimensi kualitatif dari sel HeLa inner. Namun, TEM memiliki
seperti yang dilihat kelemahan, salah satunya adalah bahwa hanya daerah kecil
melalui mikroskop jaringan dapat dianalisis sekaligus, membuat proses penghitungan
elektron transmisi sel apoptosis agak membosankan. Selama apoptosis, mitokondria
mengalami perubahan struktural besar yang mengintensifkan
(TEM) pelepasan cyto-krom c dan protein lain dari ruang antarmembran
atau ruang intracristal.
 Pemeriksaan struktur rinci sitotoksisitas PLME pada sel HeLa
serta karakterisasi interaksi antara sel-sel PLME dan sel HeLa
tidak akan dibayangkan tanpa berbagai teknik mikroskop yang
digunakan dalam penelitian ini. HDM, LM, SEM dan TEM telah
terbukti menjadi alat yang sangat berharga dalam hal ini.
Meskipun HDM, LM, SEM dan TEM menghasilkan serangkaian
Kesimpulan gambar yang berbeda, mereka menyediakan penyidik dengan data
ilmiah yang berbeda; kombinasi empat teknik mikroskopis ini
dalam penyelidikan sitotoksisitas tunggal bisa sangat kuat dalam
gambar yang dihasilkan oleh salah satu teknik. Kesimpulannya,
PLME mampu menghasilkan ciri-ciri morfologi yang khas dari
kematian sel HeLa yang sesuai dengan apoptosis.