ELEKTROFORE

SIS
1. EMILYA CHRISTI A (P17334118036)
2. HILDA HESTIA (P17334118037)
3. YUNITIA ESTER C (P17334118038)
4. NURUL HIDAYATI (P17334118039)
5. FATHAN RAMADHAN H (P17334118040)

KELOMPOK 9

D3/2A
2019
 Rumusan Masalah

Definisi dan Teknik Komponen yang dibutuhkan pada Pembacaan

prinsip elektroforesis elektroforesis (media,pewarna, dll) elektoforegram
elektroforesis

2
 Pengertian
Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu teknik
yang mengukur laju perpindahan
atau pergerakan partikel-partikel
Tujuan :
bermuatan dalam suatu medan
• digunakan untuk mengamati hasil
listrik.
amplifikasi dari DNA
• Memisahkan,mengindentifikasi,
dan memurnikan fragmen DNA
3
 Prinsip Elektroforesis
Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya
pergerakan molekul bermuatan positif (+) pada
kutub negatif (-) serta molekul bermuatan negatif (-)
pada kutub positif (+). Pegerakan yang terjadi
disebut “elektrokinetik”. Hasil yang didapatkan dari
elektroforesis adalah elektroforegram yang
memberikan informasi mengenai seberapa cepat
perpindahan molekul atau ion yang disebut
kecepatan migrasi. Komponen yang bermuatan
positif akan bergerak searah dengan medan listrik
menuju kutub negatif. Apabila dalam campuran
terdapat dua jenis komponen, yakni (1) komponen
negatif (-), dan (2) komponen netral(N), maka
komponen negatif akan bergerak menuju kutub
positif (+) sedangkan komponen netral (N) akan
tetap diam. 4
Jenis Elektroforesis

Elektroforesis Elektroforesis
kertas Elektroforesis gel Kapiler

Digunakan untuk memisahkan

Fasa diam : kertas Fasa diam : gel asam amino , proteid ,lipid,
Fasa gerak : partikel Fasa gerak : partikel karbohidrat dan nukleotida dengan
bermuatan yang terlarut bermuatan yang terlarut resolusi tinggi yang dilakukan pada
(terutama ion kompleks) (terutama ion kompleks) pipa kapiler berisi buffer 5
Elektroforesis Kertas
Keunggulan
• Proses migrasi lebih cepat
• Pemisahan spot menjadi lebih kecil
• Mudah memisahkan sampel dengan
spektrofotometri
• Mudah dilarutkan dalam pelarut dalam jumlah
sedikit

Kekurangan
Adanya gangguan yang disebabkan oleh adanya
• Pemisahan terjadi akibat adanya gradasi gugus OH yang terdapat pada selulosa yang
konsentrasi sepanjang sistem pemisahan dapat berinteraksi dengan molekul polar
sehingga daya migrasi molekul terganggu dan
• Pergerak parikel dalam kertas tergantung pada menjadi lebih rendah
muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang,
tegangan yang digunakan , konsentrasi elektrolit,
kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat
terlarut
6
ElektroforesisGel
Keunggulan
• Mudahnya mengamati reaksi kimia selama proses
berlangsung
• Sampel dapat ditangani dnegan baik dan cepat
• Gel dari hasil percobaan dapat disimpan dalam kantong
pastik dan diginkan setelah percobaan dan dapat
digunakan untuk dipelajari lebih lanjut

Kekurangan
rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan
campuran sampel ke dalam slot gel , karena ukuran slot
yang sangat kecil

Awalnya menggunakan gel kanji, kemudian berkembang

menjadi gel agarose dan poliakrilamida sebagai gel
medianya. Metode elektroforesis gel agarose didasarkan
pada pergerakan molekul bermuatan dalam media
penyangga matriks stabil di bawah pengaruh muatan listrik 7
Elektroforesis Kapiler
Keunggulan
• Dapat digunakan untuk memisahkan spesies ion oleh
muatan mereka dan gesekan kekuatan dan radius
hidrodinamika
• Memiliki efisiensi dan selektivitas yang baik

Kekurangan
• Boros listrik karena menggunakan tegangan tinggi
• Harga alat yang cukup mahal

Digunakan untuk memisahkan asam amino , protein,

lipid, karbohidrat dan nukleotida dengan resolusi tinggi
yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer
8
Teknik elektoforesis
Elektroforesis larutan (moving
boundary electrophoresis)
• Kecepatan migrasi dari
makro-molekul diukur
dengan jalan melihat
terjadinya pemisahan dari
molekul (terlihat seperti
pita) di dalam pelarut.
Elektroforesis daerah
(zone electrophoresis)
• menggunakan suatu bahan
padat yang berfungsi
sebagai media penunjang
yang berisi (diberi) larutan
penyangga.
• elektroforesis daerah
disebut sebagai
elektroforesis gel dengan
dua buah model yaitu
horizontal dan vertikal
9
Komponen Elektroforesis
1. Gel agarose 0.8 sampai 1 %untuk
mengecek genom, 1.5 sampai 2 % untuk
fragmen DNA berukuran 200 pb,
poliakrilamid 40 % untuk 1 sapai 300 pb
2. Buffer TAE/TBE
3. Loading dye (pemberat agar DNA/RNA/
protein tidak keluar dari sumur) terbuat
dari sukrosa/gliserol dan bromofenol
biru
4. Sampel DNA, RNA, protein
5. Alat elektroforesis (anoda, katoda,
sumur,dll)
6. Marker 10
Jenis media yang digunakan pada elektroforesis gel
Gel agarose
• agarosa merupakan polimer dari
3,6-AnhidroL-galaktosa dengan b-d-
galaktosa, yang memiliki komponen
netral atau tidak bermuatan
•gel ini mengandung larutan buffer
Tris Asetat EDTA (TAE) yang dapat
memberikan resolusi terbaikuntuk
DNA
• Semakin rendah konsentrasi gel
agarose, maka semakin cepat
migrasi fragmen DNA
Gel Poliakrilamida Gel pati (starch)
• Resolusi pemisahan DNA lebih •Sebagian tepung kentang terhidrolisis
tinggi jika dibandingkan dengan menjadi media non toksik lainnya
agarose sehingga panjang untuk elektroforesis protein.
molekul DNA yang berbeda hanya
satu nukleotida dapat dideteksi •Gel sedikit lebih buram daripada
akrilamida atau agarosa
•kekuatan pemisahannya sangat
besar sehingga dapat •Mereka divisualisasikan menggunakan
memisahkan 1 pb dalam 500 pb pewarnaan Napthal Black atau Amido
Black
•Konsentrasi gel pati khas adalah 5˗10%
11
 Pembuatan gel agarose
1. Tentukan konsentrasi atau presentase agarose yang 1. Tempatkan 4 gram agarose ke dalam labu erlenmeyer
dibutuhkan dan hal ini tergantung dari ukuran fragmen dan isi dengan larutan 1X Buffer TAE sampai volume
DNA yang dianalisis. Presentase gel agarose yang 200ml, kemudian kocok sampai merata.
direkomendasikan, adalah sebagai berikut:
2. Panaskan dalam microwave sampai mendidih sampai
• 0,5% agarose untuk fragmen DNA berukuran 1000- larutan menjadi jernih.
30.000pb
3. Didinginkan agarose kira-kira sampai 600C dan
• 0,7% agarose untuk fragmen DNA berukuran 800-12.000pb
tambahkan 5µl ethidium bromide (10mg/ml) dan
• 1,5% agarose untuk fragmen DNA berukuran 200-3.000pb
campur hingga merata.
• 2,0% agarose untik fragmen DNA berukuran 50-20.000pb
4. Setelah itu larutan dituang ke dalam tray dan
2. Pilih tipe agarose yang digunakan. Kebanyakan tipe pasang well-forming combs, tunggu kurang lebih 30
yang digunakan adalah standart agarose. Misalnya menit atau sampai gel mengeras. Lepaskan well-forming
telah ditentukan akan dibuat 2% gel agarose dalam combs secara perlahan-lahan dan gel agarose siap
volume 200 ml 1x buffer TAE, maka jumlah agarose
digunakan untuk elektroforesis
yang akan ditimbang yaitu: 2 gram/100ml x 200ml=4
gram.

12
Jenis Pewarna pada Elektroforesis

Pewarnaan Etidium bromide (EtBr)

• EtBr mampu berinteraksi diantara
pasang basa nukleotida pada
struktur double heliks dan saat gel
hasil elektroforesis disinari dengan
UV maka fragmen DNA yang telah
terpisah tampak sebagai band
berwarna jingga
SYBR Green, GelRed,
Methylene Blue, Cresyl Blue
yang Brilian, Nile Blue
Sulphate, dan Crystal Violet.
• Lebih aman dari EtBr

• Penting untuk dicatat bahwa

Etidium Bromida bersifat mutagenik
dan toksik, sehingga senyawa ini
harus diperlakukan dengan sangat
hati-hati.
• EtBr dapat ditambahkan pada gel
atau pada buf elektroforesis
sebelum atau sesudah elektroforesis

13
Buffer yang digunakan untuk elektroforesis
• Buffer dalam elektroforesis gel digunakan untuk
menyediakan ion yang membawa arus dan untuk
mempertahankan pH pada nilai yang relatif konstan.
Buffer ini memiliki banyak ion didalamnya, yang
diperlukan untuk mengalirkan listrik.
• beberapa buffer yang umum digunakan adalah asam
nukleat Tris / Acetate / EDTA (TAE), Tris / Borate / EDTA
(TBE)
Tris / Acetate / EDTA (TAE)
• TAE adalah buffer yang memberikan resolusi yang lebih
baik daripada fragmen >4 kb, tegangan untuk buffer TAE
adalah 5 sampai 50 V/cm dibandingkan dengan 10
V/cm
• Buffer TAE dibuat dari 20 mM Tris Acetate dengan 1 mM
EDTA ph 8,0
Tris / Borat/ EDTA (TBE)
• TBE memberikan resolusi yang lebih baik o,1 fragmen 3
kb (300 pb pada gel agarose 2%)
14
Pembacaan elektroforegram

15
TERIMAKASIH

16
PERTANYAAN
• Ghaitsa : selain buffer TAE atau TBE
• Auliya : mengapa pewarnaa EtBr yang sering digunakan?
• Utami : perbedaan kedua teknik elektroforesis
• There : manfaat eletroforesis gel
• Linanda : sifat sifat agarose
• Ernita : perbedaan 3 media elektroforesis gel
• Ajeng ayu : kelebihan dan kekurangan elektroforesis gel
agarose
• Annisa : pewarnaan komersial lain harus dilihat dibawah
sinar UV?
• Mellan : panjang gelombang UV yang digunakan harus
brp?
• Prinsip pewarnaan ?
JAWAB
• Ghaitsa :Lithium borat (LB) namu jarang digunakan
• Ernita : gel agarose untuk fragmen DNA yang besar (>100pb),
pliakrilamin untuk fragmen DNA kecil (<100pb)
• Ajeng : mudah dan sederhana, pemisahan lebih cepat,
preparasi lebih aman namun mudah rusak
• Theresia : memperkirakan ukuran fragmen DNA (dengan
membandingkan sampel dengan ukuran markernya), diagnosis
genetika molekuler atau sidik jari, genetik melalui analisis PCR,
memungkinkan pemurnian fragmen DNA
• Utami : larutan : langsung menggunakan larutan penyangga
sedangkan e.daerah menggunakan media yang berisi larutan
penyangga
• Mellan : EtBr panjang gelombang 302 /312 nm
• Linanda : suhu 35 sampai 42 celcius , ukuran volume besar,
polimer agarose mengandung gugus piruvat dan sulfat
• auliya: EtBr sering digunakan karena dapat menunjukan dengan
jelas hasil , pewarna komersial bisa digunakan namun intensitas
kurang, bisa dilihat dengan mata langsung tanpa bantuan UV.
Karena pewarnaan EtBr digunakan berdasarkan prinsipnya
(pada range pb)
• Yang penting dapat berinterkalasi ke dalam basa basa nitrogen
yang ada di DNA 17
18