Genetic Analysis of a Unique

Bacteriocin, Smb, Produced

by Streptococcus mutans
GS5

Presented By : Akri Sanjani

 Introduction

DENTAL CARIES

Infection Diseases by
Multiple Spesies
Bacteria

Elaborate Antimicrobial
Ex : Mutacins
Streptococcus mutans
Bacteriosin
In This Research

Tn 916 Bakteri Gram Positif  Mempengaruhi

Mutagenesis kegiatan fisiologis
(Smb)

Single Spesific Melibatkan 5 gen pengkodean o/ comAB

Primer PCR dan comCDE (com Box ; TACGAATA)

cilA/ssb2 (rantai tunggal), cilB/dprA,

Other Gen cilC/ccl (bacillus substils), cilD/clg,
Spesifik cilE/celAB and coi
 Variable
Bacterial strains and Karakterisasi Tn916 Insertion
plasmid

Analysis Transkription
Ekstrak RNA
and Sequence

Uji Plate Agar Construction Smb Mutans

 Methods
Persiapan Bacteria dan Plasmid Bacteri yang di gunakan  S. mutans
GS5 Bacteriosin Smb. RP66 as Indicator
untuk aktivitas Smb S.mutans GS5

Media Todd-Hewitt (TH) +

10 g erythromycin dan 3 g tetrasiklin

Semua dalam kondisi anaerob.

( 85% N2, 10% CO2 dan 5% H2
 Methods
Dilakukan pengenceran 1 : 100
Uji Agar Miring -: 0.2 ml pengenceran + 4 ml trypticase soy broth

Kultur

Inkubasi 37 ℃ 24-48 jam

Inkubasi 37 ℃ 24 jam
Uji Sensitifitas
dalam
kepadatan
optic 0,2 (550
nm)
 Methods
Karakterisasi Tn916 Insertion

+  Ligasi pUC19
DNA S.mutans GS5
Isolasi
(Include Transposon)

Transposon Origin Chromosome

to Enterococcus faecalis
Homologi dan Perban-
Amplifikasi (PCR) Dingan comfirm with
FASTA and BLAST
 Methods
Construction of Smb Mutants

smbA-smbB
smbM1 smbA smbB Homolog rekombinan

Amplifikasi PCR dilakukan dengan

primer dari GS5 dan plasmid Methode analisys untuk konfirmasi
pResEmMCS10 (incl Erm insert plasmid  Southern Blott
Cassette) (PCR)
Dan restriksi dengna BamH1
 Pellet di resuspensi in 20µl
diethylpyrocarbonate
+ 0.5 ml kloroform
Ekstraksi RNA

12.000 rpm 5 mnt (4℃)

+ 0.2 ml kloroform
Kec. 6,0 in
30 detik

+ 0.9 ml TRIzol
0.3 ml diethylpyrocarbonate
Sentrifuge

15 ml sampel
Methods
 Methods
Trancription Analysis (norther Blot -; RT-PCR)

Gel dicuci 2x dg 20 SSC Blotting semalam  ficed

(0.15 M NaCl + 0,015 M
NaSO4)  15 mnt 3 4 deng UV Cross-linking

Elektroforesis dalam Dilakukan Hibiridisasi

agarose 1 % (3% 2 5 dengan DIG easy hyb pada
foraldehid) 50℃

4.5 µl RNA x 15.5 µl buffer

+ 3.5 µl of 37% Formaldehide 1 6 Analisis dengan RT-PCR
+ 10 µl formamide
Didenaturasi 65℃ for 10 menit
 Result
Identification of Bacteriocin Gen Locus

Your Picture Here

Transforman Mutan Konfirmasi Insert Tn916 dengan SSP PCR
Wild type GS5

Hasil identifikasi awal dari

Kromosom E. faecalis yg Terminator
digunakan untuk mutagen-
asi S. Mutans GS5
Mutan H1
Sequence analysis gen bacteriosin GS5 yang di gambarkan
denga smb menunjukkan keberadaan sisipan pada ujung gen
Tn916

Namun smb locus tidak di temukan dalam database S.mutans

Bacteriosin dengan Fenotip Negative
UA159
(http: //www.genome.ou.edu.smutans.html) Akan tetapi ditemukan
bawa cyl dan Transporter ABC ditemukan berdekatan satu sama lain.
Dan gen cyl mengkode sistesis lucyl-tRNA sehingga dianggap dapat
menentukan batas hulu lokus gen smb S. GS5
 Result
Analysis Sequence smb locus dan gen homolog
Your Picture Here

• smbM1  Potensial ribosom binding

= AAGGG (6bp)  kofirm genbank di
kode 958 aa (identic dengan enzim
lantibiotik mersacidin & scnM)

- smbF (11 bp, dikode 274 aa homolog

dengn protein spaF dan MutF

- smbT (mengkode 243 aa 5 bp)

- smbM2 (876 aa = homolog dengan

salivaricin A dan enzim lantibiotik dan
tumpeng tindih 16 bp dengan smbG)
 Result
Inactive smb Gen and effect production smb
Your Picture Here
Konfirmasi efectifitas di
lakukan dengan membagi 2
gen individu dengan cassette
insertion  menghasilkan 3
mutan :
- GS5SmbAEm (H2A)
- GS5SmbBEm (H2B)
- GS5SmbABEm(h2AB)

Uji lain juga menujukkan

Uji Smb Production di lakukan pelemahan dalam produks
dengan RP66. bacteriosin
Hasilnya menunjukkan
sensiitivitas untuk semua S.
mutan.

Hal ini di tunjukkna dengan

pengaruh nyata dapat
melemahkan kemampuan
penghambatan indicator RP66
strain GS5
 Result
Analysis Transcription smb Operon
Untuk menentukan jumlah unit Your Picture Here
transkripsi dilakukan dengan Northen
Blot dan RT-PCR pada GS5 Wild Type

Namun Hasil transkripsi operon smb

unsuccesfull, dan pengulangan x RNA
juga tidak berhasil (data journal tidak di
tampilkan)

Kegagalan ini diduga dalam pengkodea

mRNA smbM1 untuk smbG/smbB
ditranskripsikan bersamaan dan ukuran
menjadi terlalu bersar untuk analysis
northen blot.

Dalam uji lanjut di temukan bahwa

penyandian mRNA smbM1 serupa
dengan smbF yang ditranskripsikan
dengan SmbT  smbA
 Result
Pengaruh CSP dalam Transkripsi smbA dan smbB
Your Picture Here
Penambahan CSP diketahui dapat merestore produksi
smb dengan coculture sample. comC
 Hal ini menunjukan bahwa mutan H2AB, H2M1, dan
H2P melengkapi mutan comC dalam CSP untuk produksi
bakteriosin.

Konfirmasi dengan RT-PCR

Didapat bahwa ekspresi transkripsi

smbA dan smbB tampak lebih lemah
pada mutan comC dari S.GS5 dg
analisis yg sama
 Result
Lanjutan CSP…
Sebagian besan gen induksi CSP pada Your Picture Here
S. mutan memiliki urutan com box
(TACGAATA) pada daerah promotor

a. Menunjukkan promotor smbA

memiliki regulasi pada saat kompeten
sel. Dan pada smbM1 yang
mengandung insert mutan H1 sangat
homolog dengan gen comC (2 sekuen
yang sangat terikat {93% identity})

Kegagalan ini diduga dalam pengkodea

mRNA smbM1 untuk smbG/smbB
ditranskripsikan bersamaan dan ukuran
menjadi terlalu bersar untuk analysis
northen blot.

Dalam uji lanjut di temukan bahwa

penyandian mRNA smbM1 serupa
dengan smbF yang ditranskripsikan
dengan SmbT  smbA
Thank you