(High Performance Liquid Chromatography)

KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

 Hampir 20 % senyawa yang diketahui tidak dapat dianalisis dengan
Kromatografi Gas dengan berbagai alasan antara lain;
• Tidak mudah menguap (insufficiently volatile)
• Tidak dapat melewati kolom
• Tidak tahan panas (Thermally unstable)
• Terurai dalam kondisi saat pemisahan dengan GC.

Penggunaan HPLC tidak terbatas untuk senyawa yang mudah

menguap, tetapi juga mampu memisahkan makromolekul dan
jenis-jenis ion, senyawa alami yang labil, material polimer,
dan berbagai senyawa dengan BM besar yang mempunyai
banyak gugus fungsi dan dapat digabungkan dengan
Spektrofotometer Infra Red (IR) dan Spektrometri Massa
(MS)
 Prinsip kromatografi
 Pemisahan.
 Memisahkan gabungan komponen – komponen yang terdapat dalam suatu
senyawa / sample, sehingga menjadi komponen-komponen tunggalnya.

A B C D

Pemisahan bisa terjadi karena adanya interaksi [polar dan nonpolar, ionik,
besaran partikel] antara Fasa Gerak, Fasa Diam, dan komponen itu sendiri.
Jika beberapa komponen tersebut lebih kuat interaksinya dengan fasa gerak dan
beberapa komponen lainnya lebih tertarik dengan fasa diamnya, maka
pemisahan dapat terjadi, di mana komponen – komponen yang lebih kuat
interaksinya dengan fasa gerak akan terelusi lebih dahulu / lebih cepat, sehingga
waktu tambat yang dibutuhkan untuk melewati sistem [waktu retensi] akan
lebih cepat dibanding komponen – komponen yang interaksinya lebih kuat
dengan fasa diamnya.
Fasa gerak lebih non- Fasa gerak lebih polar
polar dibandingkan fasa dibandingkan fasa
diamnya. Ex : Hexane, diamnya.
petroleum benzene Ex : MeOH, ACN, Air.
Fasa Diamnya lebih Fasa Diamnya lebih non-
polar dibandingkan fasa polar dibandingkan fasa
geraknya. Ex : Silika, geraknya.
Diol Ex: C-18, C-8, C4, NH2,
 High cost operation. CN
Sistem awal. Lower cost operation.
Merupakan
perkembangan sistem
awal.
 Mekanisme adsorpsi fasa normal

Fasa diam Sample Fasa gerak

Polar Non-polar

-Si-OH
-Si-OH Polar Non-polar -C-C-C-C-C-C-
-Si-OH

Arah aliran fasa gerak

-OH Awal
Polar
-OH
-OH A A
-OH B B
-OH
-OH C C
-OH
Non-polar
Mekanisme adsorpsi fasa balik (reverse)

Fasa diam Sample Fasa gerak

Non-polar Polar

-Si-O-(CH2)17-CH3
H
-Si-O-(CH2)17-CH3 Non-polar Polar O
-Si-O-(CH2)17-CH3
H
Arah aliran fasa gerak
-CH3 Awal
Non-polar
-CH3
-CH3 A A
-CH3 B B
-CH3
-CH3 C C
-CH3
Polar
 Silika Derivatisasi Silika

O O O O O O
| | | | | |
OSiOSiOSiOH OSiOSiOSiOR R = C18H37
| | | | | |
O O O O O O (octadecylsilyl
| | | | | | silica “C18”)
OSiOSiOSiOH OSiOSiOSiOR
| | | | | |
O O O O O O

bulk (SiO2)x surface bulk (SiO2)x surface

“normal phase” “reversed phase”

 Sistem HPLC
1. Isokratik (ratio fasa gerak yang digunakan konstan/tetap selama running
analisis)
2. Gradient (ratio fasa gerak yang digunakan dapat berubah-ubah selama
running analisis, diatur melalui sistem dengan bantuan mikroprosesor)

R B 100 % R B 100 %
a a
t t
i i
o o

P P
e e
l l
a a
r r
u u
t t

A 100 % A 100 % Waktu Retensi

Waktu Retensi

 Sistem tidak mampu melakukan
pencampuran fasa gerak secara
online [pencampuran di luar
sistem].
Pada pemakaiannya komposisi
fasa gerak tidak bisa diprogram fasa gerak bisa diprogram
untuk berubah secara otomatis
selama proses running [tidak
bisa menggunakan time
program].
Tidak efisien untuk riset, dan
pengembangan metode.
 Low Price.
 Sistem mampu melakukan
pencampuran fasa gerak secara
online [pencampuran di dalam
sistem].
Pada pemakaiannya komposisi
untuk berubah secara otomatis
selama proses running
[menggunakan time program].
Sangat efisien untuk riset, dan
pengembangan metode.
High Price .
 HPLC Gradient

 Cukup dengan satu pompa saja  Membutuhkan lebih dari satu

[LC-20AD/AT] mampu menarik lebih pompa [LC-20AD/AT/20AB],
dari satu fasa gerak secara
bergantian.
 Membutuhkan tambahan LPGE Unit
[switch valve low pressure
gradient], di shimadzu mampu
menarik 4 fasa gerak terpisah.
 Membutuhkan Degasser online
[DGU-20A5].
 Membutuhkan mixer.
 Kemampuan gradient fasa gerak
hanya teruji sampai 90% :10%.
Untuk perbandingan yang ekstrim
[99% : 1%] kurang baik.
 Sistem gradient low price.
minimal 2 pompa [untuk 2 jenis
fasa gerak terpisah]. Mampu
menarik lebih dari satu fasa
gerak secara bersamaan.
 Membutuhkan Degasser online
[DGU-20A3].
 Membutuhkan mixer.
 Kemampuan gradient fasa gerak
cukup baik bahkan untuk
perbandingan yang ekstrim [99%
: 1%] sekalipun.
 Sistem gradient high price.
Low dan High Pressure:
Terkait dengan kinerja Pompa dan
Kolom yang digunakan
 SISTEM KCKT

Kolom Detektor

Integrator

Injektor
Fase Pompa
gerak
HPLC with Autosampler
 Auto Injektor
Sampel
injektor
Valve
Fase Gerak

Detektor
Pompa B
Pompa A
Kolom

Buangan Fraksi Kolektor

Mixer
Valve
Degasser
High Pressure Pump Purging Pump
 1. isokratik
fasa gerak
2. gradient

1. Piston tunggal
Pompa
2. Piston ganda

1. 0.1 – 1.0 L (analitik)

Injektor
2. 500 L - 5 ml (preparatif)

1. Prekolom
Kolom
2. Standard

 Detektor Ultraviolet / Visible

(UV/VIS)
 Detektor Photodiode Array
(PDA)
 Detektor Fluorescence (RF)
 Detektor Konduktivitas (CDD)
Detektor  Detektor Refraktive Indeks (RID)
 Detektor Elektrokimia (ECD)
 Detektor spektrometer massa
(Tandem)
 Fase Gerak
Fungsi membawa analit untuk masuk dan keluar dari kolom.

Pertimbangan pada pemilihan fase gerak, antara lain:

1. Sifat dan polaritas analit/sampel
2. Polaritas pelarut
Pelarut Polar
Air > Metanol > Asetonitril > Etanol > Oxydipropionitrile
 
Pelarut Non-polar
n-Dekan > n-Heksan > n-Pentan > Siklohexan
Syarat fasa gerak HPLC

• Inner Tidak bereaksi baik dengan bahan kolom dan

senyawa yang akan dipisahkan
• Harus p.a (pro analysis) atau HPLC grade
• Mempunyai viskositas yang rendah
• Homogenous dengan pelarut lainnya
• Tidak mempunyai pengaruh terhadap sistem
detektor
• Tidak korosif
• Tidak explosif baik akibat pemanasan maupun
tekanan
 POMPA
Berfungsi untuk mengalirkan fase gerak ke dalam kolom.
Pompa yang digunakan harus memenuhi beberapa
persyaratan, antara lain:
1. Dapat memompakan fase gerak secara konstan (0,1 –10
ml/menit)
2. Dapat memberikan tekanan yan cukup tinggi
3. Memberikan fluktuasi tekanan yang cukup tinggi
4. Memberikan ganguan (derau) yang rendah
5. Cara kerja sederhana
6. Cukup lembam terhadap pelarut-pelerut yang umum
digunakan
 Injektor
berfungsi untuk memasukkan cuplikan ke dalam kolom.
Injektor pada HPLC terdiri atas injektor septum dan
autoinjektor.
 Sistem sampel loop injektor

posisi load Posisi inject

pompa kolom pompa kolom

sampel loop
 KOLOM

merupakan jantung dari KCKT yang berfungsi untuk memisahkan

masing-masing komponen.

Kolom dapat dibagi atas 2 kelompok, antara lain:

Kolom Analitik: diameter dalam 2-6mm, panjang kolom

tergantung pada jenis material pengisi kolom.
- Untuk kemasan pellicular, panjang yang
digunakan adalah 50-100cm.
- Untuk kemasan Mikropartikulat, panjang 10-
30cm. Dewasa ini ada yang hanya 5 cm

Kolom Preparatif: umumnya memiliki diameter 6mm atau

lebih besar dan panjang kolom 25-100cm.
Jenis-jenis kolom HPLC

N0 Nama kolom Jenis adsorban

1 Ultrasil-Si SiO2 (silika)
2 Ultrasil-octyl Octana (C8)
3 Ultrasil-ODS Octadecana (C-18)
4 LiChrosorb Si SiO2 (silika)
5 LiChrosorb RP-2 Etana (C-2)
6 LiChrosorb RP-8 Octana (C8)
7 LiChrosorb RP-18 Octadecana (C-18)
8 LiChrosorb NH2 Amina
9 LiChrosorb CN Cyano
• Panjang 10-25 cm dan diameter 4,5-5,0 mm yg
diisi dg fase stationer berukuran rata-rata 5-
10mm dr bahan stainless steel
Pertimbangan pemilihan Kolom, antara lain:
1.Sifat analit
2.Isi Kolom
3.Efisiensi Kolom
4.Panjang Kolom
5.Diameter kolom
6.Tekanan dalam Kolom
7.Informasi dari pustaka,kolega dan produsen

24
Guard Colomn Colomn Tubing
 Mekanisme pemisahan pada Kolom

A dan B mulai terpisah

Fasa gerak

Sampel A dan B
Fasa diam

Kolom

Fasa gerak
ke detektor

A B
Waktu retensi (min)
Sinyal pada rekorder
1. Teoritical Plates [umumnya minimal 2000]
2. Tailing Factor [umumnya maksimal 1.5]
3. Resolusi [umumnya minimal 1.5]
4. Faktor Kapasitas [umumnya bergantung pada masing-
masing rule]
5. Efisiensi Kolom [HETP merupakan jarak antara plat-
plat teoritis]
Nilai-nilai dari parameter di atas harus memenuhi persyaratan dari standard masing
masing acuan rule yang digunakan. Misal untuk farmasi acuan pada CPOB, BPOM, FDA,
dsb.
 Detektor

Pertimbangan pemilihan detektor, antara lain:

1. Sensitivitas
2. Linieritas
3. Reprodusibel
4. Mudah dioperasikan
5. Mudah perawatan
 Jenis-jenis Detektor HPLC

Yang umum dipakai

 Detektor Ultraviolet / Visible (UV/VIS)
 Detektor Photodiode Array (PDA)
 Detektor Fluorescence (RF)
 Detektor Konduktivitas (CDD)
 Detektor Refraktive Indeks (RID)
 Detektor Elektrokimia (ECD)
 Detektor spektrometer massa
DETEKTOR SPEKTROFOTOMETER UV/VIS

Prinsip: penyerapan sebagian energi (hv) oleh molekul

pada panjang gelombang tertentu => tereksitasi elektronik

Eksitasi elektronik
kuvet

Ein Eout

l
Hk.Lambert-Beer
ACl= - log (Eout / Ein)
ACl= - log (Eout / Ein)
absorbansi

Kisaran linear
1

konsentrasi
Pemilihan panjang gelombang:
Kuantitatif / preparatif?

275 nm
208 nm

275 nm
208 nm
 Detektor Photodiode Array

• Dapat berfungsi sebagai detektor UV/Vis biasa

• Untuk menentukan impurities
• Identifikasi peak
• Penentuan spektrum pada Rt tertentu

Sample Cell Grating

satu elemen dapat
Mendeteksi absorban
D2 / W lamp Pada satu pjg gelb..

512 Elements Photodiode Array

 Detektor
Kuvet/sample photomultiplier
compartment/fl mendeteksi adanya
signal perubahan
ow cell tempat
Sumber
serapan
Monokromator untuk
[mengubah meletakkan/mel
cahaya cahaya ewatkan sample
polikromatis
[D2/W] menjadi cahaya
monokromatis]

Kuvet/sample
compartment/flow Monokromator
cell tempat untuk [mengubah cahaya Detektor photodiode array mendeteksi adanya
Sumber cahaya meletakkan/melewatk polikromatis menjadi signal perubahan serapan dari banyak panjang
[D2/W] cahaya monokromatis] gelombang
 Detektor Photodiode Array

 Puncak dapat di identifikasi dengan spektrum UV.

 Pemeriksaan kemurnian puncak dapat dilakukan.
--overlap 3 spektrum
--rasio kromatogram
--perbandingan threshold dan similarity index.
Hasil Scaning PDA Detektor dalam
3D

37
Hasil Ekstraksi dari Detektor PDA

Hasil Spektrum

Hasil
Kromatrogram
pada 254 nm

38
 Detektor Spektrofluoresen

Excitation Wavelength

+ h1 *
* h2+
A* Emission Wavelength
h1 h2
Fluorescence
A A
Kuvet/sample
Sumber cahaya
compartment/flow cell tempat
[Xenon]
untuk
Monokromator [mengubah
meletakkan/melewatkan
cahaya polikromatis menjadi
sample
cahaya monokromatis]

Monokromator
[mengubah cahaya
polikromatis menjadi
cahaya monokromatis]
Detektor photomultiplier
mendeteksi adanya
signal perubahan
serapan
Rancangan Cell untuk detektor Fluorescence
 Reagen derivatisasi

Reagen OPA untuk amine primer

A
CHO
+ R-NH2 N-R
CHO A
o-phthalaldhyde
(OPA)
Reagen ADAM untuk asam lemak
+ R-COOH
CHN2 CH2OCOR
9-anthryldiazomethane
(ADAM)
 Detektor Refraktive Indeks

Sistem optik
 Kuvet/reference
compartment/flow cell
tempat untuk
meletakkan/melewatk
an reference
[reference side]

Miror
pemantul
cahaya
reference
Miror
pembagi
Sumber cahaya [W2] cahaya
Detektor silicon
photocell mendeteksi
adanya perubahan
sudut sinar.
Miror
Kuvet/ sample pemantul
compartment/ cahaya
flow cell sample
tempat untuk
meletakkan/m
elewatkan
sample
[Sample side]
Detektor Refraktive Indeks
 Detektor Konduktifitas
Konduktifitas sangat dipengaruhi temperatur.
Cell harus diletakkan pada kondisi temperatur terkontrol

K (conductivity) = I [A] / E [V]

V =A [cm2] / L [cm] * k
I (k : specific conductivity)

k= (I/E)*(L/A)
A A

L elektroda
Perbandingan detektor
UV/ VIS RF RID CDD ECD
LOD 10 ppb 10 ppt 100 ppb 10 ppb 100 ppt
GC Yes Yes No No No

LOD : Limit deteksi (S/N=3)

GC : Gradient Compatibility
Integrator, berfungsi mengubah
sinyal kromatografi menjadi
bentuk angka secara otomatis
dan sangat tepat

Recorder, untuk mencatat sinyal

yang ditangkap oleh detektor
 Kromatogram HPLC
Absorbance 

Peak A Peak B

height

0 1 2 3 4 5 6 7
Time (minutes) base

Rt = 3.0 min. Rt = 5.2 min.

faster moving slower moving base x height
Area =
less retained more retained 2
 Analisis Analit dengan HPLC
• Pemisahan analit pada sampel terjadi karena
interaksi [polar dan nonpolar, ionik, besaran
partikel] antara Fasa Gerak, Fasa Diam
• Untuk menganalisis analit dan atau metabolit dari
sampel menggunakan HPLC sangat ditentukan oleh
sifat fisikokimia dari analit dan metabolit tersebut.
• Sifat fisikokimia analit akan menentukan fase gerak
dan fase diam yang digunakan, jenis detektor yang
dipakai, sistem iskratik atau gradient dll.
Metoda terpilih kromatografi
Low polarity Normal phase
Non-polar mobile phase
Non-Ionic
Medium & high
polarity Reverse phase
BM < 2000
Aqueous mobile phase

Acidic
Ionic Anion exchange/ion pair

Basic
Sample Cation exchange/ion pair

Water soluble Steric exclution

Aqueous mobile phase
BM > 2000

Water insoluble Steric exclution

Nonaqueous mobile phase
Tahapan dalam Pengembangan Metode
KCKT
• Informasi penting menyangkut komposisi dan
karakteristik sampel
• Jumlah senyawa yang ada
• Struktur kimia
• Berat molekul senyawa
• Nilai pKa
• Spektrum UV
• Rentang konsentrasi analit dalam sampel
• Kelarutan
• dll
• Merupakan ukuran apakah seuatu senyawa terpisah
secara baik atau tidak dengan senyawa lain
• R >1,5
Resolution for complete
separation
Ratio of Overlapping Area
Resolution is a function of
Capacity Factor, k’
 Nilai yang menunjukkan seberapa
baik sistem kromatografi dapat
memisahkan dua komponen
Nilai yang menunjukkan jumlah piringan toritis (Theoritical Plate) dari kolom
yang digunakan dalam sistem HPLC
• Equation
N = 16 x (Rt/W)2

• Modified equation for

actual measurement
N = 5,54 x (Rt/W1/2)2

• Modified equation for

integrator
N = 6,28 x (Rt x H/Area)2

63
Contoh Perhitungan N
 Cara pemisahan komponen zat
dalam sampel
1. Menggunakan buffer
• For samples that contain acidic or basic
compounds, retention time vary with pH
R-COO- and R-NH3+

• Adjusting pH of mobile phase is very important to

get good repeatability
• Buffer solution must be selected correctly
Hubungan antara k’ dan
pH
• Nilai k’ asam organik dan amin
bervariasi tergantung pH fase gerak

Pada rentang pKa +/- 1,5,

terdapat hubungan linear
antara k’ dan pH

66
 Precaution of pH
Adjustment
• Ketika pH fase gerak sangat dekat dengan pKa
analit, adjustment pH harus sangat hati2, karena
pH fase gerak akan mempengaruhi k’
• Normalnya dipilih pH yang tidak mempengaruhi k’

67
Relationship between pH and pKa of
Buffer solution

68
pKa of organic acid for
buffer
Phosphate buffer Acetate buffer Citrate buffer

(conc. Unit: mM)

69
Efek pH fase gerak pada
pemisahan senyawa ionic
1: asam benzoat
2: asam sorbat
3: metilparaben

[analytical conditons]
1 mL/min
Kolom ODS
Dapar fosfat 10 mM 75%
ACN 25%
400C
UV-240 nm

70
 Cara pemisahan komponen zat
dalam sampel
2. penambahan ion pair/ pasangan ion
a). Pasangan ion basa
Contoh: Na.heptan sulfonat;Na.heksan sulfonat; Na.oktan
sulfonate.
Cara Kerja:
Perlunya didapar dengan pH 2,5-4 :
Digunakan utk senyawa² yg memiliki gugus N pada
molekulnya, contoh; piridin, pirimidin, adenin, guanin.
 Cara pemisahan komponen zat
dalam sampel
2. penambahan ion pair/ pasangan ion
b). pasangan ion asam
Contohnya: Tetrabutilamin
Digunakan utk senyawa yg memiliki gugus karboksilat,
seperti campura asam salisilat dan asam benzoate. pH
larutan sekitar 6-8, agar karvoksilat bisa terion dan
dapat terikat oleh ion positif tetrabutilamin, sehingga
terjadi pemisahan.
 Cara pemisahan komponen zat
dalam sampel
2. penambahan ion pair/ pasangan ion
c). Ion kromatografi, digunakan detektor uv-vis atau
konduktivitas, serta kolom resin anion atau kation.
Untuk memisahkan anion; F, Cl, Br, I, SO4, Nitrat,
Nitrit, asetat, laktat, propionat, fumarate.
Untuk memisahkan kation²; K, Na, Ca, Mg, Al, Zn,
Ferro’, Ferri.
 Cara pemisahan komponen zat
dalam sampel
3. Derivatisasi
Dilakukan utk senyawa² yang tidak memiliki gugus
kromofor, produk hasil derivatisasi berupa senyawa yg
dapat berfluorescensi.
Contoh;
1.Asam amino + OPA/2-MeEtanol.
2.Asam² lemak dengan asetilklorida + metanol--->
senyawa metilnya yang lebih non polar/lebih mudah
menguap.
 Optimasi Solvent
Komponen Sampel:

Nitrobenzen
Benzen
2,6-Dinitrotoluen
2-Nitrotoluen
4-Nitrotoluen
3-Nitrotoluen
Toluen
2-Nitro-1,3-xylene
4-Nitro-1,3Xylene
m-Xylene

75
 Perubahan Fase Gerak

Although one organic solvent can not provide good resolution, 3

combination of mobile phase has a possibility to provide good resolution,
if critical pair of resolution has been changed

76
Effect of Packing material Characteristics on
Separation

1: asam benzoat
2: asam sorbat
3: metilparaben

[analytical conditons]
1 mL/min
Dapar fosfat 10 mM 75%
ACN 25%
400C
UV-240 nm

77
 Penambahan Pelarut Organik Lain

• Addition of co-solvent besides methanol, acetronitrile

and THF is sometimes effective to get better separation

Etil eter
Isopropil eter
Dioksan
Dimetoksietana
Sikloheksana oksida
Around 10% can be
added to normal
mobile phase for
reversed phase mode

78