Tugas Pengembangan Obat II

Dosen Pengampu:
Dr. Roslinda Ryasid, Msi, Apt

Program Pasca Sarjana Farmasi

Universitas Andalas Rido Farnandi
1921012006
 Tetrastigma hemsleyanum Diels e, spesies:herbaceous perennial, family:
Vitaceae. Ini didistribusikan terutama di Cina selatan, sangat cocok tumbuh di tempat
teduh dan lembab lereng bukit dan lembah. Sebagai tanaman yang bisa dimakan, daun T.
hemsleyanum telah mendapatkan popularitas di Cina, di mana itu dikonsumsi sebagai
teh atau suplemen makanan, seperti meningkatkan sistem kekebalan tubuh. Akar T.
hemsleyanum banyak digunakan untuk pengobatan demam tinggi, pneumonia, asma,
hepatitis, rematik, gangguan menstruasi, sakit tenggorokan dan skrofula karena sifatnya
anti-inflamasi, analgesik, dan antipiretik. Selain itu, ia memiliki antivirus,
hepatoprotektif dan fungsi antipiretik serta meningkatkan sistem kekebalan tubuh untuk
tujuan antikanker.

Akar T. hemsleyanum telah dilaporkan mengandung flavonoid, asam fenolik

dan polisakarida. Diantaranya, senyawa aktif utama dalam akar adalah flavonoid, yang
memiliki berbagai bioaktifitas. Namun, sebagian besar penelitian terutama berfokus pada
akar dari pada daunnya. Dedaunan dengan kandungan phytochemical yang lebih tinggi
mungkin memiliki beberapa keunggulan dibanding akar. Studi ini difokuskan pada
investigasi komposisi kimia dan fungsi daun T. Hemsleyanum.
 Banyak teknik analitik modern telah digunakan Analisis kualitatif dan kuantitatif
dari berbagai tanaman. Di antara teknik-teknik ini, LC−QTOF-MS (kromatografi cair
percepatan ortogonal quadrupole spektrometri massa waktu terbang) telah menjadi
alat yang baik untuk mengidentifikasi senyawa yang rumit, sementara LC−QqQMS
(kromatografi cair massa tandem triple quadrupole spektrometri) telah muncul dalam
analisis kuantitatif masing-masing senyawa. LC−QTOF-MS dengan akurasi dan resolusi
massa yang lebih tinggi dapat digunakan untuk memperoleh rumus molekul beberapa
puncak yang tidak diketahui dari pola isotop dan massa ion yang akurat. Demikian teknik
ini sangat cocok untuk analisis kualitatif. Selain itu, LC−QqQ-MS dapat memberikan
spesifikasi, sensitif dan hasil kuantitatif selektif dengan bekerja dalam berbagai reaksi mode
pemantauan (MRM). Itu dianggap sebagai salah satu yang paling teknik yang efisien untuk
analisis kuantitatif. Pada saat ini studi, kombinasi LC−QTOF-MS dan LC−QqQ-MS
diaplikasikan pada analisis fenolik pada T. Hemsleyanum daun dan 13 senyawa
diidentifikasi dari tanaman ini untuk pertama kali.
 Telah dibuktikan bahwa kandungan fenolik total (TPC) diekstraksi dari sampel
yang sama berbeda dengan pelarut polaritas. Razali et al. melaporkan bahwa metanol, etil
asetat dan heksana secara signifikan mempengaruhi TPC . Hossain et al. juga
menemukan bahwa ekstrak metanol Daun Tetrastigma sp. menunjukkan TPC lebih
tinggi dari etil asetat, chloroform dan hexane. Apalagi kestabilannya beragam ekstrak dari
tanaman yang sama tergantung pada pelarut ekstraksi yang digunakan untuk
menghilangkan senyawa fenolik, dan itu jelas bahwa ekstrak dari tanaman yang sama
dapat sangat bervariasi sehubungan dengan konsentrasi dan aktivitas antioksidan mereka ,
ekstrak daun T. hemsleyanum berbeda pelarut dapat memiliki komposisi bioaktifitas yang
berbeda.

Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi dan mengukur
fenolat total dan individu dalam daun T. Hemsleyanum oleh kombinasi LC−QTOF-MS
dan LC−QqQ-MS , untuk mengidentifikasi aktivitas antioksidan Dari ekstrak daun
T.hemsleyanum menggunakan DPPH (1,1-difenil-2- picrylhydrazyl), ABTS [2,2-azinobis
(3 ethylbenzothiazoline-6- asam sulfonat)], uji FRAP (kemampuan mengurangi ferric
plasma), dan aktivitas antiproliferatif mereka dengan model berbasis sel.
 MATERIAL DAN METODE

Bahan Tumbuhan
Daun T. hemsleyanum disediakan oleh Jiangxi Shangrao Red Sun
Agricultural Development Co, Ltd (Jiangxi, Cina). Tanaman ditanam di Pembibitan T.
hemsleyanum di Cina (Shangrao, Jiangxi, Cina, 28 ° 53′N, 117 ° 57′E) di tanah lempung
merah Jiangxi pada 2012. Daun dikeringkan pada suhu 50°C dengan oven
electrothermostatic dan ditumbuk menjadi bubuk halus. Bahan-bahan ini disimpan dalam
tabung polietilen pada suhu -80 ° C sebelum dianalisis.

Ekstraksi sampel Serbuk kering

(5,0 g) diekstraksi dengan 100 mL heksana, etil asetat, dan Metanol 80%
selama 90 menit pada 60°C oleh ekstraksi refluks. Ekstrak organiknya disentrifugasi
pada 5.000 rpm selama 10 menit. Ekstraksi diulang dua kali, dan supernatan
digabungkan, dan diuapkan di bawah tekanan yang pada 45°C menggunakan rotary
vacuum evaporator. Kemudian, larutan pekat itu dikeringkan secara di oven pengeringan
.
 Hasil ekstraksi daun T. hemsleyanum yang diperoleh oleh tiga pelarut (Tabel 1), mulai dari
4,02 % hingga 19,3%, berada dalam urutan berikut dari tertinggi ke terendah: Metanol> etil asetat>
heksana. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1, ekstraksi dengan Metanol 80% menghasilkan jumlah
terbesar total fenolat (275,71 mg GAE / g DW), diikuti oleh etil asetat (91,26 mg GAE / g DW) dan
heksana (28,95 mg GAE / g DW). Hasil ini menunjukkan bahwa T. Hemsleyanum Daunnya kaya akan
senyawa fenolik

Tabel 1. Hasil Ekstraksi, Total Kandungan Fenolik, Aktivitas Antioksidan dan Antiproliferatif
dari Ekstrak Daun T. hemsleyanum
 Uji DPPH banyak digunakan untuk menentukan Aktivitas antioksidan
pada tanaman karena dapat menampung banyak sampel dalam waktu singkat dan
Aktivitas Antioksidan cukup sensitif untuk dideteksi bahan aktif pada konsentrasi rendah. Semua ekstrak
dari daun T. hemsleyanum menunjukkan radikal DPPH tinggi, dengan nilai (3,32),
(2,16), dan (1,23) mmol Trolox / g DW untuk 80% metanol, etil asetat dan ekstrak
heksana, masing-masing (Tabel 1). Daun T. Hemsleyanum pada ekstrak metanol
80% memiliki radikal DPPH tertinggi.
 Aktivitas antiproliferatif

Kematian terkait kanker bisa jadi disebabkan oleh stres oksidatif, dan kemoprevensi secara alami
atau antioksidan sintetik dapat mencegah pembentukan atau kanker. Ekstrak daun T. hemsleyanum dilihat
Sitotoksisitasnya terhadap garis sel HepG2 ditunjukkan pada Tabel 1. Diantara ekstrak ini, Metanol 80% dan
ekstrak etil asetat menunjukkan efek terhadap sel HepG2 dengan nilai IC50 masing-masing 524,9 ± 6,48 dan
705,3 ± 5,22 μg / mL, yang menunjukkan bahwa daun hemsleyanum memiliki pengaruh terhadap pertumbuhan
HepG2.
 Antiproliferatif ekstrak akar T. hemsleyanum telah dilaporkan sebelum. Ding et al.
menemukan bahwa fraksi etil asetat (1 × 10−3 g / L) dari ekstrak akar T. hemsleyanum
menunjukkan pertumbuhan tingkat penghambatan 45% pada HepG2, sedangkan Cheng dan
Lu26 melaporkan bahwa nilai IC50 dari ekstrak akar T. hemsleyanum pada garis sel karsinoma
paru A549 adalah 1 × 10−3 g / L. Walaupun ekstrak akar T. hemsleyanum mungkin lebih kuat
aktivitas antiproliferatif dibandingkan dengan daun, masih layak mengidentifikasi senyawa
sitotoksik pada daun T. hemsleyanum.
 Analisis kualitatif

Dalam penelitian ini, ekstrak metanol 80% dipilih untuk analisis kualitatif
karena TPC yang lebih tinggi dan aktivitas antioksidan. LC−Analisis ESI-QTOF-MS / MS
fenolik dalam ekstrak daun T. hemsleyanum (ekstrak metanol 80%) dilakukan untuk
memberikan waktu retensi, pola fragmentasi dan karakteristik spektrum UV untuk setiap
puncak dan untuk mengidentifikasi puncak HPLC. Gambar 1 menunjukkan kromatogram
pada 330 nm dan kromatogram ion total (TIC) dalam mode ion negatif. Puncak-puncak ini
dirangkum bersama dengan waktu retensi mereka, spektrum UV karakteristik, diamati dan
dihitung m / z, kesalahan (ppm), rumus molekul dan fragmen MS / MS (Tabel.2)
Gambar 1. (A) Kromatogram DAD dalam ekstrak metanol 80% dari T. Daun hemsleyanum terdeteksi pada 330 nm.
(B) Kromatogram ion total (TIC) dalam mode negatif. Puncak: 3-caffeoylquinic acid (1); 5- asam caffeoylquinic (2);
Asam 1 caffeoylquinic (3); 5-p-coumaroylquinic asam (4); isoorientin-2 ″ -O-rhamnoside (5); isoorientin (6);
orientin- 2 ″ -O-rhamnoside (7); orientin (8); Asam 1-p coumaroylquinic (9); vitexin-2 ″ -O-rhamnoside (10);
isovitexin-2 ″ -O-rhamnoside (11); vitexin (12) dan isovitexin (13)
Tabel 2. Senyawa Fenolik Ditentukan dari LC − QTOF-MS / MS dalam Ekstrak Daun T.
hemsleyanum (80% Ekstrak Metanol)
 Selain itu, spektrum MS/MS dan pola fragmentasi yang dilihat dari puncak yang
diidentifikasi adalah pada Gambar 2−5. Dalam penelitian ini, tiga belas puncak terdeteksi dan
diidentifikasi berdasarkan data MSn dan oleh perbandingan dengan literatur dan / atau standar otentik: 3-
asam caffeoylquinic (1), asam 5-caffeoylquinic (2), 1-caffeoylquinic asam (3), asam 5-p
coumaroylquinic (4), isoorientin-2 ″ -Orhamnoside (5), isoorientin (6), orientin-2 ″ -O-rhamnoside (7),
orientin (8), 1-p coumaroylquinic acid (9), vitexin-2 ″ -Orhamnoside (10), isovitexin-2 ″ -O-rhamnoside
(11), vitexin (12) dan isovitexin (13).

Akar T. hemsleyanum dilaporkan mengandung fenolat seperti kaempferol, quercetin dan

kaempferol-3-Oneohesperidoside. Fitokimia lainnya seperti apigenin-6-α- L-rhamnopyranosyl (1−4) -α-
L arabinopyranoside, apigenin-8-α- L-rhamnopyranosyl (1−4) -α-L-arabinopyranoside, kaempferol- 7-
O-α-L-rhamnopyranosyl-3-O-β-D-glucopyranoside, apigenin- 6,8-di-β-D glucopyranoside, asam
salisilat, asam suksinat, lacceroic asam dan etil galat ditemukan dalam ekstrak etanol seluruh ramuan di
T. hemsleyanum. Tiga asam fenolik (galat asam, etil galat dan asam palmitat) ditentukan dalam ekstrak
etanol dari ramuan utuh dari Tetrastigma hypoglaucum Planch. ex Franch (anggota keluarga Tetrastigma
lainnya) . Berbeda dari fenolik ini, daun T. Hemsleyanum mengandung asam klorogenat, flavonoid C-
glikosidik dan O, Cdiglycosidic flavonoid, yang diidentifikasi untuk pertama kalinya dalam penelitian
ini.
Karakteristik khusus, digunakan untuk identifikasi puncak 1−13, dijelaskan secara lebih rinci sebagai
berikut:
A. Asam Klorogenik
Puncak 1, 2, dan 3 dengan waktu retensi (tR) dari (13,26), (17,79), dan (22,06) menit menunjukkan hal
yang sama ion pseudomolekul [M - H] - pada m / z 353 dengan maksimum Penyerapan UV pada 298 dan 324 nm.
Spektrum MS2 dari puncak 2 pada ion fragmen pada m / z 191 [asam kuinat - H] - (Gambar 2).

Gambar 2. Spektrum MS / MS asam klorogenat dalam ekstrak daun T. Hemsleyanum

 Spektra tR dan UV/vis puncak 2 cocok dengan standar otentik (asam 5-caffeoylquinic), dan yang
serupa ion molekuler dan pola fragmentasi massa spektrum puncak oleh LC − QTOF-MS. Hasilnya, puncak 1 dan
3, dengan ion fragmen utama pada m / z 191 [asam kuinat - H] -, m / z 179 [caffeoyl - H] - (puncak 1) dan m / z 191
[asam kuinat - H] - (puncak 3), diidentifikasi sebagai 3- asam caffeoylquinic dan 1 caffeoylquinic acid (Gambar 3)
Puncak ini juga dapat dibedakan dengan mempertimbangkan urutan elusi asam klorogenik. Asam 3-caffeoylquinic
muncul pertama pada kolom HPLC C18, diikuti oleh 5- asam caffeoylquinic dan asam 1-caffeoylquinic.

Gambar 3. Struktur (I) dan pola fragmentasi (II, mengambil 5- asam caffeoylquinic) asam klorogenat
dalam T. ekstrak daun hemsleyanum
 Puncak 4 dan 9 (tR 7,08 dan 30,18 mnt) menunjukkan [M - H] - ion pada m / z 337. Dalam spektrum
MS2 (Gambar 2), puncak 4 menunjukkan ion fragmen pada m / z 191 [asam kuinat - H] – dan 163 [asam kumarin -
H] -, sedangkan puncak 9 memiliki fragmen utama ion pada m / z 191 [asam kuinat - H] -. Data MS digabungkan
dengan spektra UV − vis dan urutan elusi puncak di LC menyebabkan identifikasi tentatif dari puncak 4 dan 9
menjadi 5-pcoumaroylquinic asam dan asam 1-p-coumaroylquinic (Gambar 3)
 B. Flavonoid C-Glikosidik
Puncak 6 dan 8 dengan tR dari 27.76 dan 29,68 mnt menunjukkan penyerapan UV maksimum yang serupa
(λmaks 270) dan memberikan ion pseudomolekul m / z pada 447. Puncak 6 dan 8 diidentifikasi sebagai isoorientin dan
orientin menurut urutan eluting, data MSn (Gambar 4), pola fragmentasi (Gambar 5) dan standar asli. Puncak 6
menunjukkan fragmen ion pada m / z 429 ([M - H - H2O] -), 411 ([M - H - 2H2O] -), 369 (0,4X− - H2O), 357 (0,3X−),
327 (0,2X−), 311 (0,2A−), 297 (0,1X−) dan 285 (Y−), masing-masing. Puncak 8 adalah terkait dengan ion fragmen pada
m / z 357 (0,3X−), 339 (0,3X− - H2O−), 327 (0,2X−), 311 (0,2A−), 297 (0,1X−) dan 285 (Y−). Di antara ion fragmen
ini, m / z 429 ([M - H - H2O] -) hanya ditemukan di MS2 isoorientin, sementara itu tidak terdeteksi dalam orientin atau
kelimpahan relatifnya terlalu rendah terdeteksi. Oleh karena itu, ion fragmen [M - H - H2O] - dapat menjadi digunakan
untuk membedakan flavonoid 6-C-glikosidik dari 8-C-glikosidik flavonoid.
 Ini sesuai dengan fragmen khas vitexin dan isovitexin (Gambar 5) .Namun, pola fragmentasi
isovitexin dan vitexin sama dengan isoorientin dan orientin. Ion fragmen 413 [M – H - H2O] – adalah ditemukan di
puncak 12, yang menjadi 6-C-glikosidik flavonoid. Oleh karena itu, puncak 12 dan 13 diidentifikasi sebagai
vitexin dan isovitexin dengan membandingkan pola fragmen dan nyata standar

Gambar 5. Struktur dan pola fragmentasi C-glikosidik flavonoid (I, II) dan O, C-diglycosidic flavonoid (III)
dalam T. ekstrak daun hemsleyanum.
Gambar 4. Spektrum MS / MS flavonoid C-glikosidik dan flavonoid O-C-diglikosidik dalam ekstrak daun T.
Hemsleyanum
 C. (O,C-Diglycosidic Flavonoid)
Untuk puncak 5 dan 7 (tR 27.08 dan 28,40 mnt), dengan ion pseudomolekul [M - H] - pada m / z 593, ion
fragmen di m / z 473 [M - H - 120] -, 447 [M - H - rhamnose] -, 429 [M - H - rhamnose - H2O] - dan 327 [M - H - 284]
- ditemukan dalam spektrum MS2 (Gambar 4). Di antara ion fragmen ini, m / z 447 [M - H - rhamnose] - dapat
dijelaskan dengan hilangnya bagian rhamnose dan kemudian selanjutnya terfragmentasi menjadi ion pada m / z 429 [M
- H – rhamnose - H2O] -, sesuai dengan hilangnya molekul air. Selain itu, m / z 457 [M - H - 120] - dihasilkan dari
cincin silang pembelahan gugus C-glikosidik dan m / z 293 [M - H - 284] - adalah karena kombinasi dari kedua
fragmentasi (Gambar 5). Perbedaan antara puncak 5 dan 7 adalah kelimpahan relatif m / z 327, yang juga merupakan
perbedaan antara isoorientin dan orientin.

Demikian pula, puncak 10 dan 11, dengan tR 33,53 dan 34,48 menit, menunjukkan spektrum UV yang
sama. Dalam pemindaian penuh, sama ion pseudomolekul [M - H] - pada m / z 577 ditemukan di puncak-puncak ini,
menunjukkan bahwa mereka adalah vitexin-2 ″ -O-rhamnoside dan isovitexin-2 ″ -O-rhamnoside.37 Ion MS2 di m / z
457 [M - H - 120] -, 431 [M - H - rhamnose] -, 413 [M - H rhamnose - H2O] - dan 293 [M - H - 284] - berhubungan
dengan pola fragmentasi yang sama (Gambar 5) dari puncak 5 dan 7. Spektrum MS2 ditunjukkan pada Gambar 4.
Selain itu, itu mungkin untuk secara akurat membedakan puncak ini dengan perbandingan dengan standar otentik
(hanya vitexin-2 ″ -O rhamnoside).
 Analisis kuantitatif

A. HPLC Kuantitatif−ESI-QqQMS / Analisis MS

Isi fenolik individu senyawa dalam ekstrak daun T. hemsleyanum ditentukan oleh HPLC−ESI-QqQ-MS / MS.
Karena itu penting untuk menemukan a ion fragmen khusus untuk setiap senyawa, analisis kuantitatif dicatat untuk
standar otentik. Karena kurangnya standar, hanya enam fenolik yang dianalisis secara kuantitatif dalam penelitian
ini.

Untuk melihat vitexin-2 ″ -O-rhamnoside oleh MRM, the ion fragmen khusus pada m / z 413.0 t. Tambahan,
isovitexin dan vitexin dimonitor oleh transisi dari ion molekuler pada m / z 431.1 dan 431.1 untuk yang sesuai ion
fragmen pada m / z 311.0 dan 283.0, sedangkan isoorientin dan orientin dimonitor oleh transisi dari molekul ion pada m /
z 447.0 dan 447.0 dengan ion fragmen yang sesuai pada m / z 357.0 dan 327.0. Selain itu, asam 5-caffeoylquinic adalah
dilihat dengan menggunakan ion fragmen khusus pada m / z 191.0
 Hasil kuantitatif ekstrak dari T. Hemsleyanum daun diringkas dalam Tabel 3. Untuk ekstrak metanol 80%,
fenolik utama adalah asam 5-caffeoylquinic, diikuti oleh orientin, isovitexin, vitexin-2 ″ -O-rhamnoside, isoorientin dan
vitexin. Menariknya, ekstrak etil asetat mengandung ini senyawa dalam urutan yang berbeda: asam 5-caffeoylquinic,
isovitexin, vitexin, orientin, vitexin-2 ″ -O-rhamnoside dan isoorientin. Namun, senyawa ini tidak ditemukan di ekstrak
heksana. Hasilnya menunjukkan bahwa metanol 80% ekstrak memiliki kandungan lebih tinggi dari senyawa-senyawa
ini (8,28-38,47 mg / g DW) dibandingkan ekstrak etil asetat (1,56 hingga 11,28 mg / g DW), dan asam 5-caffeoylquinic
adalah fenolik utama senyawa dalam daun T. hemsleyanum.
Tabel 3. Data Kurva Kalibrasi dan Hasil Kuantitatif oleh HPLC − ESI-QqQ-MS / MS untuk Phenolic di T.
Hemsleyanum Ekstrak Daun
 B. Metode Validasi
Menurut orang Eropa Pedoman Badan Obat (EMEA )38 dalam hal validasi metode analitik,
HPLC − ESI-QqQ-MS / MS metode divalidasi. Intraday presisi dan akurasi dihitung dengan menganalisis
tiga sampel setiap senyawa pada tiga tingkat konsentrasi yang berbeda (25, 50, dan 300 μg / mL) di hari
yang sama. Evaluasi antar hari dilaksanakan selama tiga Hari-hari yang berurutan. Margin kesalahan
standar adalah <5%. Itu kurva kalibrasi diperoleh dengan memplot rasio analit sinyal ke sinyal standar
eksternal sebagai fungsi analit Konsentrasi linier dalam kisaran 10-200 μg / mL. Itu batas deteksi (LOD)
dan batas kuantifikasi (LOQ) nilai yang dihitung untuk enam senyawa kurang dari 2 dan 14 ng / mL,
masing-masing. Data validasi metode, yang dikembangkan untuk analisis kuantitatif senyawa ini, adalah
ditunjukkan pada Tabel 3. Metode analitis ditemukan dapat diandalkan dengan reproduktifitas yang baik,
sebagaimana dibuktikan oleh rendahnya nilai standar deviasi
 Kesimpulannya
Analisis kualitatif dan kuantitatif fenolik pada daun T. hemsleyanum pertama kali
dilaporkan. Jumlah dari tiga belas fenolik diidentifikasi oleh LC − QTOF-MS, dan enam dari
mereka selanjutnya diukur dengan LC by QqQ-MS. Selain itu, penelitian ini menunjukkan bahwa
semakin tinggi TPC T. Ekstrak daun hemsleyanum menghasilkan antioksidan yang lebih tinggi
aktivitas dan aktivitas antiproliferatif. Hasilnya menunjukkan itu Daun T. hemsleyanum lebih
tinggi di TPC adalah sumber yang baik antioksidan. Studi ini dapat memberikan informasi
mendasar untuk pengembangan daun T. hemsleyanum pengobatan
Terima Kasih