HPLC

Pendahuluan
KCKT atau HPLC merupakan suatu teknik
kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa
diamnya berupa cairan atau padat. Ciri teknik ini
adalah penggunaan tekanan tinggi untuk
mengirim fase gerak ke dalam kolom.

Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan

setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya
diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa
konsentrasi dari masing-masing komponen
tersebut (kuantitatif)
Komponen HPLC
 Kolom HPLC
Kolom adalah tabung yang dikalibrasi lurus yang panjangnya antara 3
dan 15 cm dan pada dinding bagian dalam kadang-kadang dilapisi
dengan material inert seperti kaca atau PEEKÂ ®. Kolom bisa terbuat
dari sejenis plastik disebut cartridge, atau terbuat dari stainless steel.

Kolom pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(KCKT/HPLC) merupakan bagian yang sangat penting,
sebab pemisahan komponen-komponen sampel akan
terjadi di dalam kolom.
Pemilihan kolom merupakan langkah yang pertama
dan utama untuk penggunaan kromatografi. Ketepatan dalam
pemilihan kolom sangat berpengaruh terhadap performan
kromatogram Oleh karena itu ada beberapa hal yang harus
diperhatikan, yaitu:
1. Pemilihan kolom yang sesuai
2. Pemeliharaan kolom
3.Uji terhadap spesifikasi kolom (walaupun kolom tersebut merupakan
kolom yang siap dipakai).
Jenis-jenis kolom HPLC
Konvensional

Ditinjau dari
Kolom HPLC Microbore ukurannya
(panjang dan

diameternya)
High Speed
Jenis-jenis Kolom
Jenis-jenis kolom HPLC

Kolom Fase
Normal
Dilihat dari jenis
Kolom HPLC fasa diam dan
fasa geraknya

Kolom Fase
Terbalik
Fase Diam Kolom
 Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika
yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak
dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan
divinil benzen.

 Dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya, maka

kolom HPLC dibedakan atas Kolom Fasa Normal
dan Kolom Fasa Terbalik (Reversed Phase
Column).
Kolom Fasa Normal
Kromatografi dengan kolom konvensional mempunyai
fasa diam normal yang bersifat polar, misalnya silika
gel. Sedangkan fasa geraknya bersifat non polar,
sehingga analit yang akan dipisahkan adalah analit
yang bersifat non polar.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui
kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar
dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh
karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan
lebih cepat melewati kolom.
Kolom Fase Terbalik
 Kolom fasa terbalik adalah kolom yang
fasa diamnya bersifat non polar, sedangkan
fasa geraknya bersifat polar, kebalikan dari
fasa normal.
Pemilihan Kolom
 Ada beberapa cara yang dapat digunakan yaitu :
1. Tetapkan Tujuan Pemisahan Anda. Tentukan apakah
aplikasi Anda membutuhkan resolusi tinggi, waktu
analisis singkat,maksimum sensitivitas, waktu hidup
kolom yang panjang, biaya operasi yang rendah, atau
faktor penting lainnya.
2. Menyamakan kolom yang digunakan untuk analit lain
yang serupa
3. Mendapatkan informasi dari pustaka
 Mekanisme Kerja di Dalam
Kolom
Didalam kolom terjadi pemisahan
kompenen- komponen campuran karena
perbedaan kekuatan interaksi antara solut-
solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang
kurang kuat interaksinya dengan fasa diam
akan keluar dari kolom terlebih dahulu,
sebaliknya solut- solut yang kuat
interaksinya dengan fasa diam akan keluar
dari kolom lebih lama
Penggunaan Kolom
Banyak faktor harus diperhatikan di
menggunakan kolom, agar kolom dapat dalam
Dengan baik dalam waktuyang relative panjang. berfungsi
Faktor- faktor yang harus diperhatikan tersebut
seperti:
1. Kualitas Pelarut
2. Larutan Pencuci Kolom
3. Pelarut untuk menyimpan kolom
4. Penggunaan pre coloum
Hal-hal lain yang perlu diperhatikan yaitu pengeluaran
gas (‘de-gas’) dengan menarik gelembung udara dari
dalam media dengan menggunakan peralatan pompa
vakum.
 Pelarut untuk menyimpan
kolom
Umumnya jenis pelarut yang digunakan untuk
menyimapan kolom harus disesuaikan dengan jenis
kolomnya. Sebagai contoh :
1. Kolom penukar ion disimpan dalam metanol atau air. Metanol
lebih disukai karena dapat mencegah pertumbuhan bakteri.
2. Kolom fasa terikat tak polar disimpan dalam metanol. Asetonitril
tidak dianjurkan untuk dipakai di sini karena selain harganya
mahal, asetonitril ini dapat terurai membentuk pengotor pada
kolom.
3. Kolom fasa terikat polar disimpan dalam heptana atau metanol.
4. Kolom silika disimpan dalam heptana.
Di dalam penyimpanannya jangan sekali-kali kolom
dibiarkan kering. Pada kolom yang kering dapat
terjadi kekosongan karena paking kolom dapat
mengkerut dari dinding kolom atau karena pengerutan
paking kolom itu sendiri.
Precolumn
Untuk memperpanjang umur kolom, seringkali didahului
oleh suatu precolumn atau penjaga kolom.
Kolom pengaman disebut juga pra-kolom karena
diletakkan sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom
ini berukuran pendek, 5 cm dengan diameter 4,6 mm
dan biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran
lebih besar dari ukuran partikel kolom utama.

Pre-colum dilengkapi dengan filter (saringan). Hal

tersebut penting untuk memperoleh hasil
pemisahan
sangat yang sempurna serta untuk menghindari
terjadinya penyumbatan (blocking) di dalam kolom
sehingga self life kolom lebih panjang dan melestarikan
kinerjanya..
Penutup

1. Kolom pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(KCKT/HPLC) merupakan bagian yang sangat
penting, sebab pemisahan komponen-komponen
sampel akan terjadi di dalam kolom.
2. Pemilihan kolom merupakan langkah yang
pertama dan utama untuk penggunaan kromatografi.
Ketepatan dalam pemilihan kolom sangat
berpengaruh terhadap performan kromatogram.
Mekanisme Kerja di Dalam
Kolom
TERIMA KASIH